双向凝胶电泳在临床血浆蛋白质组学研究中的技术难点和解决方法

随着双向电泳技术中固相化pH梯度的发明、电喷雾质谱、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术的应用,蛋白质组学技术已经越来越多的应用于疾病的研究中.临床蛋白质组学已经成为目前医学研究中的热点[1].血液标本因取材简便、应用价值高,因此血浆蛋白质组学最具有应用前景,并成为临床蛋白质组学研究中关注的重要问题.     

蛋白质组学实验技术研究进展

人类基因组计划已取得了巨大的成就，几个物种(包括人类)的基因组序列已经或即将完成，生命科学已实质性地跨入了后基因组时代，研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子水平对功能的研究上。这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学(functional genomics)这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。而第二个标志则是蛋白质组学的兴起。     

以双向凝胶电泳为基础的食管癌组织蛋白质组学分析新策略

目的：探讨采用双向电泳为基础的蛋白质组学的研究手段在食管癌组织与食管癌旁组织差异分析中的应用。方法：双向凝胶电泳分离食管癌及其癌旁组织的蛋白质，图像分析软件ImageMaster4．01分析所获得的凝胶图谱并寻找差异点，用质谱仪鉴定差异点蛋白质。结果：提出了一套可行的癌组织差异分析策略，并发现在分子量50 000-60 000，等电点5—6的区域，食管癌组织和食管癌旁组织存在2个差异表达的蛋白，质谱鉴定为丙酮酸激酶M2/M1。结论：在合理的策略指导下，以双向凝胶电泳为基础的蛋白质组学技术是研究肿瘤的一种重要手段，我们得到的丙酮酸激酶M2/M1在食管癌与其癌旁组织中存在差异表达，可能对食管癌的诊断、治疗具有重要意义。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化

目的建立稳定的人血清蛋白质组双向凝胶电泳（2-DE）技术体系,提高人血清蛋白2-DE图谱的分辨率和重复性。方法采用固相pH梯度（IPG）等电聚焦（IEF）为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳技术,对血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条选择、等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳程序及参数等进行了比较和优化。结果两样品经过3次重复,还原烷基化蛋白质斑点数（678±32）个,非还原烷基化蛋白质斑点数（358±26）个,还原烷基化分离较好,电泳图谱更清晰。结论还原烷基化处理能提高血清蛋白质2-DE的分辨率,该方法也可对其它蛋白质样品的制备和双向电泳提供借鉴作用。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化

目的 建立稳定的人血清蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术体系,提高人血清蛋白2-DE图谱的分辨率和重复性.方法 采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦(IEF)为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳技术,对血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条选择、等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳程序及参数等进行了比较和优化.结果 两样品经过3次重复,还原烷基化蛋白质斑点数(678±32)个,非还原烷基化蛋白质斑点数(358±26)个,还原烷基化分离较好,电泳图谱更清晰.结论 还原烷基化处理能提高血清蛋白质2-DE的分辨率,该方法也可对其它蛋白质样品的制备和双向电泳提供借鉴作用.     

中医证侯血浆蛋白质双向凝胶电泳方法的建立及优化

目的建立中医证侯血浆蛋白质双向凝胶电泳（2-DE）方法并对其进行优化。方法以正常人血浆样品为研究对象,对白蛋白/IgG球蛋白去除后血浆样品、全血浆和热SDS法全血浆样品进行pH梯度2-DE分离,凝胶经硝酸银染色后,利用PDQuest软件对2-DE图谱进行重复性分析,并对不同处理方法的全血浆2-DE图像的结果进行比较。结果与全血浆直接上样2-DE凝胶图谱比较,白蛋白/IgG球蛋白去除后血浆上样双向电泳蛋白有所增多,但由于白蛋白/IgG球蛋白去除过程中的非特异性吸附,造成了同一样品在蛋白质图谱上的明显差异;与全血浆直接上样和白蛋白/IgG球蛋白去除后血浆样品上样2-DE凝胶图谱比较,热SDS法处理血浆样品可以得到更多的蛋白质,且重复性好（P〈0.05）,凝胶硝酸银染色显示蛋白质点染色深、分散清楚。结论热SDS法全血浆上样2-DE分析法具有蛋白丢失少、操作简便、重复性好的特性,是证侯血浆蛋白质组学研究的有效手段。     

