α晶体蛋白对LPS刺激及视神经损伤后大鼠视网膜小胶质细胞增殖及数量的影响

目的 研究α晶体蛋白对大鼠视网膜小胶质细胞增殖能力及视神经损伤后小胶质细胞数量的影响.方法 脂多糖激活离体培养视网膜小胶质细胞,模拟视神经损伤,采用MTF分析α晶体蛋白对激活的小胶质细胞增殖能力的影响;建立大鼠视神经不全损伤模型,损伤后玻璃体腔注射α晶体蛋白,采用视网膜铺片及免疫荧光标记小胶质细胞并计数,比较不同组小胶质细胞的数量.结果 10-g/L～10-2 g/L浓度的脂多糖均可激活小胶质细胞(P＜0.05),10-6g/L和10-4g/L浓度的α晶体蛋白可明显抑制10-6g/L浓度的脂多糖激活的小胶质细胞的增殖;视神经损伤1～3周,α晶体蛋白注射组小胶质细胞的数量明显少于损伤组(P＜0.05).结论 α晶体蛋白可抑制视网膜上小胶质细胞的增殖和活化,减轻小胶质细胞对RGCs的过度吞噬和继发性损害,可能是视神经损伤后α晶体蛋白问接保护RGCs存活的另一机制.     

IFN-γ预处理骨髓间充质干细胞及其抑制小胶质细胞 活化作用的影响

 目的 探讨干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)预处理大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)及其抑制脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)诱发的小胶质细胞(microglia,MG)活化作用的影响。方法 采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMMSCs,利用含100 ng/ml 的IFN-γ完全培养液对BMMSCs进行预处理;利用LPS(10μg/ml)诱导大鼠小胶质细胞活化。小胶质细胞分离纯化后,以1×10⁵/孔种植于6孔板中,按以下分组将小胶质细胞和BMMSCs以直接接触的方式进行共培养24h:B组(单纯BMMSCs组)、L+B组(LPS+ BMMSCs组)、I+B组(IFN-γ预处理BMMSCs组)、L+I+B组(LPS+IFN-γ预处理BMMSCs组)、M组(单纯MG组)、L+M组(LPS+MG组)、B+L+M组(BMMSCs+LPS+MG组)、I+B+L+M组(IFN-γ预处理BMMSCs+LPS+MG组)。采用ELISA技术检测培养液上清TNF-α、IL-1β水平,免疫荧光法检测小胶质细胞表面标记物CD68表达。结果 L+M组小胶质细胞CD68表达增高,分泌TNF-α、IL-1β含量明显增多;B+L+M组以及I+B+L+M组的小胶质细胞CD68表达水平、TNF-α、IL-1β分泌量低于L+M组,且B+L+M组与I+B+L+M组相比有统计学差异(P＜0.05)。结论 BMMSCs和IFN-γ预处理的BMMSCs均可以直接接触的方式抑制LPS诱发的小胶质细胞的活化且经IFN-γ预处理后的BMMSCs对小胶质细胞活性抑制作用更强。     

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞iNOS表达及NO生成的影响

目的探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和一氧化氮(NO)生成的影响。方法体外培养大鼠巨噬细胞NR8383,分别加入LPS(终浓度1μg/ml)和不同浓度(10-10、10-8和10-6mol/L)的CCK-8进行干预,并设空白对照组(加入PBS)和丙谷胺干预组(丙谷胺终浓度2μg/ml,CCK-8浓度10-8mol/L,LPS浓度1μg/ml)。各组细胞培养24h后收集上清液,Griess法检测NO含量;取培养24h后的细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR法检测iNOS基因表达情况;裂解培养24h后的细胞,离心取上清,生化法检测细胞内iNOS活性。结果 LPS可明显促进大鼠肺泡巨噬细胞iNOS的表达和NO的生成;预先加入不同浓度的CCK-8均可抑制LPS诱导的iNOS mRNA水平上升和活力增强,减少NO生成,且呈现剂量依赖性(P<0.05或P<0.01)。CCK受体拮抗剂丙谷胺可逆转CCK-8的抑制作用。结论 CCK-8可能通过降低LPS诱导的肺泡巨噬细胞iNOS表达和NO产生来实现其对内毒素休克动物的保护效应。     

