旋毛虫Ts87重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究

为了进一步探讨旋毛虫Ts87基因原核表达重组蛋白的保护性免疫作用 ,本试验用此纯化重组蛋白组分加福氏完全佐剂 (FCA)皮下注射免疫NIH小鼠 3次 ,继以旋毛虫感染性幼虫 2 5 0条攻击 ,攻击后每周取血清测抗体IgG滴度 ,第 35天计数小鼠肌肉幼虫数。结果显示重组蛋白免疫鼠的肌肉幼虫减虫率为4 2 3% ,血清抗Ts87重组蛋白体IgG的几何平均倒数滴度 (GMRT)达到 80 0 0以上 ,均显著高于佐剂组和对照组。Ts87基因表达的重组蛋白可产生明显的保护性免疫作用     

小鼠甲胎蛋白与结核杆菌热休克蛋白70基因融合载体的构建及体外表达

目的 构建小鼠甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70，Mt．HSP70)基因融合载体．并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 以pcDNA3.1为基本单位构建AFP及HSP70的融合表达载体，融合基因以G-S-G-G-S连接子连接；用脂质体将系列载体导入COS-7细胞．48h后以免疫化学方法检测其表达。结果 构建的AFP和HSP70的单独及融合表达载体导入COS-7细胞48h后经RT-PCR检测可扩增出相应片段，细胞免疫化学染色为阳性。结论 AFP和HSP70的单独及融合表达载体构建成功，并能在真核细胞中表达。     

MAGE-1与结核杆菌HSP70融合基因的构建及原核表达

目的 构建结核杆菌HSP70与肿瘤抗原MAGE-1的融合基因，在大肠杆菌中进行表达，并通过GST纯化系统进行分离纯化。方法 利用PCR方法扩增TBHSP70基因，经测序后连入原核表达载体pGEX-4T-1，再通过PCR方法扩增MAGE-1基因片段(289～927bp)，测序后插入TBHSP70基因的5’端，构建MAGE-1与TBHSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-MAGE-1-TBHSP70，含有该质粒的大肠杆菌DH5a进行诱导表达和分离纯化。结果 成功地扩增了TBHSP70基因与MAGE-1基因片段，测序结果表明与GenBank公布的序列一致；成功地构建了pGEX-MAGE-1-TBHSP70原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经IPTG诱导后表达一Mt约为125000的蛋白，经GST融合蛋白表达系统纯化，得到了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白。结论 成功地获得了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白，为研究MAGE-1-TBHSP70融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。     

湖北株旋毛虫不同时期ES抗原的表达

目的　完成旋毛虫 (Trichinellaspiralis,Ts)湖北株排泄分泌抗原 (excretory secretoryantigen ,ES抗原 )中 4 3ku ,4 9ku及 5 3ku抗原的不同虫期的基因表达 ,并与旋毛虫昆明株中相对应的ES抗原进行对比 ,分析不同虫期、虫株对这 3类抗原基因表达的影响。方法　根据已知的 3类抗原的基因序列设计合成 3对特异性引物 ,运用RT PCR技术检测抗原基因的表达 ,并以旋毛虫 18sRNA为标准进行对比。结果　RT PCR得到了湖北株两个虫期中的 4 3ku,4 9ku及 5 3ku的ES抗原mRNA产物 ,并与昆明株进行对比后发现 3类抗原在不同虫期表达有明显差异。结论　通过研究发现不同虫期的同类ES抗原的表达量有显著性差异。     

热休克蛋白70融合肿瘤抗原基因的DNA疫苗研究进展

在抗肿瘤免疫治疗中,已经发展了多种形式的热休克蛋白70(HSP70)相关治疗性疫苗,这些疫苗主要包括蛋白疫苗、肽疫苗、细胞疫苗及DNA疫苗等,其中HSP70融合DNA疫苗凭借其自身的优势引起人们的关注。它不但可诱导高效、持久的抗肿瘤免疫应答,而且可以维持免疫记忆。本文就HSP70在肿瘤治疗性DNA疫苗中的作用和应用作一综述。     

