不同钛表面对人牙周膜细胞功能和细胞周期的影响

目的:比较人牙周膜细胞在钛酸碱处理表面和钛类骨磷灰石表面的分布、功能和细胞周期,明确钛表面对细胞牛理活动的影响.方法:人牙周膜细胞原代培养,将第4代人牙周膜细胞分别接种于酸碱处理和类骨磷灰石处理的2种钛表面培养,检其形态、增殖情况、碱性磷酸酶活性、细胞周期等.结果:人牙周膜细胞在2种粗糙的钛表面增殖曲线相似,细胞增殖指数接近,都有成骨功能表现,其中类骨磷灰石组尤其明显.结论:钛表面成分影响细胞功能,富含PO49-、Ca2+的表面可增强人牙周膜细胞矿化功能.     

改良喷砂表面处理对钛牙种植体骨结合的组织学作用

研究改良喷砂表面处理对钛牙种植体骨结合的影响。方法柱状纯钛种色植分两组（光滑表面和改良喷砂表面组）进行表面处理,植于狗后肢股骨内侧髁,分别于2、4、12周取材、固定、脱钙后常规HE染色,光镜观察。结果：改良喷砂表面组与光滑表面组的骨愈合过程,均为膜内成骨,并形成完全的骨结合。二者的差别主要表现在愈合的早期（割周）,改良喷砂表面组界面成骨较快,愈合中晚期差别不明显。结论：改良喷砂表面处理可以加快钛牙种植体的骨结合速度。     

粗化处理对新型骨植入钛合金的生物相容性影响

目的研究国内新研制的骨植入钛合金TZS进行喷砂并酸蚀处理对成骨细胞生物学行为的影响。方法采用SD大鼠体外原代培养方法培养成骨细胞,并将细胞分别接种于新型钛合金（ 光滑表面）及表面处理的材料表面,建立体外共同培养模型。采用MTT比色法检测第3天成骨细胞的增殖率,扫描电镜（ SEM）观察细胞形态学变化,培养第5天进行细胞碱性磷酸酶功能活性检测。结果喷砂与酸蚀处理组表面的成骨细胞,在3 d时的细胞增殖率与光滑组比较有统计学差异（ P<0.05）;5 d时的处理组碱性磷酸酶活性检测值与光滑组比较无统计学差异（ P>0.05）;SEM观察成骨细胞在喷砂与酸蚀组表面具有典型形态特征,伸展良好,具有丰富的板状、丝状伪足,优于光滑组。结论喷砂并酸蚀处理的新型钛合金在体外实验表现为不同程度的促进成骨细胞增殖及功能活性表达。     

微弧氧化纯钛表面对MC3 T3-E 1细胞胶原分泌及成骨基因表达的影响

目的：研究微弧氧化纯钛表面对MC3 T3-E 1细胞胶原分泌和成骨相关基因表达的影响。方法：纯钛圆片分为2个组：微弧氧化组（MAO）和抛光组（PT）,培养板表面（TC）作为对照组。用场发射扫描电镜（FESEM）观察试样表面形态,表面粗糙度仪测量其表面粗糙度。将细胞接种于3组材料表面体外培养,培养第12天用粘胶纤维红染色检测细胞胶原分泌,第16天RT-PCR检测细胞成骨相关基因表达。结果：纯钛表面经微弧氧化处理后形成一层多孔氧化层,表面粗糙度增加（P＜0．01）。细胞在MAO组试件表面的胶原分泌高于PT或TC组表面（P＜0．05）。细胞在MAO组试件表面OSX、COL-Iα1及OPN基因的表达均稍高于PT表面。结论：相比于纯钛抛光表面,微弧氧化纯钛表面更能促进MC3 T3-E 1细胞胶原分泌。     

