人乳头状瘤病毒16型E6、E7基因转染的人宫颈上皮永生化细胞系的建立及鉴定

目的 建立HPV16 E6、E7基因转染的胎儿宫颈上皮永生化细胞系，为体外研究宫颈上皮HPV感染及其癌变机制提供模型。方法 探索胎儿宫颈上皮细胞原代培养的方法，用逆转录病毒法将HPVl6E6、E7基因转染原代培养的胎儿宫颈上皮细胞，筛选出稳定表达的细胞系，进行传代培养；应用RT-PCR检测细胞中HPV16E6、E7基因的表达，用绘制细胞生长曲线、形态学观察、软琼脂集落形成实验、流式细胞术、Transwell Insert体外侵袭实验和裸鼠成瘤实验等方法对永生化的胎儿宫颈上皮细胞进行鉴定。结果 采用组织块培养法。选用Ker-SFM无血清培养基培养出纯度和生长状态良好的胎儿宫颈上皮原代细胞，可以利用高滴度的逆转录病毒作为载体，感染原代细胞，成功地建立一株永生化的胎儿宫颈上皮细胞系。永生化的细胞仍呈多边形，角蛋白阳性，仍维持上皮细胞表型，雌、孕激素受体阴性，染色体核型发生明显变化，但目前尚无软琼脂集落形成能力、不能穿过Matrigel基底膜，不能在裸鼠体内形成肿瘤。结论 转染HPV16E6、E7基因能使胎儿宫颈上皮细胞永生化，永生化细胞仍维持上皮细胞表型，染色体核型发生明显变化，但尚未完全恶性转化。     

卵巢肉瘤样癌细胞系的生物学特性及对化疗药物的敏感性

目的 研究人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系BUPH；OVSC-2的生物学特性，筛选卵巢肉瘤样癌敏感的化疗药物。方法 以手术切除的卵巢肉瘤样癌腹壁转移组织为材料，进行体外培养。将永生化基因——SV40T抗原基因转染第10代细胞，经筛选，抗性克隆扩大培养，得到人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、双层软琼脂培养、裸鼠接种、免疫组化等，研究其生物学特性。用MTT的方法检测该细胞系对顺铂、阿霉素、足叶乙甙、拓扑替康四种化疗药物的敏感性。结果 人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系，BUPH：OVSC-2，现已传至100余代。其生物学特性为，形态学观察细胞呈肉瘤样细胞形态，超微结构证实为上皮起源；细胞生长旺盛；具有恶性细胞的特征，恶性度高。该细胞在体外对阿霉素和顺铂非常敏感，对足叶乙甙尚敏感，对拓扑替康不敏感。结论 BUPH：OVSC-2为一株恶性度高的人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系，保留了其来源细胞的生物学特性，阿霉素与顺铂联合治疗可能是卵巢肉瘤样癌较敏感的化疗方案。     

腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的构建及应用

目的　为了了解人乳头状瘤病毒 (Humanpapillomavirus ,HPV) 1 6型的E6 /E7基因在细胞恶性转化中所起的作用 ,利用腺病毒伴随病毒载体 (AAVHelper -FreeSystem)构建和表达人乳头状瘤病毒 1 6型E6 /E7基因。方法　在pLXSN1 6E6E7质粒中经PCR扩增回收HPV 1 6E6E7基因片段 ,连接于T载体上进行测序 ,将正确的HPV 1 6E6E7插入pAAV -IRES -hrGFP质粒 ,协同pAAV -RC质粒和pHelper质粒共转染HEK 2 93细胞 ,包装表达HPV 1 6E6E7基因的重组腺病毒伴随病毒 ,收获病毒 ,并检测病毒的感染效率。结果　在包装细胞系HEK 2 93细胞中能形成较高感染效率的腺病毒伴随病毒 ,激光共聚焦检测可发现HEK 2 93细胞内有绿色荧光蛋白表达 ,HEK 2 93细胞经PCR可扩增出特异性的HPV 1 6E6E7基因片段 ,经流式细胞仪检测重组病毒的感染效率为71 3%。结论　携带人乳头状瘤病毒 1 6型E6E7基因的腺病毒伴随病毒可感染细胞 ,并在细胞内表达 ,可望用于宫颈癌病因学的研究     

γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系作用的研究

目的:研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系以及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的作用,探讨DAPT临床治疗宫颈癌的可行性。方法:体外培养宫颈癌Siha、HeLa细胞系和HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系(CRL2614)。加入不同浓度的γ-分泌酶抑制剂DAPT,不同时间点终止细胞生长,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色方法检测细胞生长情况;使用流式细胞计数仪检测细胞增殖周期中增殖指数(PI)、S期细胞比例(SPF)和凋亡细胞百分比。结果:应用MTT法检测细胞生长情况,5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系72h,可显著抑制其生长(P均0.05)。10μmol/LDAPT对CRL2614细胞系作用72h无抑制作用(P0.05)。流式细胞计数仪检测细胞增殖周期及细胞凋亡百分比。用5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系24,48,72h均可见SPF、PI明显降低,凋亡细胞百分比明显增加(P均0.05)。10μmol/LDAPT作用CRL2614细胞系72h对SPF、PI及凋亡细胞百分比无影响(P0.05)。结论:DAPT能抑制宫颈癌HeLa、Siha细胞系增殖,促进肿瘤细胞凋亡,对HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的增殖和凋亡没有明显影响。DAPT可能为药物治疗宫颈癌提供新思路。     

人乳头状瘤病毒E6、E7蛋白与机体免疫机制的关系

机体感染人类乳头状瘤病毒(human papollomavirus,HPV)后,80%以上会在9～16个月内自然消退,只有10%～15%的高危型HPV持续感染宫颈上皮,并最终发展为宫颈癌[1].HPV E6、E7等基因编码蛋白可以激活全身和局部的免疫反应,消除病原体.本文就HPV E6、E7蛋白的致病机制和在治疗性疫苗中的应用,及其在体内引起的以细胞免疫反应为主的全身及局部反应作一综述.     

HPV整合宫颈上皮细胞机制的研究进展

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,持续性高危型HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV与宿主细胞染色体的整合是宫颈细胞永生化过程中的重要步骤,是导致宫颈上皮内瘤变向宫颈癌恶性进展的一个重要标志。HPV黏附、穿入宫颈上皮细胞直至癌变是一个漫长而复杂的过程,其如何进入宿主细胞发挥有效感染,具体机制仍不清楚。本文就HPV识别、粘附宫颈上皮细胞、依赖可能转运途径穿膜入胞及进一步整合至宿主细胞染色体的相关机制研究进展作一综述。     

TNF-α、E2、E6及E7在不同宫颈病变组织中的表达及其相关性分析

目的：检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）及高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）E2、E6、E7基因在不同宫颈病变组织中的表达并分析其相关性。方法：根据不同病理结果把标本分为HPV阴性正常组,HPV16阳性正常组,HPV16阳性宫颈内瘤变（CIN）Ⅰ～Ⅱ组,HPV16阳性CINⅢ组以及HPV16阳性宫颈腺癌/鳞状细胞癌（CIS/SCC）组。通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法对各组标本进行TNF-α、E2、E6及E7蛋白的检测,并对检测结果进行统计学分析。结果：HPV E6、E7基因在不同宫颈病变中的表达逐渐升高,且E7的逐级升高趋势更显著,E2升高至CINⅡ后出现下降,而TNF-α在不同宫颈病变中的表达虽呈升高趋势,但在宫颈浸润癌中与CINⅢ组中表达差异无统计学意义。结论：用E2/E7的比值来预测或诊断高度宫颈病变程度可能更准确。炎症因子TNF-α的升高可能加重了HPV E2基因的破坏,使得HR-HPV E6、E7癌基因过度表达,从而促进宫颈癌发生。     

人子宫内膜异位症异位腺上皮永生化细胞系的建立

目的:建立人子宫内膜异位症(EMs)的异位腺上皮永生化细胞系,为进一步深入研究EMs奠定基础。方法:取人EMs异位病灶组织进行原代培养,用质粒PCD2SV40T转染原代细胞,G418筛选14天后获得抗性克隆。将抗性克隆传代培养,用免疫细胞化学、RT-PCR、细胞计数、核型分析及裸鼠成瘤实验等对细胞系进行鉴定。结果:建立了一株传代超过50代的永生化细胞系,命名为hEM5B2。该细胞系具有腺上皮细胞形态,细胞角蛋白与波形蛋白阳性,抗成纤维细胞抗体阴性,雌激素受体α和β亚型(ER-α,ER-β)及孕激素受体(PR)阳性,细胞倍增时间64.8h。核型分析显示,染色体众数为78～123,为多倍体核型;观察1个月裸鼠成瘤实验显示未成瘤。结论:hEM5B2细胞系是一株人EMs异位腺上皮永生化细胞系,可作为细胞模型用于EMs的体外实验研究。     

