三七PnUGT1基因的全长cDNA克隆和生物信息学分析

本研究通过对三七的转录组高通量测序结果进行分析,采用5’-RACE和RT-PCR方法,对其中一条可能参与三萜皂苷合成的UDP-糖基转移酶基因转录本(Pn02086)进行全长克隆,预测了该基因编码蛋白的理化性质、保守结构域等,并对其进行了进化分析。通过全长克隆,得到一条开放阅读框为1 488 bp的cDNA序列,命名为PnUGT1,GenBank登录号JX018210。该基因编码495个氨基酸,蛋白分子量为55.453 kD,属于不稳定蛋白。二级结构中α-螺旋占36.16%、β-折叠占11.31%、无规卷曲占52.53%。InterProScan预测该蛋白具有7个保守结构域,包括在植物次生代谢产物中相关糖基转移酶特有的PSPG保守基序。该蛋白不具有信号肽和跨膜区,最有可能定位在细胞质中。序列比对和进化关系分析表明,该蛋白和蒺藜苜蓿三萜合成相关的UDP-糖基转移酶AAW56092的亲缘关系较近,PSPG保守区域的相似性为66%。该基因在三七叶中表达量较在花、茎和根中的表达量高。推测PnUGT1基因可能参与了三七皂苷的合成。     

三萜皂苷合成生物学元件的初步开发:三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析

中药合成生物学是将合成生物学思路引入中药天然产物次生代谢途径研究的一门新兴学科,其发展初期的首要任务是进行元件的开发与标准化,建立标准化的合成生物学元件库。三七(Panax notoginseng)作为人参属重要的药用植物,具有较高的药用价值,其主要活性成分是三萜皂苷。鲨烯环氧酶(squalene epoxidase)被认为是三萜皂苷与植物甾醇次生代谢途径中的关键限速酶,是三萜皂苷合成生物学研究的重要元件之一。本研究克隆获得三七中两种类型的鲨烯环氧酶编码基因(PnSE1、PnSE2),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法检测其在4年生三七不同组织部位的表达模式,以及受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理后基因的表达量变化,为实现中药合成生物学元件挖掘与开发奠定基础。PnSE1基因与PnSE2基因预测编码蛋白分别包含537和545个氨基酸,序列相似性为79%,但N端(前70个氨基酸)序列不保守。PnSE1基因在根、茎、叶、花中均有表达,以花中表达丰度最高;PnSE2基因只在花中表达量显著,其余组织较弱。PnSE1基因响应MeJA诱导,诱导24 h后在叶中的表达量最大;相同诱导条件下,PnSE2基因未响应诱导,表达水平无显著变化。结果表明,PnSE1和PnSE2基因具有不同的表达模式,在三七次生代谢产物合成中起不同催化作用,推测PnSE1基因参与三萜皂苷合成途径,PnSE2基因则在甾醇合成途径中起催化作用。     

基于巴戟天转录组数据的R2R3-MYB转录因子的鉴定和分析

为了挖掘参与巴戟天生长发育及次生代谢产物合成的MYB转录因子,本研究基于巴戟天根茎叶的转录组数据,筛选并鉴定巴戟天的R2R3-MYB转录因子,为以后通过遗传改良的手段调控巴戟天的代谢机制提供理论基础。根据巴戟天根茎叶的转录组数据,利用PFAM和plantTFDB等5个数据库,对预测的巴戟天R2R3-MYB转录因子进行鉴定, GO功能注释和分类、保守结构域分析、进化树比对分析和组织特异性表达差异分析。基于巴戟天的转录组数据共鉴定109个MYB转录因子,其中R2R3-MYB的数量为51个。亚细胞定位结果显示多数序列定位于细胞核,少部分位于细胞外基质。与分子功能、生物过程和细胞组分相关的GO terms的数量分别为112、76和239个。51个巴戟天R2R3-MYB转录因子中的R2-MYB和R3-MYB的保守基序分别为:-W-(X19)-W-(X19)-W-,-F-(X18)-W-(X18)-W-。通过与拟南芥R2R3-MYB转录因子的序列比对分析可知,除了S10、S19和S21亚家族没有分布,其他亚家族中都存在同源序列。RT-qPCR的结果验证了部分R2R3-MYB基因在3个组织差异性表达。获得的51个R2R3-MYB转录因子为进一步研究巴戟天MYB转录因子家族提供了一定的理论基础。     

金荞麦无色花色素还原酶基因FdLAR的克隆和表达分析

无色花色素还原酶(leucoanthocyantin reducase,LAR)基因是植物类黄酮代谢途径中催化缩合单宁合成的一个关键结构基因,本研究通过简并PCR结合RACE的方法,获得了1个金荞麦(Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara)无色花色素还原酶基因FdLAR(GenBank accession:JN793953),序列全长1 581 bp,其中开放阅读框长1 176 bp,编码391个氨基酸的蛋白质,在N端存在1个保守结构域,属于RED蛋白家族。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明金荞麦无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,电泳检测到1条大约66 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。利用实时荧光定量PCR技术检测FdLAR基因在金荞麦根茎中不同生长发育时期的表达情况,同时测定相应根茎中类黄酮的含量,结果表明FdLAR基因的表达量与类黄酮积累之间的关系在营养生长和生殖生长阶段呈现出不同的变化趋势,推测该基因可能在金荞麦类黄酮次生代谢产物积累中起作用。     

