期刊文摘

LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)推定配体分布的研究[许晓光,王春燕,谢鑫,薛江楠,欧阳为明,菅金龙,金伯泉.细胞与分子免疫学杂志,2005;21(5):553-557]目的:研究LAIR-1(CD305)及LAIR-2(CD306)推定配体在多种细胞系上的分布,为鉴定LAIR-1/LAIR-2推定配体提供了实验依据.方法:建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系.以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色,用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达,并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点.结果:LAIR-1推定配体及LAI…     

人重组CD137-Fc分子的构建与真核表达

目的构建人CD137-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人CD137-Fc融合蛋白。方法从cDNA文库中用PCR扩增cD137全长编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgGIFc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，转染293T细胞瞬时表达，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与免疫印迹进行鉴定。结果测序证实构建的CD137与CD137-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实cD137-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与免疫印迹证实其为人cD137-Fc蛋白。结论获得了纯化的hCD137-Fc融合蛋白，为探讨CD137在免疫自稳调节中的地位，以及探索CD137的其它生物学功能奠定了坚实的实验基础     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

血小板第四因子对CD34+白血病细胞系KG1a粘附功能的影响

目的研究血小板第四因子(PF4)对CD34 白血病细胞系KG1a细胞与人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞之间粘附性及对多种粘附分子表达的影响。方法采用粘附实验、粘附阻断实验、MTT染色、半定量RT-PCR、免疫标记流式细胞仪测定等方法。结果穴1雪PF4可以增加KG1a细胞与ECV-304细胞之间的粘附作用。PF4与KG1a及ECV-304细胞同时孵育或与KG1a或ECV-304细胞单独孵育,均使KG1a细胞粘附能力增加。穴2雪抗粘附分子CD49d、CD106、CD54单克隆抗体可显著减少PF4对KG1a粘附的增加作用,而抗粘附分子CD62L、CD62E、CD62P单抗则对PF4的这种增加粘附的作用没有影响。穴3雪在PF4作用的3h内,半定量RT-PCR检测粘附分子CD49d、CD106、CD54mRNA表达水平有不同程度的上调。(4)PF4作用2h后,流式细胞仪分析显示KG1a细胞上的CD49d、ECV-304细胞上的CD54蛋白表达水平显著增加。结论PF4通过上调粘附分子的表达促进KG1a细胞的粘附功能。     

3组癌细胞系中CD37和CD53的表达

目的:观察3组癌细胞系中TM4SF蛋白CD37、CD53的表达.方法:利用Northern blot杂交,观察CD37、CD53 mRNA在人前列腺癌细胞、肺癌细胞和人黑色素瘤细胞3组8种细胞系中的表达.结果和结论:TM4SF蛋白CD37、CD53在前列腺癌细胞、肺癌细胞以及黑色素瘤细胞系中均不表达.     

CXCR4在胶质瘤血管内皮细胞和ECV304细胞中的表达及其意义

目的检测人胶质瘤血管内皮细胞以及体外培养的血管内皮样细胞系ECV304趋化因子受体CXCR4的表达,观察其配体SDF-1对血管内皮样细胞迁移的影响,以探讨趋化因子受体CXCR4在肿瘤血管生成中的可能作用及其机制.方法通过免疫组化方法检测人胶质瘤血管内皮细胞CXCR4蛋白的表达,采用RT-PCR、免疫细胞化学方法检测血管内皮样细胞系ECV304上CXCR4 mRNA和CXCR4蛋白的表达,并采用48孔趋化板观察SDF-1诱导体外培养血管内皮样细胞的迁移作用.结果在胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上均检测到趋化因子受体CXCR4的表达,体外实验显示SDF-1能诱导血管内皮样细胞发生明显的迁移.在30、50 ng/ml的实验浓度范围内,诱导血管内皮样细胞的迁移作用呈明显量效关系.结论胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上存在CXCR4表达,CXCR4激活能诱导内皮细胞的迁移.     

