靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控

背景:脐血干细胞是基因治疗最理想的靶细胞之一,但基因转移率低下是目前面临的主要障碍.酪氨酸激酶JAK2在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用,为了克服脐血基因转移率低下的障碍,根据基因调控表达技术原理,是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34 细胞体系.目的:探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性. 单位:卫生部北京医院血液科.材料:实验于2003-06/2006-04在卫生部北京医院血液科实验室完成.脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血.脐血由北京医院妇产科提供,产妇及家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准.MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司, 流式细胞仪购自美国FACScalibur,人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品,SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心.方法:构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成.AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导.该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因,用作检测细胞增殖的标记.应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34 细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34 细胞.转导后的CD34 细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组.主要观察指标:①应用流式细胞仪测定两组CD34 细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率,确定基因转移率.②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果.③取培养10周的脐血CD34 细胞于裸鼠的胁部皮下注射,30 d后观察成瘤情况.结果:①实验组与对照组均可获得CD34 细胞大量扩增.随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34 细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组绿色荧光蛋白报告基因阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失.②实验组转基因CD34 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落红系祖细胞、粒单系祖细胞、脐血多向造血祖细胞,所形成的造血祖细胞集落以粒单系祖细胞为主.③裸鼠实验无致瘤特性.结论:转染JAK2 基因的人脐血CD34 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值.     

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控的实验研究

目的探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。方法构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34 细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34 细胞。转导后的CD34 细胞在SCF、FL、TPO、IL-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。定期检测CD34 细胞基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养和裸鼠致瘤试验。结果分选的CD34 细胞纯度为91%以上,基因转移率为49．3%±6．2%;实验组AP20187 SCF FL TPO IL-6(ASFTI)与对照组SCF FL TPO IL-6(SFTI)组均可获得CD34 细胞大量扩增。随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34 细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组GFP阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。在培养6周左右,实验组CD34 CD38-、CD34 CD38 细胞亚群扩增倍数分别为(228．26±32．31)、(321．48±40．52),分别与对照组相比,差异有显著性。ASFTI组转基因CD34 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix)。扩增后CD34 细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性。结论转染JAK2基因的人脐血CD34 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。     

脐血CD34^＋细胞体外扩增脐血巨核祖细胞的研究

本研究探讨人脐血CD34^＋细胞体外扩增的巨核祖细胞的生物学特性及其免疫原性变化，为体外扩增脐血巨核祖细胞的临床应用提供实验依据。采用Ficoll-Hapaque分离法分离人脐血单个核细胞，应用免疫磁珠法（MACS）再分离富集CD34^＋细胞，在含血小板生成素（TPO，50ng／ml）、白介素-1]（IL—11，50ng／ml）和肝素（25U／ml）的无血清液体培养体系中培养14天。用流式细胞术检测扩增产物免疫表型（CD34^＋、CD41a^＋、CD61^＋、CD34^＋CD41a^＋及CD34^＋CD61^＋）、巨核细胞凋亡率及其表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达，并进行巨核细胞集落形成单位（CFU—Mk）的检测。结果显示：脐血CD34^＋细胞能够有效地向巨核细胞分化，CD41a^＋和CD61^＋细胞比例在培养第14天达到峰值，CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例在扩增第7天达到最高峰[分别为（3．41±2．80）％和（1．89±1．43）％]；CFU—Mk大集落在扩增第7天达到高峰（（20．66±32．79）倍]，小集落在扩增第10天达到高峰[（435．62±482．65）倍]；在培养7、10和14天时巨核细胞的凋亡率分别为（19．48±9．64）％、（26．87±9．03）％和（52．46±11．74）％，其中培养7天和10天的凋亡率无显著性差异（P〉0．05），培养14天的凋亡率显著高于7天和10天（P均〈0．05）；巨核细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达随着扩增天数的延长逐渐降低，其中培养0到10天阶段下降明显．结论：采用TPO＋IL 11＋肝素组合．可以有效地扩增脐血巨核祖细胞；培养7天，CFU—Mk大集落扩增倍数、CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例均达高峰，这是巨核祖细胞体外扩增的较佳培养时间。     

