LDL受体活性检测新方法

用四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色法测定人外周血淋巴细胞分裂抑制率，从而判断细胞膜ＬＤＬ受体活性，同时设＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法进行对照。共检测正常人７５例，家族性高胆固醇血症（ＦＨ）纯合子７例，杂合子１２例，人群中高血脂患者５２例。结果表明ＭＴＴ比色法可以替代＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法进行人群ＦＨ患者的筛检，初步确定ＦＨ患者的诊断标准为淋巴细胞分裂抑制率大于２０％，并从高血脂人群中检出了３例ＦＨ患者。     

LDL受体活性检测新方法

用四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色法测定人外周血淋巴细胞分裂抑制率，从而判断细胞膜ＬＤＬ受体活性，同时设￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入法进行对照。共检测正常人７５例，家族性高胆固醇血症（ＦＨ）纯合子７例、杂合子１２例，人群中高血脂患者５２例。结果表明ＭＴＴ比色法可以替代￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入法进行人群ＦＨ患者的筛检，初步确定ＦＨ患者的诊断标准为淋巴细胞分裂抑制率大于２０％，并从高血脂人群中检出了３例ＦＨ患者。     

Navitoclax联合柔红霉素促进红白血病细胞系K562、HEL和TF-1的凋亡

目的:研究促凋亡药物Navitoclax(NTX)联合化疗药物柔红霉素(Daunorubicin,DNR)对红白血病细胞凋亡的影响。方法:取对数生长期的K562、HEL和TF-1细胞,给予NTX、DNR以及2药联合,CCK-8检测细胞生长,Annexin V-DAPI双染流式细胞术检测细胞的凋亡,real-time RT-PCR检测凋亡相关基因BAX,BAK,BCL-2、BCL-xl、BIM的表达,对比分析NTX、DNR与2药联合对K562、HEL和TF-1细胞凋亡的影响。结果:NTX联合DNR能明显抑制K562、HEL和TF-1细胞的生长;凋亡检测结果显示,联合用药组K562、HEL和TF-1细胞凋亡率明显高于NTX、DNR单用药组(P 0.05);凋亡相关基因检测结果显示,K562细胞前凋亡蛋白基因BAK、BAX的表达水平在联合用药组明显高于2个单药组,抗凋亡蛋白基因BCL-2、BCL-xl的表达水平明显低于2个单药组(P 0.05);HEL细胞联合用药24 h BAK的表达水平高于DNR单药组(P 0.05);TF-1细胞联合用药24 h BCL-2的表达低于2个单用药组,48 h BAK的表达联合用药组最高,BCL-2、BCL-xl的表达水平在联合用药组低于NTX单药组(P 0.05)。结论:NTX联合DNR能明显促进红白血病细胞系K562、HEL和TF-1细胞凋亡,诱导凋亡相关基因的表达。本研究期待为红白血病的临床治疗提供新方案。     

蛋白酶体抑制剂可增加足叶乙甙对白血病细胞系M-07e和TF-1的凋亡诱导效应

近年来的研究显示泛素—蛋白酶体通路在细胞凋亡调控中发挥了重要的作用。本实验就蛋白酶体抑制剂Z—LLL—CHO与经典的凋亡诱导剂足叶乙甙(VP16)对白血病细胞系M—07e及TF—1的联合效应进行了初步研究。应用MTT法及台盼蓝拒染法显示Z—LLL—CHO及VP16联合作用于M—07e及TF—1细胞。可增强两种药物单独的细胞杀伤效应。流式细胞术检测提示单独应用Z—LLL—CHO及VP16均可使S G2／M期细胞比例增加，两联合应用导致细胞凋亡峰比例的显增高。通过对M—07e细胞裂解物做免疫印迹检测．发现在Z—LLL—CHO及VP16单独作用中均导致Bcl—2蛋白被酶解为22kD的片段，而联合作用时Bcl—2的酶解现象具有叠加效应。结论：Z—LLL—CHO与VP16联合作用较单独作用有更强的细胞杀伤及诱导细胞凋亡活性。细胞周期S G2／M期比例的增加及Bcl—2酶解片段的增加是导致蛋白酶体抑制剂Z—LLL—CHO及VP16对白血病细胞系联合效应的可能机制。     