旋毛虫抗原基因Ts21体外表达条件的研究

目的优化体外表达旋毛虫抗原基因Ts21的条件。方法比较不同诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间、抗生素(氨苄青霉素)浓度及诱导温度等条件下融合蛋白(rMBP-Ts21)的表达水平,选择适宜的表达条件。结果在诱导剂浓度0.3mmol/L、诱导时间3h及诱导温度在20℃的情况下,融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的20%;抗生素浓度对融合蛋白表达量无明显影响。结论获得旋毛虫抗原基因Ts21体外表达的适宜条件,为大量制备、纯化该重组抗原奠定基础。     

热休克蛋白70复合物与肿瘤免疫

热休克蛋白 70 (HSP70 )家族是一类重要的应激蛋白 ,在肿瘤组织中可诱导其异常表达。由于HSP70在肿瘤免疫中发挥免疫佐剂的功能 ,并介导细胞免疫 ,协同抗原提呈细胞、αβT细胞、γδT细胞和NK细胞的作用 ,综合多种免疫效应杀伤肿瘤细胞 ,表明HSP70对开发肿瘤疫苗有重要的意义     

杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白的生物信息学分析、原核表达及生物学活性鉴定

目的 揭示杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白生物信息学特征,并探索该类蛋白外源表达方法及生物学活性.方法 通过生物信息学软件对已获得的3个含HSP70结构域蛋白的理化性质进行分析,利用免疫表位数据库和分析资源(IEDB)对该类蛋白的T、B细胞表位进行预测;根据Uniprot数据库提供的氨基酸序列合成相关基因并克...     

新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。     

Hsp70和PCNA在NIH小鼠前胃癌变过程中的表达及意义

目的 :研究N 亚硝基 肌氨酸乙酯 (N nitrososarcosineethylester,NSEE)诱导NIH小鼠前胃癌变过程中 ,热休克蛋白 70 (heatshockprotein 70 ,Hsp70 )和增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnu clearantigen ,PCNA)的表达及意义。方法 :将 14 4只小鼠分为6组 ,通过用NSEE灌胃建立小鼠前胃癌模型。每隔2wk处死 2 4只小鼠 ,取其前胃用免疫组化ABC法 ,对小鼠前胃癌变进程中细胞形态的改变 ,Hsp70和PCNA的表达进行跟踪研究。结果 :在NSEE诱癌过程中 ,Hsp70的表达呈现马鞍型 ,而Hsp70的表达一直呈增强的趋势。给药后 5 6、70d ,与对照组比较差异显著 (P <0 .0 5 ) ,84d差异极显著(P <0 .0 1)。PCNA的表达随着诱癌进程呈现递增趋势 ,给药后 4 2、5 6d ,与对照组比较差异显著 (P <0 .0 5 ) ,70、84d差异极显著 (P <0 .0 1)。Hsp70与PCNA的表达呈正相关关系 (r=0 .98,P <0 .0 1)。结论 :在诱发NIH小鼠前胃癌变过程中 ,Hsp70、PCNA的表达均呈现升高趋势 ,且两者呈正相关关系     

旋毛虫Ts87重组蛋白诱导的小鼠黏膜免疫保护性研究

本实验探讨旋毛虫Ts87重组蛋白灌胃免疫小鼠诱导的黏膜免疫保护性作用。实验分对照组、佐剂组(霍乱毒素B亚单位组,CTB)和免疫组(CTB Ts87重组蛋白),灌胃免疫,间隔1周共免疫3次。末次免疫后第7天用400条旋毛虫感染期幼虫攻击,比较3组小鼠肠道成虫数、雌虫生殖力和肌幼虫数。且于末次免疫后第7天刮取肠黏液、取血检测特异性sIgA、IgG抗体水平。结果显示免疫组小鼠成虫减虫率、新生蚴减虫率、肌幼虫减虫率分别是81·34%、67·02%、84·49%;小鼠肠黏液sIgA水平及血清IgG水平显著高于对照组和佐剂组。结果表明Ts87重组蛋白黏膜免疫能够诱导小鼠产生抗旋毛虫的保护性免疫。灌胃免疫能显著提高肠黏液特异性sIgA水平,对促进肠道成虫的排出有明显作用。     