SV40 T基因诱导的人卵巢癌细胞永生化

目的 建立人卵巢癌永生化细胞系，为卵巢癌体外研究提供实验模型。方法 利用基因重组技术构建猴肾病毒40（SV40）T抗原基因的高效真核表达载体pcD2-SV40。将其转染10例原代培养的早期传代细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养，建立永生化细胞系。免疫组化检测细胞的上皮起源，用PCR、RT－PCR和Southern Blot方法鉴定SV40 T基因在转染细胞中的表达。观察所建立的永生化细胞系的染色体核型。结果 10例转染细胞中，6例筛选出抗性克隆。角蛋白免疫组化证实3例为上皮起源。其中2例上皮起源细胞得以扩大培养成系，长期稳定传代，分别命名为BUPH：OVSC－2和BUPH：OVCA－3。经鉴定两种细胞系中存在SV40 T在基因水平及转录水平的表达。其染色体核型均符合人体恶性细胞特征。结论 利用SV40T抗原基因进行人卵巢癌原代细胞的 生化是一种可行的、可重复的建系方法，可提高卵巢癌细胞成系机率。     

干扰素α-2b对宫颈癌细胞HPV16 E6E7基因抑制作用的研究

目的研究干扰素α-2b对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用，从细胞生物学及分子生物学水平探讨干扰素α-2b对宫颈癌细胞SiHa的作用机制。应用RT-PCR半定量检测细胞内HPV16 E6E7 mRNA表达，观察干扰素α-2b对宫颈癌SiHa细胞中HPV16 E6E7 mRNA表达的影响。方法以不同浓度的人重组干扰素α-2b含药培养液作用于感染HPV16的人宫颈癌细胞系——SiHa细胞，并设立无药对照，通过MTT及流式细胞分析技术检测该药对细胞生长及增殖的影响；进行细胞凋亡检测并用RT—PCR法半定量检测对HPV16 E6E7基因表达的影响。结果经含有干扰素α-2b的培养液作用后，细胞数量减少，1000IU／ml的干扰素α-2b对细胞抑制作用最强；细胞周期各时相中，S期细胞所占比例明显减少；均可诱导细胞凋亡；均使细胞中HPV16 E6E7mRNA表达明显减少。结论干扰素α-2b不仅可直接抑制宫颈癌细胞的生长，并可能通过抑制HPV16 E6E7基因表达的分子机制，达到抑制肿瘤目的。     

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。     

IgG antibodies against human papillomavirus type 16 E7 proteins in cervicovaginal washing fluid from patients with cervical neoplasia

Abstract. Tjiong MY, ter Schegget J, Tjong-a-Hung SP, Out TA, van der Vange N, Burger MPM, Struyk L. IgG antibodies against human papillomavirus type 16 E7 proteins in cervicovaginal washing fluid from patients with cervical neoplasia.
Little information is available about the cervicovaginal mucosal antibodies against human papillomavirus (HPV) proteins. In this study specific IgG antibodies against HPV 16 E7 protein were determined in paired samples of cervicovaginal washing fluid and serum from patients with cervical cancer ( n = 22), cervical intraepithelial neoplasia (CIN) ( n = 38), healthy individuals ( n = 22), and serum from children ( n = 41) by a radioactive immunoprecipitation assay (RIPA). HPV 16 E7 specific IgG antibodies were found in cervicovaginal washings ( n = 8) and in sera ( n = 8) of the patients with cervical cancer. About 60% of the patients with HPV 16 positive cervical cancer had HPV 16 E7 specific IgG antibodies. Titration studies showed that the IgG antibody reactivity in cervicovaginal washings was higher than in the paired serum samples of six patients with cervical cancer ( P < 0.001). In the CIN group we found no IgG reactivity in the serum, but in five patients we found a low IgG reactivity in the cervicovaginal washings. No IgG reactivity was found in cervicovaginal washings and sera from healthy individuals and sera from children. HPV 16 E7 specific IgG antibodies seem to be locally produced in a number of patients with HPV 16 positive (pre)malignant cervical lesions. For more definitive evidence for the local production of these antibodies immunostaining should be performed to demonstrate the presence of specific anti-HPV 16 E7 IgG producing plasma cells in the cervical epithelium.     