吲哚美辛对β淀粉样蛋白1-42刺激BV-2细胞产生一氧化氮的抑制作用

目的研究吲哚美辛对β淀粉样蛋白1-42（A-β1—42）刺激小胶质细胞（MG）释放一氧化氮（N0）的抑制作用。方法应用高度纯化的BV-2小胶质细胞作为体外小胶质细胞模型，应用不同浓度吲哚美辛（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5mol／L）与20μmol／L Aβ1—42单独或同时培养12h，测定细胞上清NO含量及细胞iNOS活性；RT-PCR法测定BV-2细胞iNOS mRNA的表达。结果吲哚美辛单独作用对BV-2细胞产生NO、iNOS活性及iNOS mRNA表达无明显作用。Aβ1—42可以刺激产生NO、提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS mRNA表达，这些作用均可被吲哚美辛所抑制，吲哚美辛浓度为10^-7～10^-5mol／L时抑制作用较为明显。结论在体外吲哚美辛可以降低Aβ1—42介导的BV-2细胞iNOS活性及iNOS mRNA表达，从而减少NO的产生，上述抑制作用可能参与了吲哚美辛在AD治疗中的神经元保护机制。     

蜂毒肽MP-1体外拮抗内毒素作用及其机制

目的 观察蜂毒肽MP-1的体外抗内毒素(LPS)活性并探讨其作用机制. 方法 应用生物传感器检测MP-1对类脂A(lipid A)的亲合力,采用动态比浊法鲎试验检测MP-1对LPS(2μg/L)的中和作用,激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度MP-1(5,10,20,40 μmol/L)干预后异硫氰酸荧光素标记LPS(FITC-LPS,100 μg/L)与小鼠RAW264.7细胞的结合,免疫细胞化学法观察MP-1对LPS(100μg/L)诱导的RAW264.7细胞TLR4表达的影响;实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测不同浓度MP-1作用下LPS(100μg/L)刺激的RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6基因及蛋白的表达;MTT法检测MP-1对RAW264.7细胞活力的影响. 结果 MP-1具有一定的结合lipid A及中和LPS的作用,在10 μmol/L浓度可显著抑制FITC-LPS与RAW264.7细胞结合(P<0.05),并对LPS刺激的小鼠RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6的基因及蛋白表达有抑制作用(P<0.05或<0.01),该作用具有一定的剂量效应关系.MP-1体外实验浓度对细胞活力无影响(P>0.05). 结论 MP-1可能通过中和LPS作用,阻断LPS与RAW264.7细胞膜受体的结合,从而抑制LPS介导的细胞活化.     

Corilagin对小鼠小胶质细胞株照射后炎性反应因子表达的抑制作用

目的 研究抗炎药物Corilagin抑制放射引起小胶质细胞(BV-2)炎性反应的作用及其防护的分子机制。方法 细胞抑制实验(MTT)检测Corilagin对BV-2细胞的抑制率;Corilagin预处理小胶质细胞,12 h后,以0和32 Gy 2个放射剂量照射BV-2细胞,Real-time PCR检测小胶质细胞照射后不同时间点炎性反应因子IL-1β、TNF-α表达水平;硝酸还原酶法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;Western blot检测各组细胞核转录因子NF-κB p65蛋白表达;激光共聚焦显微镜观察各组细胞标志物Iba-1的表达、NF-κB p65核转位及Nemo的表达。结果 1～10 μg/ml浓度范围内Corilagin对BV-2细胞增殖几乎无影响;照射后小胶质细胞表面标志物Iba-1表达明显,提示小胶质细胞激活,且炎性反应因子NO、TNF-α、IL-1β表达上调,而Corilagin(5μg/ml)可以显著抑制上述炎性反应因子的表达(t_IL-1β=6.341, t_TNF-α=3.411, t_NO=3.134, P <0.05);Corilagin可抑制NF-κB活化蛋白Nemo,并显著抑制NF-κB p65的转位。结论 Corilagin可能通过NF-κB信号转导途径抑制照射后小胶质细胞的活化,从而下调炎性反应因子表达,保护神经元。     

一种改良的小胶质细胞培养方法及初步研究

为寻求一种简便、高效的小胶质细胞分离纯化技术,本实验利用“营养丧失”、振摇分离等改良的小胶质细胞培养方法,并结合原位分子杂交、免疫组化染色进行纯度鉴定。获得小胶质细胞比例占95%以上,分离纯化的小胶质细胞在LPS作用后,iNOS mRNA等表达显著。该方法简便易行,纯化程度高,为体外研究小胶质细胞的生物学特性及功能提供了条件。     