3种烤瓷基底合金对人牙周膜干细胞增殖和骨相分化的影响

目的：通过测定人牙周膜干细胞（hPDLSCs）在3种不同金属基底提取液培养过程中的增殖和骨相分化能力,比较3种金属基底冠对牙周组织的影响。方法：在人牙周膜干细胞体外培养系统中分别加入镍铬合金、钴铬合金、纯钛浸泡后提取液,常规进行培养及成骨分化诱导,分别测定并比较各组干细胞增殖能力及成骨分化能力。结果：纯钛提取液组人牙周膜干细胞增殖能力和成骨分化能力明显高于镍铬合金组和钴铬合金组（P〈O．05）,差异有统计学意义,与空白对照组相比无明显差异。镍铬合金组与钴铬合金组相比无明显差别,差异无统计学意义。结论：镍铬合金和钴铬合金非贵金属组可降低人牙周膜干细胞增殖和成骨分化能力,而纯钛材料对其影响不大,提示纯钛合金的良好生物相容性。     

表面纳米形貌对牙周膜干细胞衰老的作用研究

目的 探讨二氧化钛纳米管形貌对衰老牙周膜干细胞分化能力的影响。方法 利用阳极氧化法,分别于20、70 V电压下制备出2种具有二氧化钛纳米管形貌的钛片（20V-NT、70V-NT）,观察其表面形貌特征。在成骨诱导条件下培养年轻牙周膜干细胞,挑选具有促进成骨分化作用的表面形貌。用RO3306和Nutlin-3a诱导年轻牙周膜干细胞衰老,获得衰老的牙周膜干细胞。诱导衰老牙周膜干细胞成骨分化,观察表面形貌对衰老牙周膜干细胞成骨分化的影响。结果 阳极氧化法可在钛片表面形成纳米管形貌,且纳米管直径随电压的增大而增大;不同直径纳米管形貌对年轻牙周膜干细胞成骨分化的影响存在较大差异,20V-NT表面纳米形貌促成骨分化效果更明显。与光滑钛片相比,20V-NT表面纳米形貌提高了衰老牙周膜干细胞碱性磷酸酶阳性数量,促进了钙沉积以及成骨标志性基因Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙素的表达。结论特定的表面纳米形貌能增强衰老牙周膜干细胞的分化能力,为牙周再生和进一步提高种植体的性能提供了一种有效方法。     

流体剪切力作用下喷砂酸碱处理钛表面对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白mRNA表达的影响

目的探讨流体剪切力及喷砂酸碱处理钛表面在不同时相对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响。方法制备抛光处理纯钛钛片(P组)、喷砂酸碱处理纯钛钛片(S组),取新生第一天SD大鼠颅骨进行原代成骨细胞培养并分别接种于玻片(G组)、P组钛片、S组钛片表面,培养72h后,置于流体加载系统中,在0dynes/cm2(静止组)和12dynes/cm2(受力组)大小的流体剪切力下分别作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h,通过实时荧光定量聚合酶链反应检测低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor-relat-ed protein5,LRP5)和β-连环蛋白(β-catenin)的mRNA表达变化。结果 3种表面受力组LRP5和β-catenin的mRNA表达水平均比静止组高(P<0.05)。LRP5的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时G组在1h、P组和S组在0.5h时LRP5的mRNA表达量达到最高峰。β-catenin的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时表达量最高峰在3种表面均出现在0.5h。结论适宜大小的流体剪切力以及喷砂酸碱处理钛表面均能促进成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活,并且喷砂-酸碱处理钛表面提高了成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路对流体剪切力刺激的敏感性。     

炎症微环境下芦丁对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究芦丁（rutin）对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 采用有限稀释法分离纯化获得牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定牙周膜干细胞。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激牙周膜干细胞,建立体外炎症模型。实验分为4组,第1组使用α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第2组使用含有脂多糖的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第3组在含有脂多糖的α-MEM培养基加入芦丁培养牙周膜干细胞,第4组使用含有芦丁的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞。通过碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测试、茜素红染色、RT-PCR以及蛋白免疫印迹等方法检测成骨分化能力的改变。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析。结果 CCK-8和碱性磷酸酶活性测试结果显示,10 μmol/L芦丁对炎症状态下牙周干细胞增殖和成骨分化作用最明显。碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,10 μmol/L芦丁可以改善炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。RT-PCR、蛋白免疫印迹结果显示,芦丁可以增强炎症状态下COL1、ALP、RUNX2等成骨基因和成骨蛋白的表达。结论 芦丁可以增强炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