新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变HPV16 E6/E7基因突变序列分析

目的:探讨新疆南部地区维吾尔族妇女HPV16E6/E7基因突变与宫颈病变及宫颈癌发生的关系。方法:提取上述地区40例宫颈癌及80例CINⅠ～Ⅲ组织的HPV16DNA,用PCR扩增其E6/E7基因并对产物测序,然后以德国标准株HPV16DNA为原型进行对比,分析其突变情况。结果:HPV16E6突变中L83V占80.6%(25/31),D25E占16.1%(5/31),E7突变中R77C占33.3%(5/15),N29S占26.7%(4/15)。结论:新疆宫颈病变及其癌变组织中HPV16E6/E7以L83V,D25E,R77C,N29S为主要突变株,欧洲型突变为主,与亚洲型突变同时出现是该地区的主要突变特点。     

子宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16 E6 mRNA表达与survivin蛋白表达的相关性

目的探讨宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒(HPV)16E6mRNA表达与survivin蛋白表达的相关性。方法采用半定量PCR技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法,检测慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌共148例患者宫颈组织中HPV16E6mRNA及survivin蛋白的表达。结果148例患者中,HPV16阳性共37例,其中慢性宫颈炎5例、CINⅠ6例、CINⅡ～Ⅲ11例及宫颈癌15例。慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织中,HPV16E6mRNA的表达水平分别为0.3±0.4、0.6±0.4、1.8±0.6及2.4±0.6;survivin蛋白阳性表达率分别为7%、31%、63%及84%。CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织中,HPV16E6mRNA的表达水平及survivin蛋白阳性表达率均显著高于慢性宫颈炎及CINⅠ组织,两者比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。宫颈癌组织中,HPV16E6mRNA的表达水平与survivin蛋白阳性表达率呈显著正相关关系(γs=0.62,P<0.05)。结论HPV16E6mRNA的表达水平与宫颈病变的进展有关,survivin蛋白阳性表达率升高可能与宫颈癌的发生、发展密切相关。     

HPV16/18E6蛋白和PKR/p-PKR在宫颈病变的表达及意义

目的:探讨宫颈病变组织HPV16/18感染对蛋白激酶R(PKR)激活的影响及两者在宫颈癌形成、演进过程中的作用和对宫颈癌患者预后的影响。方法:用免疫组化SP法检测HPV16/18型E6蛋白(E6)、PKR、磷酸化型PKR(p-PKR)在63例宫颈癌、114例宫颈上皮内瘤样病变(CINⅠ~Ⅲ)、15例正常宫颈组织的表达。结果:E6蛋白与PKR在各组的阳性表达率与宫颈病变级别呈正相关(P<0.05,P<0.05),E6蛋白与PKR在各组的阳性表达率呈正相关(P<0.05);宫颈癌组PKR阳性表达率明显高于p-PKR(P<0.01);E6、PKR阳性表达率与肿瘤大小有关(P<0.05,P<0.05);宫颈癌患者病情进展与临床分期显著相关(P<0.01),病情进展与E6、p-PKR阳性表达率相关(P<0.05,P<0.05)。结论:HPV16/18感染可阻碍PKR激活,突破机体防御HPV16/18感染的机制,在宫颈癌的发生及演进过程中可能起了重要作用,对宫颈癌患者预后不利;p-PKR能抑制宫颈癌患者病情进展,可能改善其预后。     

Rapid dysplastic transformation of human genital cells by human papillomavirus type 18

This study delineates differences in biologic activity between human papillomavirus (HPV) types 16 and 18. Human cervical and foreskin epithelial cells were cultured and transfected with recombinant HPV-16 and -18 DNA, resulting in immortalized cell lines. Normal epithelial cells as well as HPV-16 and -18 immortalized cells of both early passages (less than 40 population doublings) and late passages (greater than 180 population doublings) were transplanted in athymic mice. Normal squamous cells formed well-stratified epithelium, while HPV immortalized cells developed either normal-appearing epithelium or typical dysplastic changes. Dysplastic changes were seen in none of the 13 grafts with early-passage HPV-16 cell lines, while 9 of 14 grafts with early-passage HPV-18 cell lines developed dysplasias (P less than 0.0004). These results support previous clinical observations suggesting that HPV-18 may be associated with a more aggressive and rapidly progressive form of cervical neoplasia.