成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养与鉴定

目的 探索一种简便、经济实用的获得成年大鼠嗅鞘细胞的方法.方法 无菌条件下取2.5月龄的SD大鼠嗅球最外二层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养.定期进行形态学观察并摄片.在培养第14 d行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度.结果 培养的嗅鞘细胞呈双极、多突起形、扁圆形三种,其中扁圆形较少,嗅鞘细胞的纯度在90%以上.结论 差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠嗅鞘细胞原代培养是一种简便经济实用的方法,可获得高纯度的嗅鞘细胞.     

新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及形态学观察

目的探讨新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及纯化方法，并对其形态学特征进行观察。方法分离培养新生大鼠嗅球中的嗅鞘细胞，联合应用差速贴壁法和阿糖胞苷抑制法进行纯化，NGFRp^75免疫组化染色鉴定细胞。结果可获得较高纯度的嗅鞘细胞，其形态主要为双极、多极和无突起的“油煎蛋”形，细胞突起细长并交织成网状。结论该方法步骤简便，可重复性好，具有较高的实用价值。     

大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分裂增殖和免疫细胞化学特性

目的:体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs),观察其形态、分裂增殖和免疫细胞化学特性,探索自体嗅黏膜嗅鞘细胞作为OECs来源的可能性。方法:采用差时贴壁的方法分离培养成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞,相差显微镜下观察细胞形态和分裂增殖;用免疫组化方法观察GFAP、NGFRp75、S鄄100、NGF、BDNF、NT鄄3的表达。结果:培养的细胞根据形态来分,可分为双极、多极和偏平状;细胞分裂时先回缩成球形,分裂成两个子球,再伸出突起,变成梭形或多极形。GFAP、NGFRp75、S鄄100、BDNF和NT鄄3表达阳性。结论:在含血清培养基上,大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞能正常分裂增殖和分泌神经营养因子。     

嗅鞘细胞的研究现状

嗅鞘细胞(OECs)直接起源于嗅基板,分布在嗅上皮、嗅神经和嗅球的第一、二层. 体外培养时,嗅鞘细胞按其形态可分为:梭形、多突起形、油煎蛋形.嗅球浅2层细胞存在以上三种形态,其中以梭形细胞最多.嗅黏膜细胞则以梭形细胞更为多见,并具更细长的突起.     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

嗅鞘细胞移植到大鼠损伤脊髓前后的形态学研究

目的:观察体外培养和植入损伤脊髓的自发绿色荧光嗅鞘细胞(Green fluorescent protein-olfactory ensheathing cells,GFP-OECs)的形态结构特征,研究绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)及脊髓损伤的病理环境对其形态的影响.方法:用酶消化法分离培养来自2.5月龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠嗅球最外层的嗅鞘细胞,对培养细胞定期进行光镜、电镜及激光共聚焦显微镜观察并摄片,观察其在体外培养的形态特征.培养第10d,用显微外科技术将嗅鞘细胞移植到脊髓挫伤后的T10节段,分别在移植术后7、15 d取材,观察细胞植入损伤脊髓后光电镜下形态.结果:GFP-OECs在荧光显微镜下呈绿色强荧光,培养第7 d,为双极样(梭形或纺锤形)、三极样和扁圆形3种典型的细胞形态,以双极梭形为主;培养第10d,细胞形态为梭形,植入损伤脊髓后,移植细胞胞体呈长梭形,一端突起细长,与另一嗅鞘细胞接触,呈条索状生长.电镜下嗅鞘细胞核不规则,胞质内有丰富的粗面内质网、游离核糖体及线粒体.结论:GFP不影响嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells,OECs)形态.在脊髓损伤处,OECs胞体呈长梭形,突起细长,与培养10d移植时比较,形态无显著改变,早期脊髓损伤病理环境不影响GFP-OECs形态.     