MiR-486通过调控Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢

目的:探索低氧条件下造血细胞miR-486表达变化及miR-486对造血细胞糖代谢的调控作用及机制。方法:利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测低氧条件下TF-1细胞miR-486及Sirt1的表达水平。用慢病毒技术将miR-486过表达或沉默后检测Sirt1、葡萄糖转运因子1(glucose transporter 1,Glut1)和葡萄糖转运因子4(glucose transporter 4,Glut4)的表达水平。另外,将Sirt1沉默后分别用qRT-PCR及Western blot检测Sirt1的表达,并用qRT-PCR检测Glut1和Glut4的表达水平。结果:低氧促进miR-486的表达并抑制Sirt1的表达;过表达miR-486导致Sirt1的表达下调,而沉默miR-486可以促进Sirt1的表达;过表达miR-486上调Glut1和Glut4的表达,而沉默miR-486则抑制Glut1和Glut4的表达;沉默Sirt1可以促进Glut1和Glut4的表达。结论:MiR-486可以通过影响Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢。     

白细胞介素1的产生与活性检测

目前已获公认的白细胞介素(Interle-ukin 简称IL)有由单核吞噬细胞及树突状细胞产生的,能刺激T 和B 淋巴细胞反应的IL-1,也有由活化的T 细胞产生的IL-2和IL-3。IL-2能在体外维持T 细胞增殖,IL-3能诱导干细胞增殖形成细胞克隆。IL-1的作用是在免疫反应中通过刺激T     

人结肠癌细胞系mdr-1/P-糖蛋白的多种检测方法

P-糖蛋白是被mdr-1基因(也称PGY1)编码的一个膜性磷酸糖旦白,高水平mdr-1/P-糖旦白(Pgp)介导的多重耐药(MDR)常使化疗效果受限,它可发生在初发和继发病史中。MDR 已在组织培养系统中进行了研究,然而大多数肿瘤标本中mdr-1/Pgp 表达非常低。为了确定在临床上是否可用常规方法检测到mdr-1/Pgp 表达和测定Pgp 介导的MDR 是否存在可逆性,本文用RNA 杂交、印迹     

rhTpo／GM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定

本研究的目的是找出一个治疗由于放化疗等原因造成的造血组织损伤导致的贫血、感染和出血的有效方法。通过RT-PCR的方法从人胎肝中克隆了重组人血小板生成素(rhTpo)的基因,利用基因工程的手段将其与重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的基因相融合,并在原核细胞中表达。研究结果表明,大肠杆菌JM101表达的融合蛋白rhTpo/GM-CSF在体外小鼠骨髓造血祖细胞的培养中保留了Tpo对巨核细胞系和红细胞系的刺激作用,并增加了GM-CSF对粒细胞系的刺激活性。结论提示,原核细胞表达的融合蛋白rhTpo/GM-CSF具有刺激骨髓红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系造血的活性。     

彩超新方法检测肝癌

目的 本文设计一种新彩色多普勒影像处理方法以突出展现肝细胞癌（ＨＣＣ）的异常涡流。方法 计算两项新（双－向,低峰）指数检测ＨＣＣ特征血流。结果 在实验资料,由狭窄形成的涡流其两项指数较高。在临床方法向,ＨＣＣＲ 两项指数显著高于慢性肝病患者门脉及肝静脉内的相应测值。７７％ＨＣＣ２可检出该涡流,而很少见于门脉或肝静脉。结论该项新可用来ＨＣＣ涡流。     

