牙龈卟啉单胞菌FtsZ的C末端和N末端氨基酸残基缺失对其GTPase活性的影响

目的：探讨牙龈卟啉单胞菌（Pg）丝状温度敏感蛋白质（FtsZ）的C末端和N末端氨基酸残基缺失对其GTPase活性的影响,阐明PgFtsZ GTPase的功能区域,为牙周病的防治提供实验依据。方法：将质粒pEZ1(Wt PgFtsZ,含野生型PgFtsZ的基因)、pYW1（ZΔC01,从PgFtsZ的C末端去除73个氨基酸残基的变异型）、pYW2（ZΔC02,从PgFtsZ的C末端去除128个氨基酸残基的变异型）、pYWN1（ZΔN01,从PgFtsZ的N末端去除43个氨基酸残基的变异型）和pYWN2（ZΔN02,从PgFtsZ的N末端去除205个氨基酸残基的变异型）分别导入E.coli BL21(DE3)pLysS中表达目的蛋白,然后分离和纯化WtPgFtsZ、ZΔC01、ZΔC02、ZΔN01和ZΔN02,将pET3a 载体导入E.coli BL21(DE3)pLysS中作为空白对照。采用Malachite green assay法检测Wt PgFtsZ、ZΔC01、ZΔC02、ZΔN01和ZΔN02的GTPase活性,沉淀法检测体外聚合功能,光学显微镜下观察Wt PgFtsZ和各种变异型PgFtsZs过表达时E.coli细胞形态变化。结果：除ZΔN01外,ZΔC01、ZΔC02和ZΔN02的GTPase的活性值均较Wt PgFtsZ降低（P<0.05）,10 mmol•L^-1 CaCl2可使Wt PgFtsZ和各种变异型PgFtsZs的活性下降（P<0.05）;除ZΔN02以外,10 mmol?L-1 CaCl2均可诱导Wt PgFtsZ、ZΔC01、ZΔC02和ZΔN01的体外聚合反应。Wt PgFtsZ、ZΔC01和ZΔC02在E.coli细胞中过表达时,细胞呈细长丝状,与仅含有pET3a载体作为空白对照的E.coli相比细胞明显变长;ZΔN01和ZΔN02在E.coli中过表达时,E.coli细胞形态与仅含有pET3a载体作为空白对照的E.coli细胞形态相似。结论：PgFtsZ N末端的ZΔN01和ZΔN02之间的162个氨基酸残基及C末端的128个氨基酸残基与PgFtsZ 的GTPase活性有关,二价阳离子Ca2+能抑制PgFtsZ的GTPase活性,促进其体外聚合的功能。     

As2O3对胃癌细胞周期及端粒酶活性的影响

目的 探讨三氧化二砷（As2O3)对SGC－7901胃癌细胞端粒酶活性及细胞周期的影响及其机制。方法 细胞凋亡、细胞周期分布及相关蛋白的表达采用流式细胞术;端粒酶活性的检测采用端粒末端重复序列扩增－ELISA法（TRAP－ELISA）,端粒酶亚单位mRNA及c-myc mRNA的表达采用RT－PCR技术。结果 As2O3可明显抑制SGC-7901细胞的生长,细胞凋亡率明显增加,C0/G1期细胞减少,S和G2／M期细胞增加,Bcl-2、c-myc、PCNA蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加,端粒酶活性明显下降;端粒酶亚单位hTR是TP1 mRNA无明显变化,hTRT mRNA表达减少,同时,c-myc mRNA的表达亦减少。结论 As2O3对SGC－7901细胞的抑制作用可能是通过二条途径实现：一个是诱导细胞凋亡,另一个是通过下调hTRT mRNA的表达来下调端粒酶活性,其机制有可能与c-myc和Bcl-2基因的减少以及Bax基因的增加有关。     

类泛素蛋白FAT10共价结合底物蛋白质的活性分析

 目的 探讨类泛素蛋白FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域结合修饰底物蛋白质的活性。方法 分别将野生型全长FAT10,C末端双甘氨酸的缺失突变体FAT10ΔGG,分别包含N端、C端泛素结构域的截断突变体FAT10 N和FAT10 C构建到真核表达载体中,转染HEK293T细胞,并使用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。利用Western blot方法检测野生型FAT10及其突变体结合底物蛋白质的活性。结果 与野生型FAT10的蛋白质底物结合能力相比,FAT10ΔGG、FAT10 N、FAT10 C与底物蛋白质结合能力均显著下降。蛋白酶体抑制剂MG132能够促进FAT10及其突变体的底物结合活性。结论 FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域都是FAT10与底物共价结合所需的活性基团,被FAT10标记后的底物蛋白质通过26S蛋白酶体途径降解。     