Ephrin-A1、Ephrin-B1融合蛋白的构建、表达和活性测定

目的 克隆并合成Eph受体的两个主要配体ephrin-A1和ephrin-B1的融合蛋白。方法 利用RT-PCR技术，分别扩增了ephrin-A1、ephrin-B1胞外序列和小鼠IgG2b的Fc序列，将其连接后，插入pAlterMax表达载体，得到两个重组子pAlterMax-ephrin-A1-Fc和pAlterMax-ephrin-B1-Fc，经序列测定，确认无突变产生后转染至293T细胞，使之表达分泌型ephrin-A1-Fc和ephrin-B1-Fe可溶性融合蛋白，并利用蛋白A琼脂糖凝胶纯化。利用免疫沉淀和Westernblot检测了ephrin-A1-Fc和ephrin-B1-Fc的相应受体的活性。结果 Ephrin-A1和ephrin-B1融合蛋白可以成功刺激其相应的Eph受体，使之发生磷酸化。结论 制备得到的两个融合蛋白具有相应的生物活性，为进一步研究Eph受体酪氨酸激酶家族的功能打下了基础。     

转染CD258-Fc基因抑制人膀胱移行细胞癌T24细胞增殖的体内外实验研究

目的探讨转染CD258-Fc基因抑制人膀胱移行细胞癌T24细胞增殖的作用及对人膀胱移行细胞癌动物模型抑瘤率的影响，以探讨CD258-Fc基因转染实现抗肿瘤的作用，为人膀胱移行细胞癌的基因治疗提供新思路。方法 以LipofectaminTM脂质体介导CD258-Fc基因转染人膀胱移行细胞癌T24细胞株，通过绘制细胞生长曲线、MTT比色法以及流式细胞仪检测观察CD258-Fc转染对T24细胞增殖的影响，PCR、Northern分析检测转染CD258-Fc基因在T24细胞的表达，WestemBlot检测蛋白表达，T24细胞接种于裸鼠，分组给予CD258-Fc基因转染进行治疗，评价其抑瘤率。结果 CD258-Fc基因的表达可以抑制T24细胞的体外生长，T24／CD258-Fc细胞的生长曲线较对照组明显降低；MTT比色显示T24／CD258-Fc的细胞活力与对照组相比有显著性差异（P〈0．05）；PCR及Northern分析提示CD258-Fc基因转染后在T24细胞上调表达，WesternBlot检测到蛋白高表达：流式细胞仪检测显示基因转染使瘤细胞的生长滞留在G0＋G1期，S期细胞明显减少，并观察到细胞凋亡。动物实验T24／CD258-Fc、T24／CD258-Fc＋IFN—γ肿瘤抑制率可达48．66％和60．98％，显著高于对照组（P〈0．05），且两组间差异具有统计学意义（P=0．032）。结论 CD258-Fc基因转染对T24细胞具有体内外抗肿瘤的作用，提示CD258-Fc基因转染T24细胞技术有可能为人BTCC的基因治疗提供-种新的治疗策略与手段。     

CD74基因转染对内皮细胞特性的影响

目的探讨CD74基因在HUVEC的转染条件和CD74基因转染对细胞特性及功能的影响,为深入研究基于调节CD74表达的生物治疗打下基础。方法 （1）pCMV-CD74质粒转染前后ECV304细胞功能相关基因（HLA-A、HLA-DR、IFNGR）表达的检测：采用Real-time RT-PCR比较转染前后脐静脉内皮细胞各功能相关基因的表达;（2）应用Real-time RT-PCR分析软件分析实验数据。结果 Real-time RT-PCR结果显示,转染前后ECV304细胞HLA-A△Ct值分别为9.4881和12.1097,2-△△Ct为6.1543大于2,说明转染前后HLA-A表达有显著差异;IFNGR△Ct值分别为4.9828和5.5228,2-△△Ct为1.4539小于2,转染前后无显著差异;HLA-DR△Ct值分别为14.1098和14.7924,2-△△Ct为1.3036小于2,转染前后无显著差异。结论人脐静脉内皮细胞ECV304表达HLA-A、HLA-DR、IFNGR和CD74mRNA;pCMV-CD74转染可增加ECV304细胞CD74基因和膜分子的表达,增加HLA-A基因的表达,但不增加HLA-DR和IFNGR的表达,为深入探讨CD74基因与内皮细胞功能的相关性提供实验数据。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

过表达ERCC1蛋白细胞系的建立

[目的]建立过表达ERCC1蛋白的细胞系，为遗传毒性化合物的研究提供模型细胞系，并有可能为具有DNA加合作用化合物提供新的毒理学筛选方法。[方法]应用PCR和DNA重组技术将核苷酸切除修复交叉互补组1(Excision repair cross complementation groupl，ERCCl)基因与pT7Blue载体相连接，然后构建真核细胞重组表达质粒pcDNA3．1／Zeo( )-ERCC1，并导入293细胞。经Zeocin抗性筛选后获得转染ERCC1基因的细胞克隆。细胞增殖后以Western-blot检测目的蛋白的表达。[结果]获得稳定转染ERCC1基因的细胞系，并在细胞中检测出有ERCC1蛋白的过表达．[结论]用基因转染法成功建立了过袁达ERCC1蛋白的ERCC1-293细胞系。     

