反义Ki-67肽核酸对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的治疗作用

目的:探讨Ki-67基因反义肽核酸(AS-PNAs)在体内对小鼠人肾癌移植瘤Ki-67表达和肿瘤生长的影响.方法:建立人肾癌移植瘤裸鼠模型,瘤体内注射反义肽核酸(AS-PNAs),定期测量肿瘤体积,处死小鼠后采用免疫组化、Western blot检测肿瘤Ki-67抗原表达,原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡,并与反义寡核苷酸(AS-ODN)处理组对照.结果:AS-PNAs处理组肿瘤生长受押(513.2±64.2)mm3,Ki-67表达下降(23.0±2.4)%、(59.7±2.3)%,细胞凋亡增加(31.1±2.0)%,与AS-ODN处理组(868.9±128.2)mm3、(33.6±2.6)%、(85.7±4.4)%、(18.3±2.3)%比较差异有显著性(P＜0.01).结论:反义Ki-67肽核酸能抑制小鼠人肾癌移植瘤Ki-67基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长,且优于反义寡核苷酸.     

mda-7/IL-24对裸鼠肝癌移植瘤的生长抑制和促凋亡作用

目的: 探讨mda-7/IL-24对裸鼠肝癌细胞移植瘤的生长抑制和促凋亡作用及其相关机制.方法:构建携带mda-7基因的重组腺病毒载体Ad.mda-7.以HepG2细胞皮下接种建立裸鼠肝癌移植瘤模型,采用瘤内单点注射的方法分别给予Ad.GFP、Ad.mda-7和ALLN(毒胡萝卜素,N-Ac-L-L-norleucinal)+Ad.mda-7,观察瘤质量和瘤体积的变化,通过免疫组化和TUNEL法检测肿瘤组织内凋亡相关蛋白caspase-3活化、细胞增殖相关抗原ki-67和微血管密度、细胞凋亡率,并通过Western blotting检测caspase-12、caspase-3和Bax的表达.结果:Ad.mda-7治疗组和Ad.GFP对照组肿瘤体积分别为(312.6±30.2)mm3和(520.6±30.0)mm3(P<0.01),两组的肿瘤质量分别为(0.321±0.031)g和(0.534±0.030)g(P<0.01);Ad.mda-7治疗后瘤细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.01);Ad.mda-7可抑制肝癌组织ki-67表达、微血管密度和促进caspase-3的表达. 经 ALLN 处理的裸鼠,明显抑制Ad.mda-7对肝癌细胞的致凋亡作用(P<0.05),并且下调Ad.mda-7诱导的caspase-12、caspase-3和Bax的表达.结论:Ad.mda-7可显著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长和新生血管的形成,并通过内质网应激通路显著诱导肿瘤细胞的凋亡.     

肿瘤增殖基因Ki67反义寡核苷酸对人肾癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨肿瘤增殖基因Ki67反义寡核苷酸(Ki67-ASODNs)对人肾癌细胞增殖及凋亡的影响.方法:将Ki67-ASODNs转染人肾癌细胞系786-0细胞,采用免疫组化、Western blot技术检测Ki67表达,细胞生长曲线、3H-TdR掺入试验等检测肾癌细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测肾癌细胞凋亡.结果:Ki67-ASODNs处理组(10,40 μmol/L)的786-0细胞Ki67表达阳性率(%)(29.9±0.4,24.5±1.2)降低,Ki67蛋白(%)(82.1±2.2,66.6±4.2)降低,分别与对照组(33.4±0.8,100)比较,差异有显著性(P＜0.01).Ki67-ASODNs处理组的3H-TdR掺入率(%)(44.5±4.4,34.5±3.2)与对照组(100)比较,差异有显著性(P＜0.01).Ki67-ASODNs处理组凋亡细胞阳性率(%)(12.7±0.5,23.1±2.1)增加,与对照组(9.3±2.0)比较,差异有显著性(P＜0.01).结论:肿瘤增殖基因Ki67反义寡核苷酸能抑制人肾癌786-0细胞Ki67基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡,且有剂量依赖性.     