脐血CD133^＋细胞体外扩增巨核系祖细胞的研究

本研究探讨脐血CD133^＋（UCB—CD133^＋）细胞体外扩增巨核系祖细胞的能力和最佳收获时间。采用免疫磁珠激活细胞分选系统（MACS）分选UCB—CD133^＋细胞，将纯化的UCB—CD133^＋细胞接种于含TPO、IL-3和SCF的无血清液体培养体系中体外扩增巨核系祖细胞，在培养第7、10和14天进行细胞计数，流式细胞仪检测扩增过程中CD133、CD34、CD41抗原表达的动态变化，并采用半固体法对不同扩增阶段的细胞进行巨核祖细胞集落形成单位（CFU—MK）培养。结果表明：培养至第7天时，UCB—CD133^＋细胞扩增效果最佳，扩增了8、2-1-2．2倍；培养至第14天，细胞总数扩增了116倍；培养至10天时，平均1个CD133^＋细胞所产生的CD133^＋CD41^＋和CD34^＋CD41^＋细胞数最多，分剐为2．5±0．9和2．6±0.5个，所产生的CD41^＋细胞为20．3±5、9个；扩增前后的UCB—CD133^＋细胞均能形成CFU—MK，扩增第10天的UCB—CD133^＋细胞所形成的CFU—MK总数最多，CFU—MK扩增倍数为59．5±11．8倍。巨核细胞免疫组织化学染色显示，扩增后的巨核系细胞多呈幼稚状态，未见血小板形成。结论：UCB—CD133^＋细胞具有较强的体外扩增巨核系祖细胞的能力，培养第10天扩增效能最佳。     

脐血CD34＋细胞体外扩增前后生物学特征及 HOXB4基因表达变化的研究

目的比较脐血 CD34＋细胞体外扩增前后生物学特征及 HOXB4基因表达的变化。方法分离新鲜人脐血单个核细胞（MNC）,应用免疫磁珠分选系统（MiniMACS）分选CD34＋细胞,在含细胞因子组合FL＋SCF＋TPO＋IL-3的IMDM＋10％FBS培养基中体外培养2周,分别于培养第0、7、14天计数有核细胞（ nucleated cells ,NC）数,流式细胞仪分析CD34＋细胞比例,RT-PCR检测HOXB4基因的表达变化。并取第0天与第7天的细胞于甲基纤维素半固体培养基中培养14 d,光镜下计数造血干/祖细胞集落形成数目。结果经MiniMACS分选,CD34＋细胞比例由分选前的（1.1±0.25）％升至（83.17±8.67）％,CD34＋细胞回收率为（72.90±8.75）％。体外培养第7天与第14天CD34＋细胞的比例分别降至（4.8±0.64）％与（0.6±0.27）％（P＜0.05）;NC和CD34＋细胞均有不同程度的增加,扩增7 d与14 d的NC数、CD34＋细胞数分别较第0天扩增（76.2±14.9）倍、（254.0±48.85）倍与（3.9±0.69）倍、（1.8±0.64）倍,不同时间点差异有统计学意义（ P＜0.05）。经过14 d半固体培养,扩增7 d的造血干/祖细胞集落形成数目是未扩增的3.75倍（ P＜0.05）。 RT-PCR检测HOXB4基因在第0天的CD34＋细胞中高表达,但其表达量随着体外培养时间的延长而下降（ P＜0.05）。结论细胞因子组合FL＋SCF＋TPO＋IL-3可有效扩增造血干/祖细胞,培养第7天较第14天的CD34＋细胞扩增倍数高,但CD34＋细胞表型在体外培养过程中迅速下降,与CD34＋细胞自我更新能力相关的HOXB4基因的表达水平也随体外培养时间的延长而下降。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。②S组：基质细胞＋单个核细胞。③SF组：基质细胞＋干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞数以及集落形成单位数。结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133＋细胞/有核细胞、CD34＋细胞/有核细胞、CD133＋CD34＋细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