血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,并探讨其机制.方法 采用兔颈动脉外膜组织与平滑肌细胞共培养方法,分以下6组,①单独培养组:培养的VSMC中不加外膜组织及药物;②单独培养 脂多糖(LPS,1μg/ml)组;③单独培养 LPS N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,100mmol/L)组;④复合培养组:培养的VSMC中加入外膜组织块;⑤复合培养 LPS组;⑥复合培养 LPS L-NAME组.用氚-胸腺嘧啶(3H-TdR)检测各组VSMC增殖状态,试剂盒测定培养液中抗超氧阴离子自由基及亚硝酸盐(NO2-)含量,蛋白免疫印迹法检测血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达.结果 与单独培养组比较,LPS刺激前,复合培养组VSMC 3H-TdR掺入率、NO2-含量无明显差异,抗超氧阴离子活力单位增高(P＜0.05),HO-1蛋白表达显著增加(P＜0.01);LPS刺激后,复合培养 LPS组VSMC 3H-TdR掺入率显著降低(P＜0.01),抗超氧阴离子活力单位显著增高(P＜0.01),NO2-含量增高(P＜0.05),HO-1蛋白表达显著增加(P＜0.01);复合培养 LPS L-NAME组VSMC 3H-TdR掺入率、NO2-含量、HO-1蛋白表达无明显差异,抗超氧阴离子活力单位显著增高(P＜0.01).结论 血管外膜可通过一氧化氮(NO)及HO-1等途径抑制LPS刺激所致的VSMC增殖.     

脂联素对肝星状细胞抗肝纤维化及抑制细胞增殖的机制研究

目的 检测脂联素对肝星状细胞HSC-T6的抗纤维化作用,以及一氧化氮(NO)在其中的作用.方法 将HSC-T6细胞分为对照组、脂联素组(终浓度5μg/ml)、脂联素+L-NAME组(脂联素终浓度5μg/ml,L-NAME终浓度5mmol/L),分别于治疗24h后收集HSC-T6细胞,提取RNA和蛋白质行基因和蛋白表达的检测.另外,为检测脂联素与不同浓度L-NAME共同作用下iNOS基因的表达情况,将脂联素+L-NAME组根据L-NAME的浓度分为0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0mmol/L亚组,以上各组中脂联素均为5μg/ml.采用实时荧光定量PCR检测HSC内诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原蛋白(chollagen I)和转化生长因子-β(TGF-β)基因的表达;western blotting法检测iNOS蛋白的表达;采用ELISA法检测HSC-T6培养基中NO代谢产物(硝酸盐、亚硝酸盐)的浓度;采用BrdU法检测HSC-T6细胞的增殖情况.结果 与对照组比较,脂联素作用下HSC-T6细胞内iNOS基因的表达显著升高(P<0.01),α-SMA、Chollagen I、TGF-β等基因的表达均显著下调(P<0.01),iNOS蛋白表达水平显著上调(P<0.05),细胞培养基中硝酸盐、亚硝酸盐的水平显著升高(P<0.05),细胞增殖显著受抑(P<0.01),上述对细胞增殖的抑制作用在NOS抑制剂L-NAME的作用下发生逆转.结论 脂联素可下调HSC-T6细胞内纤维化指标的表达,抑制细胞增殖,这种作用至少部分由NO介导.     

诱生型一氧化氮合酶调节体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞中MMP的表达

目的 探讨在体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)中，一氧化氮(NO)的产生及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化对基质金属蛋白酶MMP-2，MMP-9的调节。方法 酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)，α—actin及电镜鉴定SMC后，取3～5代SMC用IL-10诱导iNOS表达，使用不同浓度的选择性iNOS抑制剂氨基胍，通过RT—PCR观察NO调节MMP-2，MMP-9的表达情况。结果 氨基胍抑制IL-1β诱导的SMC表达iNOS后，在一定范围内降低MMP-2 mRNA表达，但对MMP-9的表达无明显影响。结论 用不同浓度的氨基胍抑制IL-1β诱导体外培养的SMC表达iNOS，MMP-2 mRNA的表达在一定范围内呈浓度依赖性增加，提示NO对MMP-2表达的抑制作用可能在NO介导的以血管重构为特征的一系列血管疾病如腹主动脉瘤，经皮血管腔内成形术后再狭窄的病理生理机制中有重要作用，并可能为这些疾病的治疗提供新思路。     