125I标记Ki67反义多肽核酸对裸鼠人肾癌移植瘤的抑制作用

放射性核素反义治疗是近年来提出的一种新的肿瘤治疗策略,它将反义技术阻抑癌基因表达与放射性核素基因靶向照射有机结合,从而提高治疗效果.我们既往研究发现125I标记肿瘤增殖基因Ki67反义多肽核酸(125I-PNAs)具有较强的体外抑制肾癌细胞增殖、促进凋亡作用.本研究通过建立裸鼠人肾癌移植瘤模型,进一步观察其在体内对靶基因表达及肿瘤生长的抑制作用.     

Ki67基因RNA干扰腺病毒表达载体的构建及其抗结肠肿瘤作用研究

目的:构建针对肿瘤增殖基因Ki67的小干扰RNA(Ki67-siRNA)腺病毒表达载体,体外研究其对人结肠癌细胞株SW620细胞生长影响,为结肠癌的基因治疗提供参考。方法:设计可形成小发夹结构的Ki67-siRNA对应模板DNA序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pCA13,构建Ki67-siRNA表达质粒pCA13-Ki67。鉴定正确后,将pCA13-Ki67与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染至293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒Ad-Ki67。大量扩增Ad-Ki67,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。Ad-Ki67感染人结肠癌细胞,结晶紫染色法检测细胞病理作用,MTT法检测细胞存活,Western印迹法检测Ki67表达。结果:酶切分析、测序鉴定表明pCA13-Ki67构建成功,PCR分析表明Ad-Ki67含有Ki67-siRNA序列。Ad-Ki67可显著抑制Ki67蛋白表达及结肠癌细胞生长。结论:含有Ki67-siRNA的重组腺病毒构建成功,其能抑制人结肠癌细胞Ki67基因表达和生长。     

重组腺病毒Ad-DT-A靶向治疗胰岛素样生长因子2基因组印迹丢失的肿瘤细胞株

目的 构建携带胰岛素样生长因子2(IGF2)印迹系统的重组腺病毒,探讨其用于肿瘤靶向治疗的可行性.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增H19 enhancer、DMD以及H19启动子序列,并克隆至pDC-312中;扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和白喉毒素A(DT-A)片段,分别插入到构建好的重组质粒中,构建成重组腺病毒穿梭质粒.重组腺病毒穿梭质粒与Ad5共转染,产生重组腺病毒Ad-EGFP和Ad-DT-A.以Ad-EGFP分别感染正常IGF2印迹(MOI)细胞GES-1和MCF-7以及IGF2印迹丢失(LOI)细胞HCT-8,荧光显微镜下观察各组细胞中EGFP的表达.通过检测腺病毒衣壳蛋白hexon基因的表达证实腺病毒的感染,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测Ad-DT-A感染后各组细胞中DT-A基因的表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测Ad-DT-A体外抗肿瘤效应.构建皮下移植瘤裸鼠模型,研究Ad-DT-A在体内的抑瘤作用.结果 所构建重组腺病毒Ad-EGFP感染各组细胞后,EGFP蛋白仅在IGF2 LOI细胞HCT-8中表达.各组细胞经Ad-DT-A感染后,DT-A基因仅在HCT-8细胞中表达;且HCT-8细胞以每个细胞10 PFU的Ad-DT-A感染72 h后,其增殖活力降低至(75.4±6.4)％,凋亡率升高至(20.8±5.9)％.Ad-DT-A多点注射入HCT-8移植瘤内,Ad-DT-A能够有效抑制移植瘤的生长,抑瘤率达36.4％.结论 成功构建了携带IGF2印迹系统和DT-A基因的重组腺病毒.重组腺病毒Ad-DT-A能够有效杀伤IGF2 LOI肿瘤细胞,为依赖IGF2 LOI的肿瘤靶向治疗开拓了新的途径.     