兔抗mLAIR-1胞外区抗体的制备、纯化和鉴定

目的：表达并纯化小鼠白细胞相关免疫球蛋白样受体-1（mLAIR-1）胞膜外区与人IgG Fc段的融合蛋白，制备兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体．方法：构建真核表达载体，表达并纯化mLAIR-1-Fc融合蛋白．以mLAIR-1-Fc融合蛋白免疫家兔，用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体．用间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性．结果：表达并纯化了mLAIR-1-hIgFc融合蛋白．以其免疫家兔，用亲和层析的方法纯化得到兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体，能与转染细胞和细胞表面天然mLAIR-1分子结合．结论：成功地构建了mLAIR-1胞膜外区基因的真核表达载体，表达并纯化了mLAIR-1-Fc融合蛋白．用偶联mLAIR-1-Fe融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化的兔抗mLAIR-1胞外区抗体，具有高特异性和高效价，为进一步研究mLAIR-1分子的结构和功能提供了新的手段．     

人GFP—AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWPI(associated with protein kinase Crelated kinase I，AWPI)表达载体,观察AWPI在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT—PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWPI cDNA编码区．并将其重组于GFP表达载体pEGFP—C2中。经酶切，序列鉴定分析后，将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察AWPI在细胞内的表达和分布。结果 GFP—AWPI融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功，并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下，在不携带外源基因的空载体pEGFP—C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中；在重组质粒pEGFP—C2／AWPI转染的293细胞，绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP—AWPI融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

ME491／CD63对小鼠胚胎发育及着床的影响

目的：研究ME491／CD63对小鼠胚胎体外发育及着床的影响,以及ME491／CD63mRNA及蛋白在假孕D1～8小鼠子宫中的表达规律．方法：①将小鼠8-细胞胚胎培养于含不同浓度ME491／CD63抗体的培养液中,观察胚胎发育,记录囊胚形成及脱透明带的情况．②妊娠D4小鼠宫角注射ME491／CD63抗体,于妊娠D8观察小鼠胚胎植入数量．③用RT—PCR及免疫组织化学技术观察ME491／CD63mRNA及蛋白在假孕小鼠子宫的表达规律．结果：①ME491／CD63抗体可影响胚胎在体外的发育．与对照组相比,在ME491／CD63抗体浓度为1：400及以上时,囊胚的形成率明显降低（P〈0．05）;在抗体浓度为1：800及以上时,胚胎脱带率显著下降（P〈0．05）,ME491／CD63抗体对胚胎发育的影响具有浓度依赖性．②宫角注射一定量的ME491／CI）63抗体可以显著提高小鼠胚胎的着床数[（5．8±2．3）vs（4．1±1．8）,P〈0．05]．③ME491／CI）63mRNA在假孕D1～8小鼠子宫中均有表达,于D6表达最丰富．MFA91／CD63蛋白在假孕D1—8的子宫腺上皮细胞均有表达,假孕D1～5腔上皮细胞无表达,假孕D6—8,子宫腔上皮细胞阳性表达．结论：①ME491／CD63在小鼠胚胎发育和着床过程中发挥重要作用．②ME491／CD63在妊娠小鼠子宫的表达是非胚胎依赖性的,其表达量的变化可能与胚胎存在与否有一定关系．     

T细胞表达CD137L分子介导对血管内皮细胞的活化刺激效应

目的探讨活化T细胞表面表达的CD137L分子对内皮细胞功能的影响.方法将活化的T细胞与内皮细胞共培养,ELISA检测共培养上清中IL-1、IL-8的含量;流式细胞仪检测内皮细胞表面粘附分子ICAM-1的表达变化,并观察用融合蛋白CD137-Fc阻断CD137-CD137L共刺激通路后内皮细胞分泌细胞因子的变化.结果活化的T细胞刺激了内皮细胞活化,诱导了内皮细胞合成和分泌细胞因子IL-1、IL-8以及粘附分子ICAM-1的表达;可溶性融合蛋白CD137-Fc成功地阻断了CD137-CD137L的相互作用,内皮细胞合成和分泌细胞因子的能力降低.结论证明CD137-CD137L的相互作用在内皮细胞与T细胞的相互作用中发挥了重要的作用,提示CD137与其配体交联具有刺激内皮细胞活化的生物学功能.     