新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

目的：嗅鞘细胞移植入大鼠脑出血模型后,观察偏瘫大鼠功能恢复以及移植细胞后30 d内的形态学变化。方法：差速贴壁法培养出高纯度的嗅鞘细胞,制作38只大鼠脑出血模型,分三组：第1组10只为空白组,第2组10只为HBSS移植组,第3组18只为嗅鞘细胞移植组;三组大鼠分别在术后3 d、7 d、14 d和30 d用forelimb placing方法进行评分,判断嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血模型的作用。结果：hoechst示踪及电镜观察结果,均证实嗅鞘细胞能在大鼠体内存活;对三组大鼠进行评分,嗅鞘细胞移植组的功能恢复明显优于其他两组。结论：从成年大鼠嗅黏膜用差速贴壁法能成功培养出嗅鞘细胞,并用于细胞移植,移植细胞能存活;嗅鞘细胞移植能改善大鼠脑出血后偏瘫肢体的功能。     

嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子含量的测定

目的观察嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子(GDNF)的含量随培养时间的变化关系，为选择嗅鞘细胞移植的最佳时间提供理论依据。方法采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅球及嗅粘膜嗅鞘细胞，培养21天，3天留取标本一次，采用ELISA法对上清GDNF进行测定。结果GDNF的含量随培养时间的延长逐渐升高，但绝对含量很低。结论培养的嗅鞘细胞能分泌GDNF，细胞移植在14天以后为宜。     

人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响

目的:观察人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响.方法:取成人(自愿者)鼻腔嗅黏膜,制成细胞悬液,分别用DF12培养基(对照组)、10 ng/ml NGF DF12培养基、10%胎牛血清的DF12培养基、10 ng/ml NGF 10%胎牛血清的DF12培养基、10%人血清的DF12培养基和10 ng/mlNGF 10%人血清的DF12培养基培养细胞,并用差时贴壁法纯化嗅鞘细胞.采用MTT法观察上述各种培养液对嗅鞘细胞增殖的影响.结果:加入与不加入NGF培养液组之间的光密度无统计学意义(P＞0.05);胎牛血清组、人血清组与对照组之间的光密度有显著统计学意义(P＜0.01);胎牛血清组和人血清组之间的光密度无统计学意义(P＞0.05).结论:人嗅鞘细胞的体外培养对血清具有依赖性,人自体血清培养可替代胎牛血清用于嗅鞘细胞的体外培养、扩增.本研究结果为人嗅鞘细胞的自体移植治疗脊髓损伤提供了可行性基础.     

嗅粘膜源性嗅鞘细胞移植联合NGF对脊髓损伤的修复

目的：探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）移植联合神经生长因子(nerve growth factor, NGF)修复脊髓急性损伤的可行性和疗效,并观察二者的协同作用。方法：自成年Wistar大鼠嗅粘膜取材,采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制纯化相结合的方法培养纯化嗅鞘细胞。建立大鼠脊髓半切模型,并随机分成对照组（A组）,OECs组（B组）和OECs＋NGF组（C组）,在不同时段进行肢体活动的BBB评分。8周后取脊髓标本进行组织学检查,评价对脊髓损伤的修复作用。结果：B组和C组2周后BBB评分高于A组（P＜0.05）,C组自4周后明显优于A组和B组（P＜0.01）。组织学检查表明,C组可明显促进轴突再生。结论:OECs联合NGF具有良好的脊髓损伤修复作用,且二者具有明显的协同作用。     

大鼠嗅鞘细胞的纯化及活性检测

目的采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞,并检测嗅鞘细胞的生物活性。方法分离新生7d的SD大鼠嗅球嗅鞘细胞,分组后采用改良的6h和18h两次差速贴壁法联合不同时段（1、3和5min）胰酶消化法纯化培养,观察不同时段纯化的嗅鞘细胞的形态特点及生长情况;应用FITC标记的神经生长因子受体p75抗体（兔抗鼠NGFRp75抗体）检测嗅鞘细胞并评估细胞纯度;应用CCK-8法和酶联免疫吸附法分别检测嗅鞘细胞在纯化后3～15d的增殖活性和分泌脑源性神经营养因子的含量。结果随着细胞的生长,梭形的嗅鞘细胞逐渐增多;改良差速贴壁联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞纯度分别为（57.52±2.13）%、（78.95±2.60）%、（49.01±0.74）%,3min组最明显,组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;改良差速贴壁法联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞在纯化后7、9、11d时增殖的细胞数目和脑源性神经营养因子分泌量显示3min组最优,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论改良差速贴壁（6h＋18h）联合胰酶限时消化3min的纯化方法能获得较高纯度的嗅鞘细胞。     