尼美舒利联合顺铂对肺癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制探讨

目的 研究选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂尼美舒利(NIM)单独以及与顺铂联合对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长、Ki67及Caspase-3表达的影响,并进一步探讨其机制.方法 将裸鼠用统计学中的依体重按随机数字表法分为4组:对照组、尼美舒利组、顺铂组和联合用药组(尼美舒利+顺铂).将肺腺癌A549细胞接种至裸鼠皮下,并给予相应的药物治疗21d,观察移植瘤生长情况.免疫组化法检测Caspase-3及Ki67的表达变化.结果 尼美舒利联合顺铂对肺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用较单独用药明显,抑瘤率尼美舒利组为44.33％,顺铂组为53.61％,联合用药组为80.41％ (P ＜0.05).Caspase-3的表达率在联合用药组(67.43±23.57)％、顺铂组(48.40±20.37)％、尼美舒利组(38.65±15.37)％明显高于对照组(27.63±13.03)％,P＜0.05,联合用药组Caspase-3表达率(67.43±23.57)％高于顺铂组(48.40±20.37)％和尼美舒利组(38.65±15.37)％,P＜0.05.Ki67的表达率在联合用药组(24.34±15.90)％、顺铂组(40.85±22.47)％、尼美舒利组(53.33±19.67)％低于对照组(80.43±16.88)％,P＜0.05,且联合用药组Ki67的表达率(24.34±15.90)％低于顺铂组(40.85±22.47)％和尼美舒利组(53.33±19.67)％,P＜0.05.结论 尼美舒利可抑制人肺癌裸鼠移植瘤的生长,与顺铂联合可增强顺铂对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的抑制作用,其机制可能与抑制肿瘤细胞Ki67表达,增强Caspase-3表达,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡有关.     

沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的构建H-ras靶向短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)质粒,研究其对人涎腺腺样囊性癌裸鼠成瘤的抑制作用及其对移植瘤细胞增殖活性及细胞凋亡率的影响.方法构建含H-ras靶向特定序列的真核表达质粒pHRAS,稳定表达pHRAS质粒的细胞为实验组,未处理的SACC-M细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型,计算成瘤率;移植瘤原代培养检测质粒表达及瘤细胞增殖活性;免疫组织化学法检测瘤内H-ras蛋白表达;采用组织学观察、流式细胞术及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况.结果pHRAS质粒转染组成瘤率及肿瘤体积显著低于对照组,原代培养可见大量瘤细胞表达绿色荧光.实验组瘤内H-ras蛋白表达量明显减少,实验组肿瘤细胞凋亡率为(41.55±4.25 )%,明显高于对照组的(4.73±1.35) %(P＜0.05).结论shRNA沉默H-ras基因能抑制SACC-M细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,在体内有效下调H-ras蛋白的表达,且对肿瘤细胞具有促凋亡作用.     

赖氨酰氧化酶表达干扰对乳腺癌裸鼠移植瘤生长影响及机制研究

目的:探讨抑制乳腺癌细胞MD-MB-231中赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)的表达对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响及可能机制。方法:设计合成特异性LOX基因慢病毒干扰载体(LOX-RNAi-LV)转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测LOX mRNA和蛋白的表达;建立乳腺癌裸鼠原位移植模型,观察移植瘤的生长情况。采用免疫组化方法检测移植瘤组织中LOX蛋白及肿瘤增殖、转移相关蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9和HIF-1α的表达。结果:转染LOX-RNAi-LV的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中LOX mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.102±0.083和0.156±0.004,与空白对照组(0.945±0.158和0.916±0.007)相比,表达率均明显下调,抑制率分别为89.2%和83.0%。裸鼠原位接种癌细胞后6d均有肿瘤生成,40d后接种转染LOX-RNAi-LV的MDA-MB-231细胞的裸鼠移植瘤体积为(108.89±26.61)mm3,质量为(0.117±0.021)g;均明显低于空白对照组(400.15±79.81)mm3,(0.433±0.068)g,以及阴性对照组(380.15±65.81)mm3,(0.404±0.053)g,差异有统计学意义,P值均为0.000。移植瘤组织中LOX、Ki-67、MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白相对表达水平分别为0.198±0.036、0.347±0.054、0.379±0.048、0.335±0.067和0.307±0.073,较空白对照组和阴性对照组明显降低,P值均<0.01。结论:干扰MDA-MB-231中LOX的表达,可抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长侵袭,LOX可能通过调节Ki-67、MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白的表达,在乳腺癌的侵袭转移中发挥作用。     

(125)~I标记Ki67反义多肽核酸对裸鼠人肾癌移植瘤的抑制作用

放射性核素反义治疗是近年来提出的一种新的肿瘤治疗策略,它将反义技术阻抑癌基因表达与放射性核素基因靶向照射有机结合,从而提高治疗效果。我们既往研究发现125I标记肿瘤增殖基因Ki67反义多肽核酸(125I-PNAs)具有较强的体外抑制肾癌细胞增殖、促进凋亡作用。本研究通过建立裸鼠人肾癌移植瘤模型,进一步观察其在体内对靶基因表