间充质干细胞对脐血CD34^＋细胞扩增及其细胞特性变化的影响

本研究探讨脐带间充质干细胞（MSC）对CD34^＋细胞（HSPC）体外扩增的支持作用及对CD34^＋细胞表面标志、归巢黏附分子、集落形成能力等干细胞特征变化的影响。用免疫磁珠法从新鲜分离的脐血单个核细胞分离CD34^＋造血干祖细胞（HSPC）；用MSC饲养层（feeder）制备经^137Cs照射的间充质干细胞饲养细胞（MSC feeder cells）。将CD34^＋细胞接种在不同的培养体系中，实验分为3组：HSPC＋CK组为培养液中加入细胞因子组合（SCF、FL和TPO），HSPC＋MSC组为CD34^＋细胞接种在MSC feeder上，HSPC＋MSC＋CK组同时加入细胞因子组合及MSC饲养细胞。培养后4、7、10、14天计数有核细胞总数（MNC），计算细胞扩增情况；用流式细胞术检测不同处理组间CD34^＋细胞及亚群免疫表型、归巢黏附分子和集落形成能力。结果表明：在2周的培养时间里，3组MNC和CD34^＋细胞均明显增加，MNC扩增数依次HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组〉HSPC＋MSC组。体外扩增10天内HSPC＋MSC＋CK组MNC得到大量的扩增，同时CD34^＋细胞的扩增亦较高。培养4天3组细胞CD34^＋比例较0天有明显下降（P〈0．01）；扩增后CD34^＋细胞比例：HSPC＋MSC组〉HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组（P〈0．01）；各组CD34^＋细胞亚型细胞比例有所不同，HSPC＋CK组4天时CD34^＋CD38^-细胞有一过性升高（62．71％），之后迅速降低，7天时为0．05％；HSPC＋MSC组7天时CD34^＋CD38^-细胞比例为18．92％，与HSPC＋CK组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。从集落形成分析结果看出：MSC、细胞因子混合组扩增后细胞集落形成能力在不同时间点均维持在较高水平。结论：脐血CD34^＋细胞在体外短期培养（〈7天）下，MSC和细胞因子联合应用能同时使CD34^＋细胞得到明显的扩增并维持造血干祖细胞的生物学特征。     

基质细胞衍生因子-1和血小板第4因子对体外扩增后脐血CD34+细胞黏附特性和趋化功能的影响

为了研究基质细胞衍生因子-1（SDF—1）和血小板第4因子（PF4）对扩增后脐血CD34^＋细胞归巢相关功能的影响，将纯化的脐血CD34^＋细胞接种入无血清培养液中，加入不同组合的细胞因子FST（FL＋SCF＋TPO）、FST＋SDF—1、FST＋PF4或FST＋SDF—1＋PF4，分别于培养第7、10、14天检测CD34^＋细胞扩增倍数、集落形成能力、细胞的黏附分子表达、总黏附性、趋化功能。结果表明：①加入SDF—1的实验组CD34^＋细胞及造血祖细胞集落扩增倍数高于对照组；②加入SDF—1明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e的表达，加入PF4明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e、CD54的表达，在扩增体系中加入SDF—1或PF4均能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的总黏附性；③在扩增体系中加入SDF—1能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的自发迁移率，但导致CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率降低；而PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率；在扩增体系中同时加入SDF—1和PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞自发迁移率和SDF—1诱导迁移率。结论：体外扩增体系中加入SDF—1和PF4能够上调部分归巢相关黏附分子的表达，保持扩增的CD34^＋细胞的黏附和迁移能力，有利于降低体外扩增对造血干／祖细胞（HSPC）归巢相关功能的不利影响，维持扩增的HSPC的归巢潜能。     

脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化

同源盒基因家族成员HOXIM反映原始造血干／祖细胞（PHSC／PHPC）的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT—PCR的方法在mRNA水平上检测HOXIM基因的表达，以观察体外扩增脐血CD34^＋细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然CD34^＋细胞数增加，但HOXB4表达下降；周后，HOXB4几乎检测不到，与成熟外周血淋巴细胞表达HOXIM的水平相同；CD34^＋细胞与骨髓间充质干细胞（BM—MSC）共培养可以减缓CD34^＋细胞HOXIM表达的下降。结论：脐血CD34^＋细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34^＋与BM—MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34^＋细胞自我更新能力的丧失。     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

骨髓中一类新细胞群--神经组织定向干细胞的确立

背景：骨髓间充质干细胞和造血干细胞具有分化为神经类细胞的潜能己得到共识。另有研究者认为骨髓中除骨髓间充质干细胞和造血干细胞以外，还寄居着CXCR4阳性的组织定向干细胞，包括骨骼肌、心、肝及神经组织定向干细胞。 目的：实验拟进一步证实神经组织定向干细胞寄居于骨髓，并寻求确立神经组织定向干细胞分离、培养的新方法。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学解剖学教研室。 材料：所用成年清洁级SD大鼠由解放军第二军医大学动物中心提供。DMEM/F12,B27，N2均购自Invitrogen公司；bFGF源于CytoLab Ltd;EGF源于Invitrogen公司；Nestin、CXCR4,β-Tublin Ⅲ，神经胶质纤维酸性蛋白等一抗为Santa Cruz公司兔抗鼠多克隆抗体；MAP2ab（Clonell—5B），CNPase（Clone AP20）为NeoMarkers公司小鼠抗大鼠单克隆抗体；荧光（FITC，Cy3）标记试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司。NycoPrep^TM分离液（1．077A）购自Axis-Shield公司。 方法：实验于2004-01／2006-12在解放军第二军医大学组织工程研究所完成。取SD大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔，经NycoPrep^TM分离液分离单核细胞层，DMEM／F12（1：1）无血清神经干细胞培养液（内含2％B27，1％N2，20μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，1×10^5U/L青霉素，100mg／L链霉素），通过先贴壁、后悬浮的方法从骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞。 主要观察指标：通过免疫细胞化学法检测神经组织定向干细胞细胞球CXCR4和nesfin蛋白，以及细胞球自然分化后神经元以及神经胶质细胞的标志蛋白。 结果：①神经组织定向干细胞细胞球表达神经干细胞标志蛋白nesfin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4。②神经组织定向干细胞细胞球在含15％胎牛血清的     

儿童造血干细胞移植后出血性膀胱炎：临床特征与危险因素

背景：出血性膀胱炎是造血干细胞移植后常见并发症之一，探讨其临床特征及发病的危险因素对改善造血干细胞移植效果有重要应用意义。 目的：观察小儿造血干细胞移植后出血性膀胱炎发病情况，并分析其临床特点以及发病危险因素。 设计：病例分析。 单位：中山大学附属第二医院儿科造血干细胞移植中心。 对象：选择1998—10/2004-06在中山大学附属第二医院儿科HSCT中心88例接受脐血移植与外周血造血干细胞移植患儿，男49例，女39例，年龄2-18岁，平均8．0岁。所有患儿家属对治疗知情同意。实验经过医院伦理委员会批准许可。 方法：①患儿预处理方案主要有环磷酰胺（120～200mg／kg）和马利兰（Bu，14-20mg／kg）组成为主的化疗方案。以及环磷酰胺联合全淋巴照射（2—8Gy）或全身照射（2．8Gy）组成的放疗方案。②按文献[7]及[8]标准诊断及对出血性膀胱炎分类：观察患者出血性膀胱炎发生率、临床特征、实验室检查及治疗与转归：分析年龄、性别、供受者人类白细胞抗原配型、移植病种、移植类型、移植方式、急性移植物抗宿主病的发生、巨细胞病毒感染对出血性膀胱炎发生的影响。 主要观察指标：①患儿出血性膀胱炎发生率。②临床特征与实验室检查。③治疗与转归。④出血性膀胱炎发生的危险因素。 结果：纳入患儿88例均进入结果分析。①出血性膀胱炎发生率：16例（18．2％，16，88）患儿发生出血性膀胱炎，其中轻度11例（68．7％），重度5例。②临床特征与实验室检查：患儿均有血尿，其中典型尿频、尿急、尿痛及肉眼血尿8例（50．O％）；肉眼血尿10例（62．5％）：11例蛋白尿（＋～＋＋＋），7例白细胞增高。③治疗与转归：所有出血性膀胱炎患儿均痊愈，病程2～53d。④出血性膀胱炎发生危险因素：受者移植年龄?     