嗅鞘细胞和骨髓基质细胞的联合培养研究

目的探讨体外联合培养嗅鞘细胞(OECs)和骨髓基质细胞(BMSCs)的可行性及形态学观察。方法将原代培养的OECs和BMSCs消化制成细胞悬液,以相同比例接种,接种密度为104/ml。10 d后将联合培养的细胞置于倒置相差显微镜下进行形态学观察,并于鉴定前2 d加入细胞掺入剂BrdU,应用P75抗体和BrdU抗体对联合培养的细胞进行免疫荧光鉴定。结果联合培养的细胞在24 h内均完全贴壁,培养5 d后镜下可见细胞形态主要有3种:①双极、三极或多极形;②短梭形,突起较短;③扁圆形或不规则形。到第10天时部分细胞相互编织成网,部分细胞生长呈条索状,相互平行。荧光鉴定显示:荧光双标阳性者(既发红色荧光又发绿色荧光)为OECs,只发红色荧光而不发绿色荧光者为BMSCs。结论OECs与BMSCs在体外可以很好的联合培养,生物学特性均保持不变,为体内联合移植奠定了基础。     

大鼠嗅黏膜和嗅球嗅鞘细胞体外分离培养比较

目的:比较大鼠嗅黏膜(olfactory mucosa,OM)和嗅球(olfactory bulb,OB)的嗅鞘细胞(olfactory ensheathingcells,OECs)在体外分离培养中增殖和分化以及生物学特性的差异。方法:取SD大鼠OM和OB用差速贴壁法在体外分离培养OECs,扫描电镜观察两组OECs的形态,并用S-100和p75NGFR免疫荧光抗体双标记检测两组OECs在体外增殖和分化的情况。结果:扫描电镜观察到OM OECs以双极样为主;OB OECs有双极样、三极样和扁圆形3种形态,其中以双极样为主。免疫荧光双标结果显示:OM和OB组均有较多的S-100和p75NGFR双标阳性细胞,OM OECs胞体多为梭形,突起细长;OB OECs的形态多样,有双极样、三极样和扁圆形,胞体呈长梭形、圆形或三角形。两组OECs胞体面积和细胞周长相比较差异均无统计学意义。结论:OM OECs与OB OECs一样都能在体外分离培养与增殖。OM OECs与OB OECs分化成熟后的细胞无明显差异。     

成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的分离、培养、纯化与生物学特性的研究

目的探讨成年大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的分离、培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫细胞化学特性。方法采用原代培养技术,从成年大鼠的嗅球分离培养OECs,用差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体等方法纯化培养OECs,并用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）扩增OECs,倒置相差显微镜下观察OECs的形态变化特点及生长情况,采用GFAP、NGFRp75、S100等抗体行免疫细胞化学染色,根据NGFRp75免疫细胞化学染色结果统计培养的OECs的纯度,并计算OECs的增殖率。结果体外培养的成年大鼠OECs主要为双极或三极细胞,其突起细长。差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法的纯化效率高于其他两种。免疫细胞化学染色显示,培养的成年大鼠OECs呈现GFAP、NGFRp75、S100蛋白染色阳性。bFGF能明显促进OECs的增殖（P〈0.01）,对OECs的形态、纯度没有明显影响。结论差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法是一种高效率的纯化培养OECs的方法,bFGF能明显促进OECs的增殖。     

大鼠嗅球成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞（Olfactory cnsheating cells,OECs）分离与培养的方法。方法：无菌条件下嗅球置于少量人工脑脊液中，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，得片状组织块，胰酶消化，吹打，细胞悬液进行培养。结果：本方法分离、培养的OECs具有双极或多极突起，且突起十分细长，神经生长因子受体和胶质纤维酸性蛋白免疫组化呈阳性。结论：该方法简便易行，为深入研究OECs神经生物学特性、阐明促进中枢神经元轴突生长的作用机制打下基础。