RT-03对照射后小胶质细胞生物学行为的影响

目的 探讨RT-03对照射后小胶质细胞生物学行为的影响.方法 小胶质细胞(BV-2)随机分成5组:对照组(C组),照射组(R组),RT-03低、中、高剂量组(L,M和H组).采用60Co γ射线单次照射细胞,剂量为8 Gy,照射后即刻加入10、100和1000 ng/ml RT-03处理细胞,检测细胞增殖、凋亡,细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-4、IL-6、IL-13和γ干扰素(IFN-γ)等炎性因子的表达,以及小胶质细胞活化标志物离子钙接头蛋白1(Iba-1)的表达.结果 与C组相比,照射后R组细胞增殖活力降低,细胞凋亡增加,Iba-1、TNF-α、IL-4和IFN-γ表达升高;与R组相比,RT-03处理后,细胞Iba-1、TNF-α、IL-1β、IL-4的表达降低,增殖和凋亡无显著性差异.结论 RT-03能抑制照射后小胶质细胞活化,并降低细胞中炎性细胞因子的表达.     

小胶质/巨噬样细胞预活化对大鼠缺血性脑损伤早期TLR2/NF-κB炎症信号通路的影响

目的 探讨脑缺血预适应(cerebral ischemic preconditioning,CIP)后小胶质/巨噬样细胞活化对大鼠大脑缺血性损伤早期的Toll样受体(toll-like receptors 2,TLR2)/核因子-κb(nuclear factor-kappa B,NF-κB)炎症信号通路的影响及意义. 方法 选择健康雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、缺血组、干预组和治疗组,每组6只.应用大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立大鼠局灶永久性脑梗死模型,采用局灶缺血再灌注进行CIP干预,使用米诺环素抑制CIP后小胶质/巨噬样细胞活化.采用免疫荧光、原位杂交、神经功能5分评定及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色,观察CIP后小胶质/巨噬样细胞活化规律,检测大鼠额顶叶皮层组织TLR2/NF-κB炎症信号通路关键因子核因子抑制剂α(NF-κb inhibitor α,IκB-α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α) mRNA的表达,比较各组死亡率、神经功能缺损程度及脑梗死体积变化. 结果 干预组大鼠小胶质/巨噬样细胞在大脑缺血性损伤后1h即存在活化,12 h迅速升高,活化速度及范围较缺血组显著增强(P＜0.05);额顶叶皮层组织IκB-αmRNA 1 h即出现表达,TNF-α mRNA12 h始终维持在较低水平,峰值水平显著低于缺血组(P＜0.05).与缺血组比较,CIP明显提高大鼠存活率,改善神经功能,缩小梗塞体积(P＜0.05),米诺环素明显抑制CIP上述神经保护作用(P＜0.05). 结论 CIP可以使小胶质/巨噬样细胞在大鼠脑缺血性损伤早期迅速活化,可能通过调控TLR2/NF-κB信号通路,抑制了脑缺血后过度炎症反应,从而发挥脑保护作用.     