抑制SDF-1活性对人急性髓性白血病HL-60细胞系增殖的影响

本研究通过观察抑制SDF-1活性对HL-60细胞增殖活性的影响，探讨趋化因子SDF-1在维持HL-60细胞生存能力中的作用。培养骨髓基质细胞，并与HL-60细胞共培养，采用SDF-1受体CXCR4单克隆抗体阻断SDF-1生物活性后，用MTT法检测HL-60细胞活力、用流式细胞术观察HL-60细胞增殖周期变化、检测细胞膜表面CXCR4表达，同时检测CXCR4单克隆抗体应用前后HL-60细胞内钙离子浓度变化。结果显示，抗CXCR4单克隆抗体可下调HL-60细胞膜表面CXCR4的表达，同时处于G0／G1期的细胞增多，处于S期的细胞减少，而白血病细胞存活率下调，细胞内钙离子浓度降低。结论：抑制SDF-1活性可在一定程度上抑制白血病细胞的增殖。     

Tax基因表达细胞系的建立及其生物学活性的初步研究

本研究旨在建立成人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)的tax基因表达细胞系,并对其生物学特性进行初步研究。利用脂质体将真核表达载体pCMV-tax和空载体pCMV-neo-Bam转入T淋巴细胞系(JurkatE 6-1)细胞,用G418筛选出稳定表达tax基因的T细胞系TaxP和表达tax阴性细胞系TaxN。用RT-PCR检测LAT、SLP-76、ZAP-70和NF-κB(p65)mRNA的表达。将pNF-κB-Luc报告基因质粒分别转染入TAX蛋白阳性和空载细胞后,检测细胞内NF-κB的活性。用流式细胞仪检测CD25,CD69分子的表达。结果表明:用G418筛选出稳定转染tax基因的Jurkat细胞株,经检测RNA转录水平获得了tax稳定表达的转染细胞;RT-PCR显示,与TaxN细胞LAT相比TaxP细胞的ZAP-70,SLP-76和NF-κB表达增高(p<0.05);pNF-κB-Luc报告基因检测显示,TaxP细胞中NF-κB的活化程度明显提高(p<0.01);流式细胞仪检测显示,TAX能够促进T细胞表面CD69,CD25分子的表达。结论:建立了tax基因表达细胞系,TAX蛋白能够促进T细胞的活化和激活NF-κB通路。     

用人乳头瘤病毒6bL1病毒样颗粒检测尖锐湿疣血清抗体

目的　采用人乳头瘤病毒 (HPV) 6bL1病毒样颗粒 (VLPs) ,检测HPV6感染的尖锐湿疣(CA)病人血清抗体 ,以评价HPV感染的血清学诊断方法。方法　采用重组杆状病毒———昆虫细胞系统制备HPV6bL1VLPs ,经氯化铯梯度离心纯化 ;以酶联免疫吸附试验 (ELISA)分别检测CA、宫颈癌和健康对照组的 136份标本的血清抗体。结果　CA组、健康对照组和宫颈癌组抗HPV6bL1VLPs的血清抗体阳性率分别为 75 % [吸光度 (A)均值 0 111± 0 0 94],2 9% (A均值 0 0 12± 0 0 2 4) ,14 3% (A均值0 0 2 9± 0 0 2 2 ) ,3组间比较差异均有显著性 (P <0 0 1)。结论　HPV6bL1VLPs作ELISA抗原 ,可在CA病人体内检测到HPV6型特异性抗体 ,提示该方法可用于HPV6感染的血清学诊断和流行病学调查。     

阿霉素诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究

本研究探讨阿霉素（ADM）诱导Egr-1启动子调控造血生长因子基因表达对化疗后造血损伤的修复作用。构建携带Egr-1调控序列启动的GM—CSF和eGFP双顺反子基因pClneo真核表达载体（Egr—EG）；通过脂质俸转染骨髓基质细胞系HFCL，挑出G418抗性的阳性克隆（HFCL／EG）；采用流式细胞仪和倒置荧光显微镜观察eGFP绿色荧光表达的阳性细胞；在加入ADM的HFCL／EG细胞培养体系中，用ELISA方法检测GM—CSF的含量；将从脐血中分离的单个核细胞接种于含有ADM后的HFCL／EG上清培养液中，观察其对CFU—GM的增殖作用；采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸鉴定化疗通过活性氧诱导Egr—1启动子CArG序列调控下游基因表达的特异性，结果表明：成功地构建了Egr—1调控序列启动的双顺反子基因表达载体（Egr—EG）；在HFCL／EG细胞中有外源性基因eGFP和GM-CSF的表达，在加入ADM后HFCL／EG细胞培养上清液中GM—CSF含量和CFU—GM形成数量较未加ADM组明显增高（P〈0．01）；在ADM处理的HFCL／EG细胞中，N-乙酰半胱氨酸明显降低GM—CSF水平。结论：ADM诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达对化疗后的造血损伤具有一定的修复作用     