急性B淋巴细胞白血病CD304表达的临床意义

目的：探讨急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)CD304表达的临床意义及其应用价值。方法：采用流式细胞术(FCM)检测初诊的32例B-ALL细胞CD304和相关白血病抗原表达、5例急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和10例良性血液病对照者细胞CD304的表达;21份初诊时融合基因和CD304共阳性的治疗后B-ALL样本,FCM和PCR检测微小残留病(MRD)水平,比较两者符合率。结果：BCR-ABL1阳性病人CD304表达阳性率高于E2A-PBX1和融合基因阴性病人(P<0.05)。5例T-ALL细胞和10例对照者B细胞上CD304均阴性表达,初诊43.75%(14/32)B-ALL病人CD304阳性表达：10例BCR-ABL阳性(12例)、1例TEL-AML1阳性和3例融合基因阴性(14例)病人CD304阳性表达,而3例E2A-PBX1阳性和2例MLL/AF4阳性病人CD304阴性表达。CD304阳性病人B-ALL细胞CD66c表达频率升高(P<0.01)。21例MRD中,PCR阳性11份,FCM阳性10份,共阳性10份,与PCR结果比较,FCM阳性符合率为91%,总符合率...     

稳定表达丙肝病毒EGFP-CORE融合蛋白细胞系的建立

目的：构建可表达丙型肝炎病毒（HCV）EGFP-CORE融合蛋白的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。方法：克隆HCV核心抗原基因于真核表达载体pEGFP-C1中，脂质体法转染QSG7701细胞后，荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP-CORE融合蛋白的表达。再经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。最后用Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果：成功构建真核表达载体pEGFP-C1／CORE；建立了重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。结论：重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系可表达EGFP-CORE，为以CORE基因作为靶位的抗HCV感染研究奠定了基础。     

腭扁桃体中几种杀伤功能相关分子的表达

目的 探讨CD56、PTA1、 LAIR-1等与非特异性免疫反应有关的分子在腭扁桃体组织中的表达及分布.方法 首先用间接免疫荧光染色流式细胞术分析的方法观察腭扁桃体细胞(PTC)在IL-2活化前后3种分子的表达情况.然后用免疫组化确定CD56表达的部位,以原位杂交法确定PTA1表达的部位.结果 在静止PTC中CD56、PTA1、LAIR-1的表达率分别为3.8%、 1.9%和35.1%.经IL-2活化后表达率上升为5.9%,19.2%和54.8%.免疫组化法表明CD56+细胞散在地分布于生发中心.原位杂交法表明,PTA1主要分布于腭扁桃体的滤泡旁区,少量分布在生发中心和内皮细胞上.结论 CD56、PTA1、LAIR-1这3种分子在腭扁桃体细胞中均有表达,且能被IL-2诱导.     

Tet1蛋白对HEK293T细胞增殖、周期及凋亡的影响

目的构建可诱导Tet1CD过表达的稳转细胞系,探究Tet1蛋白对细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法构建重组质粒p TRE-Tight_Tet1CD_IRES_RFP_RPBSA_M2rtTA_Puro,然后与表达转座酶的"睡美人"质粒通过脂质体法共同转染到HEK 293T细胞,通过嘌呤霉素筛选和多西环素诱导构建诱导表达型的Tet1CD稳转细胞系293T(Tet1CD)。通过Western blot检测Tet1蛋白的表达;通过DNA dot blot检测细胞基因组中5hmC的含量,通过流式细胞术检测Tet1CD蛋白对细胞周期和凋亡的影响;通过细胞计数检测Tet1CD蛋白对细胞增殖的影响。结果成功建立了可诱导Tet1CD过表达的HEK293T细胞系293T(Tet1CD); Western blot结果显示诱导后细胞内Tet1CD蛋白表达上升; DNA dot blot结果显示过表达Tet1CD蛋白细胞内5hmC含量升高;流式细胞术结果显示,Tet1CD过表达促进了细胞凋亡(P0. 05)及增加G2时期细胞比例(P0. 05);细胞计数结果显示,Tet1CD过表达抑制细胞增殖(P0. 0001)。结论 Tet1蛋白可能通过促进细胞凋亡及阻滞细胞周期最终抑制细胞增殖。     

血管内皮生长因子及其受体在肝癌细胞中的表达及意义

目的：探讨人肝癌细胞株血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的表达,进一步认识VEGF在肝癌血管形成中的作用机制。方法：以人脐静脉血管内皮细胞系ECV304和小鼠成纤维细胞系L929作为对照,采用免疫组化染色及RT-PCR,检测体外培养的人肝细胞肝癌细胞系SMMC7721、HHCC和HepG2中VEGF及其受体的表达。结果：SMMC7721、HHCC和HepG2细胞均有VEGF的表达,同时VEGF受体1（Flt-1)在SMMC7721细胞中也有表达;而HHCC和HepG2细胞则表达VEGF受体2（KDR）。