脑脊液蛋白质组学高丰度蛋白去除方法的建立与评价

目的建立和评价脑脊液蛋白质组学中高丰度蛋白的去除方法。方法使用Oasis HLB（hydrophilic—lipophilic balance）过滤柱。运用反相固相法，根据蛋白质不同的疏水性分馏脑脊液，去除高丰度蛋白和盐。将含有低丰度蛋白的过滤液冻干，利用双向凝胶电泳（2-DE）分析评价脑脊液蛋白层析去除高丰度蛋白的效果。结果通过Oasis HLB柱处理可将大部分高丰度蛋白去除。2-DE图谱中低丰度蛋白质分辨率明显增加，点数增多59．86％。结论本研究建立的脑脊液高丰度蛋白去除方法可有效地应用于疾病的脑脊液蛋白质组学研究。     

信号转导的功能蛋白质组学研究

随着人类基因组图谱的完成、蛋白质组学技术的飞速发展以及用于蛋白质鉴定的生物信息学的不断完善,蛋白质组学研究已经成为鉴定疾病相关标记和治疗靶点的有效工具。根据研究目的和研究手段的不同,蛋白质组学又分为表达蛋白质、结构蛋白质和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学研究细胞内表达的蛋白质种类,双向凝胶电泳是主要的研究方法。     

脑脊液蛋白质组学高丰度蛋白去除方法的建立与评价

目的 建立和评价脑脊液蛋白质组学中高丰度蛋白的去除方法.方法 使用Oasis HLB(hydrophilic-lipophilic balance)过滤柱,运用反相固相法,根据蛋白质不同的疏水性分馏脑脊液,去除高丰度蛋白和盐.将含有低丰度蛋白的过滤液冻干,利用双向凝胶电泳(2-DE)分析评价脑脊液蛋白层析去除高丰度蛋白的效果.结果 通过Oasis HLB柱处理可将大部分高丰度蛋白去除.2-DE图谱中低丰度蛋白质分辨率明显增加,点数增多59.86%.结论 本研究建立的脑脊液高丰度蛋白去除方法可有效地应用于疾病的脑脊液蛋白质组学研究.     

双向凝胶电泳脑脊液蛋白质提取方法的比较

 目的 对 3 种常用的双向凝胶电泳脑脊液蛋白质提取方法进行比较，优选脑脊液蛋白质提取方法。 方法 收集新诊断尚未经药物治疗的 16 例帕金森病患者和 7 例头痛患者的脑脊液，分别以 3 种不同的方法提取脑脊液中的蛋白质。①透析法：用 PluseOne 微透析试剂盒处理脑脊液样品。②丙酮沉淀法：以冷丙酮溶液处理脑脊液样品，丙酮的终浓度为 80%。③三氯醋酸（TCA）/丙酮沉淀法：以 4 倍体积的 10% TCA/丙酮溶液处理脑脊液样品，TCA 的终浓度为 8%，丙酮的终浓度为 80%。取沉淀物进行双向凝胶电泳，用银染法对电泳后的凝胶进行染色，比较经 3 种不同方法提取的脑脊液蛋白质的双向凝胶电泳图谱。 结果 经透析法处理样品的电泳图谱显示的蛋白点较清晰、较圆，条纹较少，但所见几乎都是高丰度蛋白，低丰度蛋白很难显现；经丙酮沉淀法处理样品的电泳图谱显示横竖条纹均较多，大部分蛋白堆积在凝胶的上部，下面的点也显示不清晰，蛋白点出现横向漂移；经 TCA/丙酮沉淀法处理样品的电泳图谱显示横条纹相对较少，低丰度蛋白能较清晰显现，样品中所含高丰度蛋白明显少于以上两种方法处理的样品。 结论 以 TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质进行双向凝胶电泳时聚焦效果较好，而且同时去除了大部分白蛋白，使低丰度蛋白能很好地显现出来，优于丙酮沉淀法和透析法。     