成骨生长肽对纯钛表面成骨细胞样细胞增殖和分化的影响

目的探讨成骨生长肽（osteogenic growth peptide,OGP）涂层对纯钛表面新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞增殖和分化的影响。方法实验分为纯钛组（Cp-Ti组）、碱-热水陈化处理组（AW-Ti组）和碱热处理-OGP涂层组（OGP-Ti组）,将体外培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞接种于3组钛片表面,进行细胞培养,第1、3、5、7天通过四甲基偶氮唑盐光密度值检测法测定细胞在材料表面的增值情况,培养第7、11、15天通过检测碱性磷酸酶活性测定细胞在材料表面的分化成熟情况。结果培养第1、3、5、7天,AW-Ti组和OGP-Ti组的细胞光密度值均高于Cp-Ti组（P〈0.05）;培养第1、5、7天,OGP-Ti组细胞光密度值均高于AW-Ti组（P〈0.05）。培养7、11、15 d后,AW-Ti组和OGP-Ti组的ALP活性均高于Cp-Ti组（P〈0.05）;培养7 d时,AW-Ti组和OGP-Ti组ALP活性差异无统计学意义（P〉0.05）;培养11、15 d时,OGP-Ti组的ALP活性均高于AW-Ti组（P〈0.05）。结论钛表面OGP涂层具有良好的生物相容性,能够提高其表面生物学活性。     

微纳复合结构对成纤维细胞黏附增殖的影响

目的：探讨经不同方法处理后的纯钛表面对成纤维细胞黏附增殖的影响。方法：将36个试件分平均为3组：机械抛光组（A组）;喷砂酸蚀组（B组）;喷砂酸蚀碱热组（C组）,每组均12个试件。通过扫描电子显微镜（SEM）观察分析3组试件表面微观结构和细胞在试件表面的铺展情况,激光共聚焦显微镜（CLSM）检测各试件表面的粗糙度;运用CCK-8试剂盒在450 nm波长下检测各试件对成纤维细胞（ L929）黏附与增殖的吸光度值（ OD值）。结果：A组表面光滑,试件表面成纤维细胞骨架大多呈梭形铺展,伸展较差;B组和C组表面粗糙,且C组表面可见微纳复合结构,试件表面成纤维细胞骨架呈三维空间向铺展,表面黏附成纤维细胞数量明显多于A组和B组。观察第1,3,5 d试件表面细胞增殖情况,可见粗糙表面较光滑表面更利于成纤维细胞的增殖。结论：喷砂酸蚀碱热方法处理后的纯钛表面形成微米-纳米复合孔洞,表面活性好,促进成纤维细胞早期黏附及表面铺展,且不抑制细胞的增殖。     

人CD146＋牙周膜干细胞的分选及其干细胞特性的鉴定

目的：通过酶消化法及流式细胞分选技术分选CD146＋牙周膜干细胞（Periodontal ligament cells,PDLCs）,探讨其干细胞特性。方法：采用流式细胞技术从人牙周膜细胞中分选CD146＋PDLCs,并对其进行免疫组化染色（角蛋白、波形丝蛋白及Stro-1）,成骨、成脂诱导分化及克隆形成实验鉴定其干细胞特性。结果：CD146＋PDLCs表达波形丝蛋白及Stro-1,具有成骨及成脂分化能力,体外培养能形成细胞克隆。结论：以CD146为分选指标的流式细胞分选技术可作为牙周膜干细胞筛选的方法。     

Sirtuin 1促进牙周膜干细胞骨向分化的实验研究

目的：研究蛋白酶Sirtuin 1在牙周膜干细胞骨向分化中的作用。方法：筛选人因正畸而拔除的前磨牙,获取牙周膜组织做细胞培养,并行牙周膜干细胞鉴定;实验分为实验组、对照组。实验组1：加入Sirtuin 1激活剂白藜芦醇使其工作浓度为1、5、10mmol/L。实验组2：加入Sirtuin 1抑制剂烟酰胺使其终末工作浓度为1、5、10mmol/L,对照组为空白对照。获取培养细胞后半定量RT-PCR检测Sirtuin 1和各组细胞骨向分化标志物,即碱性磷酸酶,骨桥蛋白,骨钙蛋白和骨涎蛋白。结果：通过检测牙周膜干细胞的蛋白酶Sirtuin 1和骨向分化标志物,即碱性磷酸酶,骨桥蛋白,骨钙蛋白和骨涎蛋白的mRNA含量,显示随着加入白芦藜醇剂量的差异而出现梯度的上调;而随着烟酰胺的浓度的升高而出现梯度的下调。结论：Sirtuin 1可以有效的促进牙周膜干细胞的骨向分化,从而促进牙槽骨再生修复重建,具有良好的临床应用前景。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的 人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