旋毛虫Ts87抗原单克隆抗体的制备及其识别肽段的研究

将原核系统成功表达的Ts87重组蛋白纯化后免疫动物,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗Ts87抗原的单克隆抗体.通过ElISA、免疫印迹、免疫组化等方法筛选出能分泌抗Ts87御抗原的抗体的阳性克隆,在1000个融合的杂交瘤细胞中,有3株融合细胞分泌的单克隆抗体(2A2,5A3,6G12)鉴定结果为阳性.这3株融合细胞分泌的抗体均能识别Ts87重组蛋白、旋毛虫成虫和幼虫的Ts87抗原以及旋毛虫幼虫组织切片.获得的抗Ts87抗原的单克隆抗体在将来的研究中可作为旋毛虫病的诊断试剂.为了进一步鉴定抗体识别的相应抗原表位和模拟抗原表位,选择了其中一株单克隆抗体5A3筛选噬菌体十二肽库.噬菌体M7展示的肽段是抗体识别Ts87抗原的线性表位,其他的噬菌体克隆展示的肽段是Ts87抗原的模拟表位.该技术为旋毛虫病多表位疫苗的构建奠定了基础.     

应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究

为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达。针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达。此外,测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的变化。根据实时荧光定量PCR结果,dsRNA及siRNA均能有效抑制Ts87基因mRNA的表达。此外,两种RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率。实验表明,RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因Ts87表达,从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径。     

小鼠不同组织器官热休克蛋白70表达的研究

目的　研究热休克恢复期小鼠大脑、垂体、肾、肾上腺中HSP70的表达规律。　方法　昆明系小鼠随机分为对照组和实验组。实验组动物 :1 分别以 40℃ ,42℃ ,44℃ ,46℃热休克处理 30min ,恢复 2h和 8h ;2 以46℃热休克处理 30min ,恢复 2、4、6、8、12、2 4、48、72h ,以免疫组织化学结合图像分析技术观察HSP70的表达。　结果　 1 42℃ ,44℃ ,46℃均能诱导肾、肾上腺表达HSP70 ,44℃、46℃可诱导大脑、垂体表达HSP70 ,但均以 46℃组阳性免疫反应面积最大 (P <0 0 1) ;2 HSP70的合成高峰在大脑和垂体为热休克恢复期 4～ 8h(P <0 0 1) ,肾和肾上腺为 8～ 12h(P <0 0 1) ;3 HSP70阳性免疫反应定位于大脑神经膜和郎飞结 ,垂体神经膜 ,肾小管、肾上腺网状带和束状带细胞质 ,肾中HSP70阳性免疫反应肾小管较肾小球强 ,肾髓质较肾皮质强。　结论　热休克反应中不同组织器官HSP70的表达存在明显差异性 ;HSP70合成迅速且降解缓慢 ;大脑和垂体有较强的耐热能力     

阿苯哒唑对鼠体内旋毛虫幼虫蛋白质、氨基酸及元素含量的影响

目的 :探讨阿苯哒唑对旋毛虫幼虫的驱虫机理。方法 :将感染旋毛虫的小鼠分为对照组和服用阿苯哒唑药物的实验组 ,分别对两组鼠肌肉中提取的旋毛虫幼虫进行了蛋白质、氨基酸及所含元素的检测。结果 :实验组和对照组氨基酸含量的变化表明 :用药前后小鼠的 18种氨基酸含量中 ,分别有 5种氨基酸的含量发生了显著性变化 ;实验组和对照组蛋白质含量的变化表明 :实验组蛋白质含量较对照组含量有明显减少 ;通过比较两组元素含量表明 :10种宏量及微量元素中有 8种元素含量有显著性变化。结论 :阿苯哒唑对鼠体内旋毛虫幼虫主要营养和能量来源的的蛋白质、氨基酸及元素含量有明显的影响 ,干扰虫体正常的代谢功能     

我国旋毛虫Ts254 DNA探针制备及序列测定

我国云南猪体旋毛虫分离株（ＢＳ）经随意扩增的多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）方法产生的２５４ｂｐ条带，以地高辛（ｄｉｇｏｘ－ｉｎｉｎ）标记制成探针（Ｔｓ２５４），将此探针与７株旋毛虫总ＤＮＡ进行斑点杂交，出现明显的杂交斑点，检出的ＤＮＡ量为１ｎｇ。但与其它相关寄生虫、质粒ｐＢＲ３２２、昆明株小鼠肌肉ＤＮＡ均未出现杂交反应，表明Ｔｓ２５４探针具有一定的特异性和较高的敏感性。将此Ｔｓ２５４ＤＮＡ片段克隆进Ｍ１３ｍｐ１８／１９噬菌体，扩增后，筛选阳性重组子，抽提单链后测序。经Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ序列数据库检索，Ｔｓ２５４序列与真核ＤＮＡ及结构ＲＮＡ序列无有意义的同源性，此旋毛虫ＤＮＡ序列为我国首次报道。     