苦参碱对人骨肉瘤细胞系MG-63体外活性的影响

【目的】探讨苦参碱对人骨肉瘤细胞系MG-63体外增殖活性的影响。【方法】将不同浓度的苦参碱作用于体外培养的人骨肉瘤细胞。运用四甲基噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度组药物对细胞增殖率的影响，流式细胞仪分析细胞周期的变化。【结果】随着苦参碱浓度的增加和作用时间的延长，人骨肉瘤细胞的体外增殖率逐渐下降．且大部分细胞被阻滞在S期，导致S期的细胞比例增大及G2／M期的细胞比例减少。【结论】苦参碱能明显抑制人骨肉瘤细胞的体外增殖活性，其机制可能是将细胞阻滞在S期。     

紫杉醇耐药人肺腺癌细胞系的建立及生物学活性

目的：体外建立紫杉醇耐药人肺腺癌A549/TAX细胞系,并对其生物学特性进行研究.方法：采用逐步增加紫杉醇浓度结合低剂量持续诱导法,建立紫杉醇耐药人肺腺癌A549/TAX细胞系.MT T法描绘A549和A549/TAX细胞的生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期并比较经紫杉醇诱导24 h后A549和A549/TAX细胞平均凋亡率的差异;检测紫杉醇对A549/TAX细胞的半数抑制浓度、耐药系数（RI）及A549/TAX细胞对其他 5种化疗药物（顺铂、长春新碱、表阿霉素、足叶乙甙及吉西他滨）的交叉耐药谱;RT-PCR半定量分析A549/TAX细胞凋亡基因（bcl-2）及耐药基因（MDR1、LRP、GST-π）的mRNA表达.结果：A549/TAX细胞生长较亲本细胞快,S期细胞增多[（51.61±0.48）%],G1 期减少[（37.26±0.23）%],经紫杉醇（150 μmol/L）诱导前后平均凋亡率差异与A549细胞相比差异有显著性.A549/TAX细胞对紫杉醇、长春新碱、表阿霉素及足叶乙甙的RI分别为 21.3、12.91、5.88和4.79,而对顺铂（RI=1.06）和吉西他滨（RI=1.03）则无交叉耐药;A549/TAX细胞bcl-2、 MDR1、LRP mRNA的表达均较亲本细胞显著增高（P＜0.001）,GST-πmRNA未见表达.结论：成功建立了紫杉醇耐药A549/TAX细胞系,该细胞抗药性能明显、稳定,推测其多药耐药性与bcl-2、MDR1和LRP高表达有关.     

血小板聚集机能检测的新方法

血小板聚集机能的检测,目前国内外多采用透光测定法。由于所用仪器操作复杂、影响因素较多,所得结果重现性差,正常值范围宽。我们对葛谷文男改良的Wu 法,进行了摸索,在试剂配制,操作步骤等方面作了修改,现报道如下。原理:EDTA 能离解已聚集了的血小板团块,     

血清中对氧磷酯酶1活性的自动化检测

目的血清对氧磷酯酶1(PON1)的自动化检测方法建立及评价.方法在Hitachi 7600上建立自动化测定血清PON1的参数,对该方法的重复性、线性、干扰分析进行评估.并对正常人血清PON1活性进行分析.结果低、中、高3个浓度PON1的总变异分别为6.5%、4.2%、1.7%,测定线性可达800 U/ml.标本中胆红素浓度在430 μmol/L以下,血红蛋白浓度在5.5 g/L以下以及三酰甘油浓度在25.0 mmol/L以下对血清PON1的测定均无明显影响.正常人血清PON1活性呈正态分布,参考范围为45.5～268.8 U/ml.结论建立的血清PON1自动化检测方法简单、可靠、快速、廉价,适合临床实验室常规测定需要.     