α晶体蛋白与视网膜神经节细胞结合的细胞定位研究

目的对α-晶体蛋白与视网膜神经节细胞（RGCs）之间的作用进行定位研究。方法原代培养RGCs，Thy1．1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测，将α-晶体蛋白与RGCs共孵育，应用免疫细胞化学方法，对α-晶体蛋白在RGCs上的靶分子进行间接免疫标记，再以光镜、激光共聚焦显微镜和电镜观察标记物，对α-晶体蛋白与RGCs的结合进行亚细胞定位。结果Thy1．1鉴定RGCs纯度为90％～95％。RGCs免疫组化染色结果显示，α-晶体蛋白与其靶分子结合复合物在RGCs膜上呈阳性表达；共聚焦显微镜下发现RGCs有免疫荧光复合物沉积，大量呈“戒指”状分布于细胞膜，少量分布于细胞轴突上。电镜结果显示，RGCs上有免疫复合物沉积，呈“线状”分布在细胞膜上，对照组呈阴性。结论α-晶体蛋白能与RGCs发生结合，其作用靶点在RGCs膜上。α-晶体蛋白与RGCs的结合不是吸附作用，但是否为受体-配体性质的结合还需进一步验证。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA和蛋白表达的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺泡巨噬细胞Toll 样受体(toll-like receptor,TLR2/4)基因和蛋白的影响,为探讨骨髓MSCs移植对早期炎症介质的影响及炎症级联反应的调控机制做铺垫。 方法 巨噬细胞分为PBS对照组、骨髓MSCs对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对照组和LPS+骨髓MSCs处理组,各组均取1,3,6,12 h时相点。流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记阳性细胞率和巨噬细胞TLR2/4蛋白的表达;RT-PCR方法检测各组不同时相点巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;ELISA法检测各组不同时相点上清液中TNF-α浓度变化。 结果 与PBS对照组、骨髓MSCs对照组比较,LPS对照组巨噬细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.01),1h时开始增高,12h时达到峰值;同时TNF-α浓度也明显增高(P＜0.01),6h时TNF-α浓度达到峰值。与LPS对照组比较,LPS+ MSCs组巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),TNF-α浓度也降低(P＜0.01)。 结论 LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达升高,TNF-α浓度也升高,后者峰值时间出现略早,说明TLR2/4表达与TNF-α之间存在一个正反馈环;骨髓MSCs可以明显降低LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达及TNF-α浓度,说明骨髓MSCs打破了上述正反馈环。     

2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇对内毒素诱导巨噬细胞活化的影响

目的 检测2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇对细菌内毒素诱导的巨噬细胞RAW264.7释放TNF-α、IL-6及′TNF-α mRNA表达的影响.方法 RAW264.7细胞经不同浓度(0、10、20、40、80、160 mg/L)2′,5,6 ′,7-四羟基二氢黄酮醇预处理后,ELISA法分别检测LPS( 100 μg/L)刺激的RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6的水平,Real-Time PCR法检测TNF-α mRNA的表达水平.MTT法检测2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇对RAW264.7细胞活力的影响,以排除实验用量2 ′,5,6 ′,7-四羟基二氢黄酮醇的细胞毒性作用.结果 不同浓度的2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇预处理后,可显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放′NF-α和IL-6,显著抑制TNF-α mRNA的表达,并都具有量效关系.MTT实验结果显示,低于320 mg/L浓度的2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇对RAW264.7细胞无明显的毒性作用.结论 2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇能够拮抗LPS对炎症反应细胞的刺激效应,有望成为脓毒症防治药物的候选药物前体.     

谷氨酸对腺苷A2A受体调节一氧化氮合酶活力的影响

目的探讨谷氨酸是否能够影响腺苷A2A受体对一氧化氮合酶（NOS）活力的调节。方法用1000ng／ml脂多糖（LPS）刺激小胶质细胞，分别加入100nmol／L A2A受体激动剂CGS21680以及不同浓度的谷氨酸（0，1，0，25，0，5mmol／L）干预，观察NOS活力变化。结果LPS诱导NOS活力增高，激活A2A受体可以产生抑制作用；0，25及0．5mmoL／L谷氨酸和A2A受体激动剂同时存在时，NOS活力进一步增高。结论高浓度谷氨酸可逆转腺苷A2A受体激动剂抑制升高NOS活力的作用。     

α晶体蛋白促进大鼠嗅鞘细胞存活的体外研究

目的研究α晶体蛋白对离体培养的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)存活和增殖的影响,探索增强移植OECs存活和增殖的有效方法。方法取大鼠嗅球进行OECs离体培养,细胞计数检测α晶体蛋白组及对照组OECs的存活数目;Brdu掺入法及流式细胞仪检测OECs的增殖。结果 (1)培养5 dα晶体蛋白组OECs数目与对照组相比无明显差异,培养6～13 d,α晶体蛋白组OECs数目明显多于对照组(P<0.05);(2)将Brdu加入培养液中8 h后,α晶体蛋白组同视野Brdu阳性细胞数与总细胞数的百分比显著大于对照组(P<0.01);(3)α晶体蛋白组G2/M期、S期细胞数明显多于对照组(P<0.01)。结论α晶体蛋白能明显促进离体培养的OECs的存活。     