钙离子ATP酶2a基因修饰骨髓间充质干细胞移植改善慢性心力衰竭大鼠的心功能

背景：目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌，逆转心肌病理性重塑。作为一种新的治疗策略，用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势。 目的：观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性。并以携带肌浆网钙离子ATP酶（sarcoplasmic reticulumCa（2＋）ATPase，SERCA2a）基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞，治疗心力衰竭大鼠，比较SERCA2a基因治疗，骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果。 设计：随机对照实验。 单位：解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。材料：选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性sD大鼠作为骨髓供体。选取体质量200～250g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体。以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活。实验所用Ad—SERCa2a，Ad—EGFP的构建由我科鲁小春博士完成；第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养。 方法：实验于2004—07／2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎，制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型。将造模成功的29只大鼠随机分为4组：基因治疗组7只，干细胞移植治疗组7只，基因修饰的干细胞移植组8只，腺病毒空载体对照组7只，分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-SERCA2a—GFP）转染第3和8代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a—GFP转染率。分别在治疗前及治疗后14，21d采用超声心动图     

自体外周血及骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢动脉闭塞：随机对照

目的：观察自体外周血干细胞和骨髓干细胞联合移植治疗糖尿病下肢闭塞症的临床疗效。 方法：选择2003—09／2007-01河南省人民医院二内内分泌科194例糖尿病下肢闭塞症患者，随机分为对照组（n=95）和干细胞移植组（n=99），2组均接受内科综合治疗，在此基础上对干细胞移植组进行干细胞移植，95例患者双侧肢体行自体干细胞移植，3例仅缺血较重的一侧肢体行自体干细胞移植，1例因一侧肢体截肢，另一侧行肢体干细胞移植，干细胞移植的肢体为194条，患者对治疗知情同意，并经医院伦理委员会批准。对干细胞移植组患者进行外周血干细胞动员，每天给予人重组粒细胞集落刺激因子450～600u，皮下注射，第5天局部麻醉下从髂骨处抽取自体骨髓血200mL，在实验室将骨髓沉淀、离心，分离等处理后制备40mL干细胞悬浊液备用。第6天应用COBE6．1血细胞分离机单采单个核细胞，总量60-120mL。将两种干细胞悬液按3cm×3cm距离进行缺血肢体移植术，移植后2周观察症状、体征改变。 结果：①干细胞移植组疼痛症状明显缓解、好转、无效的肢体分别为94个、96个、4个，对照组分别7个、156个、27个，2组间显效率及无效率差异显著（P〈0．01）。②干细胞移植组冷感明显缓解、好转、无效的肢体分别为126个、63个、5个，对照组分别为6个、158个、26个，2组间显效率及无效率差异显著（P〈0．01）。③干细胞移植组间歇性跛行明显缓解、好转、无效的肢体分别为138个、47个、9个，对照组分别为13个、152个、25个，2组间显效率及无效率差异显著（P〈0．01）。所有患者未出现并发症和不良反应。 结论：自体外周血干细胞移植治疗糖尿病足是一种简便、安全、有效的治疗方法。     