血清中对氧磷酯酶1活性的自动化检测

目的　血清对氧磷酯酶 1(PON1)的自动化检测方法建立及评价。方法　在Hitachi 76 0 0上建立自动化测定血清PON1的参数 ,对该方法的重复性、线性、干扰分析进行评估。并对正常人血清PON1活性进行分析。结果　低、中、高 3个浓度PON1的总变异分别为 6 .5 %、4 .2 %、1.7% ,测定线性可达 80 0U/ml。标本中胆红素浓度在 4 30 μmol/L以下 ,血红蛋白浓度在 5 .5 g/L以下以及三酰甘油浓度在 2 5 .0mmol/L以下对血清PON1的测定均无明显影响。正常人血清PON1活性呈正态分布 ,参考范围为 4 5 .5～ 2 6 8.8U/ml。结论　建立的血清PON1自动化检测方法简单、可靠、快速、廉价 ,适合临床实验室常规测定需要。     

舌癌细胞系T-TFL的建立和生物学性状检测

背景基因治疗已成为恶性肿瘤研究领域的热点和发展趋势,但舌癌基因治疗的研究报道极少.目的构建含相关死亡结构域蛋白(FADD)及肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)基因功能结构域的融合基因TFL,稳定转染入人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113)中,检测建系细胞T-TFL的生物学性状,探讨一种更有利于舌癌患者治疗期及治疗后期内生活质量的治疗手段.设计以诊断为依据,前瞻性研究.地点和对象实验在第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科完成,研究对象为人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113),上海第二医科大学口腔医学院建系.干预反转录PCR获得人FADD及TNFR1基因cDNA,重组PCR法构建含二者功能结构域的融合基因TFL,通过阳离子脂质体法稳定转染TFL基因入Tca-8113细胞中.主要观察指标Western blot检测融合蛋白TNFR1/DED表达,通过形态学观察、生长曲线等检测T-TFL细胞的生物学性状.结果获得了人FADD及TNFR1基因并构建成功融合基因TFL,转染入Tca-8113细胞后,能表达融合蛋白TNFR1/DED活性,且T-TFL细胞与亲本Tca-8113细胞的生物学性状无明显差异.结论T-TFL细胞能表达融合蛋白TNFR1/DED活性,可以为进一步深入研究舌癌基因治疗提供实验基础.     

舌癌细胞系T-TFL的建立和生物学性状检测

背景：基因治疗已成为恶性肿瘤研究领域的热点和发展趋势，但舌癌基因治疗的研究报道极少。目的：构建含相关死亡结构域蛋白(FADD)及肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)基因功能结构域的融合基因TFL，稳定转染入人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113)中，检测建系细胞T-TFL的生物学性状，探讨一种更有利于舌癌患者治疗期及治疗后期内生活质量的治疗手段。设计：以诊断为依据，前瞻性研究。地点和对象：实验在第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科完成，研究对象为人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113)，上海第二医科大学口腔医学院建系。干预：反转录PCR获得人FADD及TNFR1基因cDNA，重组PCR法构建含二者功能结构域的融合基因TFL，通过阳离子脂质体法稳定转染TFL基因入Tca-8113细胞中。主要观察指标：Westem blot检测融合蛋白TNFR1／DED表达，通过形态学观察、生长曲线等检测T-TFL细胞的生物学性状。结果：获得了人FADD及TNFR1基因并构建成功融合基因TFL，转染入Tca-8113细胞后，能表达融合蛋白TNFR1／DED活性，且T-TFL细胞与亲本Tca-8113细胞的生物学性状无明显差异。结论：T-TFL细胞能表达融合蛋白TNFR1／DED活性，可以为进一步深入研究舌癌基因治疗提供实验基础。