我国7株旋毛虫基因组DNA的研究

对我国７株旋毛虫基因组ＤＮＡ，采用５种限制性内切酶分析表明，来自猪体的旋毛虫酶谱相似，来自犬、猫体的旋毛虫酶谱相似，而猪体与犬、猫体的旋毛虫酶谱差异明显。同时采用随意扩增的多态ＤＮＡ分析，引物为：５＇ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣ３＇，各分离株显示自己特有带型。比较不同地区猪体或犬、猫体的旋毛虫及同一地区不同宿主的旋毛虫的相似率。提示：地区差异愈大，相似率愈小；宿主亲缘愈远，其相似率愈小。似乎我国旋毛虫可分为两群：一群是猪体旋毛虫，另一群是犬、猫体旋毛虫。     

抗旋毛虫病Ts87 DNA疫苗滴鼻初免—蛋白疫苗加强免疫策略增强免疫保护应答

为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略,本文探讨了Ts87 DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征.分别在第0d以旋毛虫Ts87 DNA疫苗SL7207/pVAX1-Ts87滴鼻初免,第14/28 d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强免疫小鼠,在第35 d攻击感染旋毛虫肌幼虫,第84 d剖杀小鼠,计算减虫率观察免疫保护效果;进行小鼠血清中特异性IgG抗体效价、抗体亚型分析及肠道盥洗液sIgA水平分析,检测脾淋巴细胞增殖反应、脾及颈部淋巴结细胞分泌细胞因子水平.结果显示,DNA疫苗滴鼻初免—重组蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独DNA疫苗滴鼻及单独重组蛋白免疫组,显著提高了减虫率(46.1％);DNA疫苗滴鼻初免和蛋白疫苗加强免疫方式不仅诱导小鼠产生了粘膜免疫应答,同时也诱导了有效的细胞和体液免疫应答,其免疫应答类型是以Th2型为主的混合型Th1/Th2免疫反应.该研究为新型抗旋毛虫病疫苗接种策略的优化提供了实验依据.     

大鼠肝大部切除后热休克处理对热休克蛋白和磷酸酶的影响

目的　研究热休克蛋白 (Hsc70 /Hsp6 8)、酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)在肝再生过程中的生物学作用 ,检测这些大分子在大鼠肝大部切除后热休克处理下的动态变化。　方法　用组织化学、免疫组织化学、Western印迹、酶的原位复性电泳、体视学分析、比色分析等方法。　结果　肝切除和热休克联合处理 (PH - HS)后的0～ 144 h恢复期间 ,ACP有 3个高活性期 (12、36和 96 h) ,AKP有 2个高活性期 (12和 36 h) ,Hsc70 /Hsp6 8有 2个高表达期 (16和 48h) ;PH- HS后 ACP和 AKP活性增强与 140～ 180 k D的酶活性增加有关。与只进行热休克 (HS) (44℃ ,30 min)处理或与只进行 2 /3肝切除 (PH)后恢复期间 Hsc70 /Hsp6 8含量和磷酸酶活性动态变化的比较表明 ,PH- HS对 Hsc70 /Hsp6 8含量和磷酸酶活性的影响可持续 12 0 h;PH- HS中的 PH能略微降低 ACP和 AKP活性 ,减少 HS诱导肝细胞合成 Hsc70 /Hsp6 8的量 ;PH- HS中的 HS处理能抑制 PH诱导的 Hsc70 /Hsp6 8表达和推迟 ACP活性高峰出现的时间。　结论　 ACP、AKP和 Hsc70 /Hsp6 8均在肝细胞的 HS反应和肝再生中起作用 ,其中 ,ACP可能在启动肝再生中起重要作用 ,AKP和 Hsc70 /Hsp6 8可能在 DNA合成和细胞分裂中起重要作用