卵黄囊移植人脐血CD34^＋细胞构建人源化血液系统小鼠模型

背景：与较为成功的羊等大型动物宫内移植方法相比，利用小鼠等小型动物宫内移植异种造血干细胞仍面临困境，在外周血内检测到的异种血液细胞重建率仍在1％以下。目的：观察小鼠卵黄囊移植人脐血来源CD34^＋造血干细胞后的异种造血重建效率，并与腹腔移植的效果进行比较。设计、时间及地点：细胞学体内移植实验，于2007—10在北京大学干细胞与再生生物学实验室完成。材料：健康新生儿脐血取自北京海淀区妇幼保健院。ICR小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供，孕8．5d鼠8只，孕12．5d鼠9只。藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆抗体与流式细胞仪均为BD公司产品。方法：采用Ficoll法梯度离心获得人脐血单个核细胞，经磁珠分选系统纯化获得CD34^＋细胞。将孕8．5d鼠麻醉后，打开腹腔并暴露子宫，显微镜下抽取5～10μL脐血CD34^＋细胞（5×10^4个），缓慢注入胎鼠的卵黄囊中。相同操作条件下将等量脐血CD34^＋细胞注射到孕12．5d胎鼠的腹腔中。快速抽针，将孕鼠子宫归位并缝合腹腔，继续妊娠，等待分娩。待小鼠出生后3个月，经尾静脉取血，在避光状态下加入藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆荧光抗体，流式细胞仪检测血细胞表面标记CD45的表达，通过其阳性率判断人血液细胞在小鼠体内的重建效果。主要观察指标：不同移植方式对小鼠造血重建的影响。结果：CD34^＋细胞通过卵黄囊移植方式共获得健康出生小鼠52只，3个月后86．5％（45／52）小鼠CD45呈阳性表达，嵌合率高达4．34％。通过腹腔移植方式共获得健康出生小鼠48只，3个月后81.3％（39／48）小鼠CD45呈阳性表达，明显低于卵黄囊移植方式（t=2．363，P〈0．05）。结论：早期卵黄囊移植可以获得人造血干细胞在小鼠体内的长期重建，效果优于腹腔移植，同时也证明了通过胎鼠卵黄?     

人胚嗅鞘细胞与鼠胚胎脊髓组织联合移植对大鼠脊髓损伤的治疗

背景：脊髓损伤高发且后果严重，至今尚无有效措施挽救丧失的神经功能，哺乳动物嗅觉系统的一类特殊胶质细胞的移植引起关注。 目的：观察人胚嗅鞘细胞和大鼠胚胎脊髓共同移植在促进大鼠横断脊髓轴索再生方面是否产生协同作用。 设计：开放性实验。 单位：无锡第三人民医院细胞室，苏州大学附属第一医院神经外科，东南大学附属中大医院神经外科。 材料：实验于2002—09／2004—10在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。①选取清洁级成年雌性SD大鼠36只，随机数字表法分成4组：人胚嗅鞘细胞组10只、鼠胚胎脊髓组10只、联合移植组10只，模型组6只。②取12周左右的流产新鲜人胚胎（产妇知情同意）用于嗅鞘细胞的培养纯化。③取孕14d的SD大鼠1只，施行剖腹手术将胎鼠连同胎膜一同取出，用于新鲜胚胎脊髓的制备。 方法：①4组大鼠均建立脊髓半切洞模型。模型组在损伤洞腔内填塞明胶海绵加全培养基8μL，在损伤上下各1mm处注射相同培养基2μL；人胚嗅鞘细胞组明胶上给予嗅鞘细胞悬液8μL，损伤上下各1mm处注射细胞悬液2μL；鼠胚胎脊髓组将组织碎块直接填塞在洞腔内，外覆明胶；联合移植组将同样大小的胚胎脊髓填塞在洞腔内，然后用微量加样器将8μL的嗅鞘细胞悬液注入洞腔，外覆明胶，在洞腔上下各1mm处注射细胞悬液2μL，按层缝合肌层皮肤。②定期对各组大鼠进行行为学评定，结合病理学观察，并通过辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺逆行示踪技术，评价嗅鞘细胞和胚胎脊髓对神经元存活、纤维再生的影响。 主要观察指标：①人胚嗅鞘细胞体外培养及纯化。②体外免疫细胞化学分析。③大鼠后肢运动功能BBB评分测定结果。④移植物及受损脊髓修复的免疫组化检测结果。⑤辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺示踪对各组被     