华蟾素对卵巢癌3AO细胞存活素表达的影响和意义

目的 探讨华蟾素对体外培养的卵巢痛3AO细胞存活素表达的影响和意义.方法 体外培养卵巢癌3AO细胞,采用不同浓度的华蟾素干预后,应用RT-PCR检测存活素的表达,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 卵巢癌3AO细胞对照组的存活素mRNA表达为1.01±0.13,细胞凋亡率为(2.31±0.98)%;0.25 g/L华蟾素对卵巢癌3AO细胞存活素mRNA和细胞凋亡率无影响(P＞0.05);2.5 g/L华蟾素干预后,卵巢癌3AO细胞存活素mRNA表达为0.67 ±0.16,癌细胞凋亡率为(28.69±4.16)%,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);25 g/L华蟾素与2.5 g/L华蟾素对卵巢癌3AO细胞存活素mRNA和癌细胞凋亡率的影响差异无统计学意义(P＞0.05).结论 2.5 g/L华蟾素即可抑制卵巢癌3AO细胞存活素mRNA的表达,抑制癌细胞的增殖.     

脂多糖联合三磷酸腺苷对肺上皮细胞来源A549细胞IL-1β分泌的影响及其机制研究

目的 探讨白细胞介素1β(IL-1β)在脂多糖(LPS)联合三磷酸腺苷(ATP)诱导的人肺上皮细胞来源A549细胞中的表达变化及其机制.方法 以肺上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,采用Western blotting法确认A549细胞中是否存在NLRP3炎症体各组件蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)的表达.检测不同浓度LPS(0、1、5、10、50、100μg/ml)对A549细胞NLRP3炎症体通路蛋白表达(Western blotting检测)及IL-1β分泌(ELISA法)的影响,选择最佳LPS浓度.采用LPS联合ATP(LPS+ATP)刺激A549细胞,并检测其对NLRP3炎症体通路蛋白表达和IL-1β分泌的影响.采用siRNA干扰A549细胞NLRP3基因,观察LPS+ATP诱导的A549细胞中IL-1β的分泌情况.结果 Western blotting检测结果显示,A549细胞中存在NLRP3炎症体组件蛋白NLRP3、ASC、caspase-1的表达.与对照组比较,LPS单独处理细胞后,NLRP3、pro-IL-1β、caspase-lp45蛋白表达增加(P＜0.05),且呈剂量依赖关系,但未检测到活化形式caspase-lp20蛋白的表达及细胞因子IL-1β的分泌.与LPS单独刺激组相比,LPS+ATP刺激组可检测到活化形式的caspase-lp20蛋白表达及细胞因子IL-lβ分泌(P＜0.05).采用siRNA干扰NLRP3基因表达可显著抑制LPS+ATP诱导的IL-1β表达(P＜0.05).结论 A549细胞中存在NLRP3炎症体通路,LPS+ATP诱导A549细胞分泌的细胞因子IL-lβ在下调NLRP3基因后显著减少,初步提示IL-1β的释放受NLRP3炎症体途径调控.     

曲古菌素A对脂多糖致急性肺损伤小鼠的保护作用观察

目的 探讨曲古菌素A(TSA)对脂多糖(LPS)所致急性肺损伤小鼠的保护作用及其机制.方法 健康雄性BALB/c小鼠60只,随机分为空白对照组、TSA组(灌胃给予TSA1mg/kg)、LPS组(气管内给予LPS1mg/kg)及TSA+LPS组(气管内给予LPS前1h灌胃给予TSA),每组15只.分别于处理后1、3、6、12、24h获取各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),采用ELISA法检测其中TNF-α和IL-1 β的浓度,并取肺组织测定肺干湿重比,HE染色后行病理组织学观察,ELISA法检测组织匀浆中髓过氧化物酶(MPO)活性及一氧化氮(NO)浓度.结果 与空白对照组及TSA组比较,LPS组小鼠肺组织可见明显的炎性细胞浸润等急性肺损伤病理学征象,肺组织湿干重比、MPO活性、NO浓度及BALF中TNF-α、IL-1 β浓度均明显升高(P＜0.05).与LPS组比较,TSA+LPS组上述改变均明显受抑,肺组织损伤减轻,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TSA对LPS诱导的急性肺损伤有保护作用,可能与其抑制了炎性细胞因子的生成有关.