三七PnMYB1R1基因的克隆、亚细胞定位与不同胁迫下的表达分析

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物信号转导、生长发育和植物防御反应中起到重要作用。本研究以三七(Panax notoginseng)为材料,设计特异引物,克隆了三七中1R-MYB转录因子PnMYB1R1基因,并进行氨基酸序列分析、原核表达和纯化、亚细胞定位、转录活性分析、组织特异性分析及非生物胁迫下的诱导表达分析。PnMYB1R1基因开放阅读框(ORF)长738 bp,编码245个氨基酸,蛋白分子质量27.0 kD。序列分析及系统进化树结果表明PnMYB1R1包含1个保守的R3结构域,属于1R-MYB型转录因子中的TRF-like类蛋白。构建原核表达载体pET28a-PnMYB1R1并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中成功表达PnMYB1R1重组蛋白,纯化得到可溶性重组蛋白。亚细胞定位实验结果表明PnMYB1R1定位于植物细胞的细胞核中。转录活性分析显示PnMYB1R1转录因子具有转录激活活性。实时荧光定量PCR结果表明PnMYB1R1基因在三七主根中表达量最高,茎、叶次之,须根中表达量最低。盐、低温及干旱胁迫均能够影响主根、须根、茎、叶中PnMYB1R1基因的表达...     

西洋参cDNA文库构建及表达序列标签(EST)分析

为研究西洋参根的基因表达谱和挖掘其功能基因， 采用表达序列标签(EST)技术首次建立了四年生西洋参根的EST文库。通过BLAST与Gene Ontology分析获得与人参皂苷生物合成相关、 编码P450和糖基转移酶等的基因序列11个， 与生长素调节生长发育相关、 编码生长素响应因子4和生长素调节蛋白等的基因6个， 与水分胁迫相关、 编码蛋白dehydrin和DC2.15 like蛋白等的基因7个， 与编码抗氧化酶如peroxidase和catalase相关的基因6个。另外， 从西洋参根的EST文库获得抗病基因12个， 分别编码转录因子WRKY家族蛋白和ribonuclease蛋白家族， 62个EST是其他物种尚未报道的新基因。可见， EST技术作为功能基因组研究的重要手段可在西洋参功能基因的开发与研究中发挥重要作用， 这些基因的发现为进一步克隆基因全长、 研究基因功能、 改良西洋参品质、 阐明西洋参生长缓慢的分子机制等方面奠定了基础。     

甘蓝AP2/ERF转录因子的克隆和生物信息学分析

摘 要 目的：运用电子克隆的方法获得甘蓝中AP2/ERF转录因子基因。 方法: 以拟南芥的AP2/ERF转录因子作为探针,对甘蓝的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行序列拼接组装和延长。结果: 克隆出甘蓝两个AP2/ERF B3亚族转录因子BoAP2/ERF1和BoAP2/ERF2。通过生物信息学方法,对两条序列编码蛋白质的氨基酸组成,亲水性/疏水性、理化性质、亚细胞定位、高级结构和空间构型等方面进行了预测和分析。结论:BoAP2/ERF1和BoAP2/ERF2基因由371和352个氨基酸组成、相对分子质量为40.85kDa和39.44kDa的蛋白质,定位于细胞核。序列分析结果显示,该蛋白可能具有信号转导和胁迫响应应答等功能。     

三七甲羟戊酸激酶PnMVK1基因的克隆和生物信息学分析

药用植物三七通过甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway)合成三萜皂苷生物合成的前体。甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)则是甲羟戊酸合成途径中ATP依赖的限速酶之一。本研究根据课题组已获得的三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]转录组数据中的MVK1转录本序列,利用RT-PCR方法获得三七MVK1(PnMVK1)基因的全长cDNA序列;对PnMVK1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR方法检测了PnMVK1基因在三七的根、茎、叶、花中的表达情况。序列分析表明,克隆获得的三七PnMVK1基因长为1 164 bp,编码387个氨基酸,GenBank登录号JQ957844。生物信息学预测PnMVK1蛋白不含跨膜区,不含信号肽,具有GHMP激酶等保守结构域。PnMVK1基因在三七的根中表达丰度最高。本研究成功克隆并分析了三七MVK1的全长序列,为进一步阐明三七三萜代谢途径奠定基础。     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

掌叶大黄转录因子RpMYB4基因克隆及分子表达特性

MYB转录因子在植物生长发育、次生代谢及逆境胁迫等过程中发挥重要的转录调控作用.本实验在掌叶大黄转录组数据库中筛选一个包含完整开放阅读框(ORF)的MYB家族成员序列,首次克隆获得RpMYB4基因ORF,编码一条245个氨基酸的多肽,分子质量为26.99 kDa,N端含有R2R3-MYB亚家族典型的2个DNA保守结合域...     

不同品系小鼠急性胰腺炎预后差异及其机制探讨

目的观察C57BL/6和BALB/C两品系小鼠急性胰腺炎预后差异,并探讨其预后差异的机制。方法腹腔内注射L-精氨酸的方法诱导两品系小鼠急性胰腺炎模型,观察其急性胰腺炎后24h病死率的差异,RT-PCR方法检测两品系小鼠肝、肺组织白细胞介素-1β(1L-1β)表达。结果急性胰腺炎时C57BL/6小鼠24h病死率(10%)与BALB/C小鼠病死率(40%)相比有显著性差异(P＜0．05)；两品系小鼠肝、肺组织1L-1β的表达在相同时相点有显著性差异(P＜0．05)。结论两品系小鼠急性胰腺炎时其组织炎症因子表达的差异与其病死率差异有明显相关性。