蛋白质组学研究技术及其联合应用

蛋白质组学是研究细胞、组织和器官内所有蛋白质的组成及其动态变化的科学,是在蛋白质水平上定量的、动态的、整体的研究生物体。目前蛋白质组学技术分为样品制备、分离和鉴定3个方面,其新技术主要有激光捕捉显微解剖法、离心超滤法、双向凝胶电泳、同位素亲和标签技术、色谱技术以及质谱技术等。然而,任何一种蛋白质组学研究技术都有其缺陷。因此多种技术的联合应用能使蛋白质组研究更精确和完整,是蛋白质组学的发展趋势。     

丝状真菌蛋白质组学研究

真菌是自然界中广泛存在的一类重要微生物,与人类的生产、生活密切相关.丝状真菌作为其中的类群,在食品、药品、酶剂、有机酸的生产和农业的生物防治等方面发挥着极大的作用.     

差异表达蛋白质组学中的常用技术

人类基因组计划基本完成后，人们又开始对生物所有蛋白质性质和功能进行大规模研究，即蛋白质组学。尤其是由于差异表达蛋白质组学在制药和疾病研究中的巨大潜力，更是倍受重视。蛋白质组学的极端复杂性决定了它所应用的技术更加复杂和综合，本文简要介绍了在差异表达蛋白质组学中的常用技术。     

差异表达蛋白质组学中的常用技术

人类基因组计划基本完成后,人们又开始对生物所有蛋白质性质和功能进行大规模研究,即蛋白质组学。尤其是由于差异表达蛋白质组学在制药和疾病研究中的巨大潜力,更是倍受重视。蛋白质组学的极端复杂性决定了它所应用的技术更加复杂和综合,本文简要介绍了在差异表达蛋白质组学中的常用技术。     

胶原诱导性关节炎大鼠滑膜双向凝胶电泳图谱建立及差异分析

目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一个多基因多因素参与的病理过程。实验中通过建立与RA发病机制相似的胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠动物模型,运用蛋白质组技术对正常大鼠和CIA大鼠模型不同时间点滑膜组织的蛋白质点进行比较分析,为鉴定CIA大鼠滑膜病变相关蛋白质及研究RA发病机制奠定基础。方法用牛Ⅱ型胶原和完全福氏佐剂建立CIA大鼠模型,采用一步抽提法抽提滑膜蛋白质,运用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各组大鼠滑膜组织的总蛋白质,用PDquest软件分析图谱,比较差异蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应肽质指纹图谱,用Mascot查询软件搜索数据库,鉴定部分差异蛋白质。结果成功建立了CIA大鼠模型,获得分辨率较高、重复性较好的大鼠滑膜组织双向电泳凝胶图谱。正常组与25、35和45天模型组大鼠滑膜组织凝胶图谱的平均蛋白质点数分别为1070±41、1049±22、1079±44和1088±39。在4个组均有表达差异的蛋白质点中随机取20个点进行肽质指纹图分析,鉴定了部分与细胞代谢、信号转导及结构相关的差异表达蛋白质。结论建立了分辨率较高且重复性较好的正常大鼠与CIA大鼠不同时间点滑膜组织的双向凝胶电泳图谱,鉴定了一些与CIA大鼠滑膜病变相关的差异表达蛋白质,为识别RA病变相关蛋白质及推断RA病变过程奠定基础。     

5-FU诱导人肝细胞癌MDR的比较蛋白质组学研究

目的 寻找与人肝细胞癌多药耐药相关的蛋白质分子,为进一步研究人肝细胞癌多药耐药机制提供依据.方法 体外培养人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶(5-FU)细胞Bel-FU,MTF法检测Bel-FU的多药耐药性,双向凝胶电泳技术分析细胞Bel-7402与Bel-FU之间的差异表达蛋白,经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定.Western blot验证2-DE及质谱的检测结果.结果 与Bel-7402比较,Bel-FU中有24个蛋白表达上调,其中包括FAK、TM3、ORP150、CRT、hnRNP K、80K-H protein、EF-1-D、phosphoprotein等,12个蛋白表达下调.Western blot法检测到蛋白FAK、CRT在Bel-FU中高表达,与2-DE结果一致.结论 通过建立人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-FU的2-DE图谱筛选了多药耐药相关的差异蛋白,为人肝细胞癌MDR的分子机制研究奠定了基础.     

乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白致HepG2细胞凋亡的蛋白质组学分析

目的 研究乙型肝炎病毒(hepatitits B virus,HBV)表面抗原大蛋白(large envelope protein,LHB)对HepG2细胞凋亡的影响,并以蛋白质组学方法探讨其机制.方法 以腺病毒表达载体pShuttle-IRES-hrGFP-1克隆HBV LHB基因,经重组、包装后获得重组腺病毒Ad-LHB,与空载体重组腺病毒Ad-GFP分别感染HepG2细胞,采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、JC-1细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒和碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡情况.Ad-LHB及Ad-GFP分别感染HepG2细胞,提取细胞总蛋白,各取600μg蛋白样品进行双相电泳,R350染色,以双相电泳图像分析软件ImageMaster 2D Platinum确定差异蛋白点,Ettan斑点自动挖胶系统切取差异蛋白,脱色酶解后进行MALDI-TOF-TOF MS鉴定并分析.结果 Ad-LHB感染导致HepG2细胞凋亡明显增加.双向电泳及扫描分析显示Ad-LHB与Ad-GFP感染的HepG2细胞共有39个蛋白差异.质谱分析并确定其中的33种共36个蛋白,这些差异蛋白质有9种与细胞凋亡密切相关,其中,CAPN2、eIF3K和PPP2CB在Ad-LHB感染HepG2细胞表达增高,SERPINH1、LASP1、PRDX1、DHRS2、LDHA和PSMA4在Ad-LHB感染HepG2细胞表达降低.结论 HBV LHB可致HepG2细胞凋亡,多种细胞凋亡相关蛋白参与此过程.     

慢性肾小球肾炎肾阴虚证血浆蛋白质双向凝胶电泳分析

目的初步观察慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者血浆蛋白质组的变化与表达差异,为进一步探讨肾阴虚证的发生机制奠定基础。方法采用双向凝胶电泳（2-DE）技术分离慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者、肾阳虚证患者和正常人的血浆总蛋白,银染显色;PDQest软件对凝胶图像进行定性定量差异表达分析;从中选取差异表达蛋白质斑点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析,获取肽质量指纹图谱（PMF）;通过Mscot-Wizard软件进行数据库搜索,鉴定蛋白质。结果与正常人和慢性肾小球肾炎肾阳虚证患者相比,在慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者血浆蛋白质双向凝胶电泳图谱中绝对高表达的蛋白质斑点有80个,绝对低表达的蛋白质斑点有42个;定性差异表达分析发现,在慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者血浆蛋白质双向凝胶电泳图谱中特异出现的蛋白质斑点有2个,缺失的蛋白质斑点有13个。结论同病异证患者血浆中存在差异表达蛋白质,利用蛋白质组学技术有望对中医证候的发生机制进行阐释。     

类风湿性关节炎患者关节滑膜组织蛋白质组学

背景：已有研究表明滑膜炎持久反复发作,最终导致关节内软骨和骨的破坏,国内关于类风湿性关节炎滑膜组织的蛋白质组学研究报道较少。 目的：通过比较类风湿性关节炎患者和无关节滑膜损伤患者滑膜组织蛋白质表达的差异,探讨类风湿性关节炎可能的发病机制,寻找类风湿性关节炎致病相关蛋白。 方法：选取6例无关节滑膜损伤患者及6例活动期类风湿性关节炎患者行关节镜手术得到的滑膜组织,提取总蛋白质后进行双向凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,PDQUEST软件分析,对差异蛋白质点采用基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-TOF-MS)技术进行鉴定,并用Mascot软件在SwissProt和NCBInr数据库中进行同源比较和分析鉴定。 结果与结论：建立了类风湿性关节炎组及对照组滑膜组织双向凝胶电泳图谱,获得130个差异在2倍以上的蛋白质点数,选取其中分辨清楚的39个点进行鉴定,初步鉴定出29个蛋白质,其中21个蛋白质点在类风湿性关节炎组中表达上调,8个表达下调,其功能涉及功能代谢、细胞信号传导、抗氧化、分子伴侣等。结果表明类风湿关节炎滑膜病变是一个多种蛋白质参与的复杂过程,这些表达差异蛋白质可能是类风湿性关节炎发病的内在因素。