目的：探讨淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响,为淫羊藿苷在治疗牙周病方面的应用提供一定依据。方法：体外培养人牙周膜细胞,矿化诱导条件下将第3代细胞与10～0.001mg/L,6个浓度的淫羊藿苷作用,通过噻唑蓝（MTT）比色法、ALP活性测定及BSP表达水平,反应其对人牙周膜细胞增殖及分化的影响。结果：作用24h,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用48h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用72h,0.1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）,10mg/L组抑制人牙周膜增殖（P〈0.05）;作用72h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜碱性磷酸酶（ALP）活性（P〈0.05）;作用72h,0.1～0.001mg/L组的BSP表达水平较对照组显著增加（P〈0.05）。结论：淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞增殖及骨向分化。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films

Objective

The therapeutic potential of periodontal ligament cells for periodontal regeneration gradually decreases when cultured as a monolayer in vitro. Three‐dimensional cell culture models provide an alternative to traditional monolayer cell culture. This study aimed to comparatively evaluate the influence of spheroid culture on periodontal ligament cells.

Materials and Methods

Chitosan films were used to culture three‐dimensional periodontal ligament cell spheroids. The proliferation, self‐renewal, and osteogenic capacity of periodontal ligament cells derived from spheroids were evaluated and compared with cells cultured on a monolayer.

Results

Viable spheroids of periodontal ligament cells were formed on chitosan films. Compared to monolayer cell culture, periodontal ligament cells exhibited decreased proliferation upon spheroid formation. In contrast, their expression of genes related to self‐renewal was significantly higher comparison with cells cultured in a monolayer. Moreover, the formation of periodontal ligament cell spheroids increased their colony‐forming unit ability and osteogenic differentiation capacity.

Conclusion

The results demonstrate the successful use of chitosan films for the culture of periodontal ligament cell spheroids. Compared to cells cultured in monolayer, periodontal ligament cells in spheroids did not proliferate, but exhibited higher self‐renewal gene expression, colony‐forming unit and osteogenic capacity.     

人乳牙牙周膜干细胞的生物学特性研究

目的:体外分离纯化人乳牙牙周膜组织来源的干细胞,研究其生物学特性、表面标记物及多向分化能力。方法:用酶消化法和有限稀释法对正常人乳牙牙周膜组织进行原代培养,并通过免疫细胞化学方法和流式细胞仪对其来源进行鉴定,进而从增殖能力、克隆形成能力和多向分化能力等方面对乳牙牙周膜干细胞的生物学特性进行研究。结果:分离培养获得的人乳牙牙周膜干细胞在形态上与恒牙牙周膜干细胞相似,均为长梭形成纤维细胞样;免疫细胞化学和流式细胞仪分子表型鉴定显示乳牙牙周膜干细胞阳性表达间充质来源的表面标志STRO-1,CD146,CD29和CD90,造血系来源的标志物CD34为阴性;细胞周期,MTT和克隆形成率的检测结果显示,人乳牙牙周膜干细胞的增殖能力强于恒牙牙周膜干细胞;人乳牙牙周膜干细胞在体外诱导条件下可以向骨,脂肪细胞方向分化;同时RT-PCR检测发现,矿化诱导后细胞成骨相关基因(ALP,OCN,Col I)的表达上调,成脂诱导后细胞成脂相关基因(PPAR-γ,C/EBPα)的表达上调。结论:人乳牙牙周膜中确实存在间充质来源的干细胞,并且具有较强的增殖能力和多向分化能力,为牙周组织工程种子细胞提供了新的可能来源。