重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴细胞功能相关抗原1／细胞间黏附分子1信号途径诱导CD4^＋T淋巴细胞活化及增殖的影响

目的：观察在异基因外周血造血干，祖细胞移植中重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴功能相关抗原1/细胞间黏附分子1信号途径诱导的外周血CD4＋T淋巴细胞的影响，验证重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴细胞功能相关抗原1/细胞间黏附分子1信号通路的抑制作用。 方法：选择2006—06/2007—06在解放军总医院血液科异基因外周血造血干细胞移植前进行重组人粒细胞集落刺激因子动员的10例健康供者，对治疗方案均知情同意，且得到医院伦理道德委员会批准。给予重组人粒细胞集落刺激因子10μg，（kg·d）进行动员，在动员前1天和动员后第5天取供者外周静脉血，用miniMACS磁珠分选系统分离纯化CD4＋T淋巴细胞，分别用CD3单克隆抗体OKT3＋细胞间黏附分子1、佛波酯＋离子霉素刺激活化CD4^＋T淋巴细胞，用双色荧光标记检测动员前后CD4^＋T淋巴细胞激活后活化标记CD69，CD25的表达；用四甲基偶氮唑盐法检测动员前后OKT3＋细胞间粘黏附分子1、佛波酯＋离子霉素刺激CD4^＋T淋巴细胞增殖能力变化。 结果：①纯化后CD4^＋T淋巴细胞纯度均在90％以上。②动员后OKT3＋细胞间黏附分子1组、佛波酯＋离子霉素组CD4^＋T淋巴细胞活化标记CD69和CD25的表达均明显低于动员前（P〈0．01）。②动员后OKT3＋细胞间黏附分子1组、佛波酯＋离子霉素组CD4^＋T淋巴细胞增殖率均明显低于动员前（P〈0．05）。 结论：重组人粒细胞集落刺激因子动员可能抑制了淋巴功能相关抗原1/细胞间黏附分子1协同刺激信号，从而使CD4^＋T淋巴细胞活化、增殖能力下降。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

深低温冻存不同时间对脐血细胞质量的影响

本研究旨在探讨不同冻存时间的脐血干细胞复苏后的回收率,并分析冷冻复苏的细胞对患者植入速度的影响。20份经-196℃液氮低温保存1-10年的脐血干细胞标本,比较冻存前（脐血库提供资料）和复苏后的细胞活率、总有核细胞数（TNC）、CD34＋细胞和粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）的数量,并分析复苏后的细胞回收对移植受者植入速度的影响。结果表明,不同冻存时间对复苏后干细胞的回收率没有影响。经冻存复苏后,细胞活存率为（92．75±2．55）％,TNC、CD34＋细胞数和CFU-GM的回收率分别为89．9％、84．8％和84．3％,与冻存前相比明显减少（P=0．000）,但细胞数量的下降对移植患者中性粒细胞和血小板的植入时间均无影响。冻存后TNC和CD34＋细胞数量与冻存前数量有很大的相关性（r=0．954;r=0．931,P=0．000）,而CFU-GM的相关性弱（r=0．285,P=0．223）。结论：冻存和复温过程会-定程度上损伤脐血干细胞,导致细胞丢失,但不会影响移植的效果。