重组人apo（a）kringleⅣ—10的融合表达及性质鉴定

目的：探讨人血浆脂蛋白（ａ）的赖氨酸结合功能的结构基础。方法：利用基因重组质粒在Ｅｃｏｌｉ菌株中表达野生型和变异型ａｐｏ（ａ）ＫｒｉｎｇｌｅⅣ－１０的ＧＳＴ融合蛋白,经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ａｇｒｏｓｅ亲和层析纯化,通过Ｌｙｓｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和柱检测它们的赖氨酸结合能力。结果：野生型ｋｒｉｎｇｌｅⅣ－１０的融合蛋白具有较强的赖氨酸结合能力,而变异型ｋｒｉｎｇｌｅⅣ－１０的融合蛋白则无此功能。     

组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基对酶活性的作用

目的探讨组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基在酶活性中的作用。方法通过基因点突变,将大鼠组织蛋白酶E内羧基端的活性部位基序中第284位苏氨酸残基用丝氨酸进行替代,构建变异体T284S。结果当将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在HEK293T细胞中进行异源表达时,在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体T284S仍具有自我转化为成熟型酶的能力,尽管它们的酶活性只是野生型的40％,变异体的Km值与野生型的相似,但它的Keat值却比野生型显著下降。变异体和野生型酶都被胃酶抑素和蛔虫胃蛋白酶抑制剂所抑制,Ki值几乎相同。变异体在各种酸碱度下的圆二色光谱与野生型基本相同。结论（1）第284位苏氨酸残基对酶的催化活性确实非常重要。变异体T284S酶催化活性的下降是由于多出来的甲基使活性部位氢键的分布发生改变,从而使酶与底物的作用模式发生改变。（2）BACE-1不能被胃酶抑素抑制,可能与羧基端结构域的活性部位基序差异无关,而与BACE1蛋白结构中的其它部分有关。     

血红素加氧酶-1中第39位赖氨酸对电子传递功能的影响

验证血红素加氧酶－１中的第３９位赖氨酸对电子传递的影响。方法通过定眯诱变将Ｋ３９置换为酸性氨基酸谷氨酸（Ｅ）将将得到的变异型酶基因克隆到高度表达的载体上表达，提纯变异型ＨＯ，测定其活性，比较变异型酶与野生型酶的活性区别，以了解高保守的碱性氨基酸Ｋ３９对电子传递的影响。结果ＨＯ催化血红素的体反应，由抗坏血酸提供电子时，变异型糖Ｋ３９Ｅ与野生型酶比较活性没有显著性差异。而ＨＯ催化血畿素的模拟体内反应，     

葡萄球菌肠毒素B突变体的纯化及其活性

目的：从重组菌中纯化和葡萄球菌肠毒素B（SEB）突变体及其野生型蛋白,研究其毒力及抗原性。方法：表达野生型SEB蛋白（SEB－N）和SEB突变体（SEB－M23、SEB－150）的3株重组菌经IPTG诱导,反复冻融后,制备细菌裂解液。将初步纯化和抗SEB抗血清与CNBr活化的Sepharose4B作共价偶联,制成亲和层析柱,分柱纯化SEB－N、SEB－M23和SEB－M150蛋白。用SDS－PAGE和酚试剂改良法对纯化蛋白作纯度鉴定和定量;用双向免疫扩散试验和ELISA法作抗性鉴定;用经性试验作毒力鉴定。结果：SDS－PAGE和双向免疫扩散试验表明,3种纯化蛋白均为单一条带,且都能与抗SEB抗体形成明显的沉淀线。ELISA表明SEB－N、SEB－M23、SEB－M150SEB一有相似的结合力,提示23位突变和150位突变并未改变SEB的抗原表位,小鼠致死性试验表明,LPS激发的3组小鼠（6只／组）,分别用上述纯化蛋白攻击（10μg/只）,SEB－N组死亡率为5／6;SEB－M150组死亡率为4／6;-23组死亡率为0／6;即使SEB－M23剂量增至200μg,小鼠仍无死亡。结论：获得了SEB－N、SEB－M23和SEB－M150 3种纯化蛋白,其中SEB突变体都保留了抗原性;SEB－M23与野生型SEB相比,毒力明显下降,为进一步研究其作为新型淋巴细胞激活分子或超抗原疫苗打下基础。     

丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对干扰素刺激应答元件的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C Virus,HCV） 1b基因型（genotype 1b,GT-1b）C区氨基酸（amino acid,aa）70替代对干扰素刺激应答元件（interferon-stimulated response element,ISRE）的影响.方法 首先构建HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,测序鉴定后瞬时转染肝瘤细胞系Huh7细胞,Western blot法鉴定HCV核心蛋白的成功表达;然后利用ISRE双荧光素酶报告基因实验检测核心蛋白表达对ISRE活化的影响,并以SYBR Green real-time PCR检测3种主要干扰素刺激基因（interferon stimulated genes,ISGs）的表达情况.结果 构建了HCV aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,并在体外培养细胞中成功表达.但野生型和变异型核心蛋白表达对ISRE活化及3种主要ISGs表达的影响无明显差异.结论 单纯R70Q/H变异的核心蛋白似乎并不足以直接导致IFNα耐药.     

组织蛋白酶E氨基端催化性残基的确定

目的 验证组织蛋白酶E保守基序DTG中第98位天门冬氨酸残基为组织蛋白酶E氨基端催化性残基.方法 通过基因定点突变技术将第98位天门冬氨酸残基用丙氨酸替代,制成变异体D98A,并将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在人胚胎肾293T细胞中进行异源表达.结果 在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达.突变体D98A酶原在酸性条件下不能转变为酶,也没有酶活性.结论 组织蛋白酶E第98位天门冬氨酸残基是酶的催化性残基,对酶的催化活性非常重要.     

肝癌组织芭向性正义与反义表达载体pEBAF／N—ras的构建

目的：用分子克隆技术构建肝癌组织特异性N－ras cDNA正义与反义表达载体。方法：用BamHI酶切携带目的基因的质粒pZIP-NeoSV(X)1,获得1．06kb N-ras cDNA；同时以BamHI将载体pEBAF线性化，并行去磷酸化修饰，用T4 DNA连接酶将两者连接，转化感受态细菌DH5α。先以酶切和随机引物法标记的N－ras cDNA探针进行菌落原位杂交筛选阳性重组克隆，再以PvuⅡ酶切鉴定插入方向，同时进行DNA测序和同源性分析。结果：成功构建肝癌组织特异性正义与反义表达载体pEBAF/s-N-ras和pEBAF/as-N-ras。结论：成功构建的N－ras cDNA正／反义表达载体，为原发性肝癌的发生机理和基因治疗研究奠定良好的基础。     

huGM—CSF（9—127）—IL—6（29—184）融合蛋白基因的构建及表达

目的构建及表达具有huGM-CSF和huIL-6双重生物学活性的huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白分子.方法应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造,同时在二者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3,克隆PCR产物,并构建成pBV220-GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)表达质粒,表达质粒导入E.coli DH5α中诱导表达.通过Q Sepharose H.P.离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白.使用huGM-CSF依赖细胞株TF1和huIL-6依赖细胞株B9通过MTT法测量融合蛋白的生物学活性.结果 pUC18-GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)的测序结果表明,其序列与理论设计完全一致,表达质粒在E.coli DH5α中得到高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白含量的25%以上,表达产物以包涵体的形式存在,通过Q Sepharose H.P.离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化及复性后获得目的蛋白,其纯度达到95%以上.融合蛋白具有huGM-CSF和huIL-6的双重生物学活性,其促进huGM-CSF依赖细胞株TF-1和huIL-6依赖细胞株B9增殖的比活性分别为1.08×108U/mg和1.95×107 U/mg.结论获得了具有较高纯度和双重生物学活性的GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白.     

P53与端粒重复序列结合蛋白质1的体外相互作用

目的:通过分析端粒主要结合蛋白中端粒重复序列结合蛋白质1(Telomeric repeat binding protein 1,TRBP1)与P53的体外结合,探讨P53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制.方法:谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)和人P53-GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-SepharoseTM4B纯化后,和人乳腺癌细胞MCF-7细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot检测反应物中P53和TRBP1的结合.融合蛋白中人P53包括野生型(1～393)、C端缺失体P53 N5(2～293)、N端缺失体P53 2C(95～393)、175单个氨基酸突变体P53 R175H(R→H).结果:聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝R250染色显示,纯化的GST和4种P53-GST蛋白纯度在90%以上,且分子量与预计的完全一致.TRBP1的Western blot显示,野生型P53和P53-R175H均能沉淀MCF-7中的TRBP1,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRBP1的作用.与野生型P53和P53 R175H相比,P53 2C与TRBP1的结合力明显增加,P53 N5与TRBP1的结合力明显减弱.结论:P53和TRBP1可以直接体外结合,P53的C端(293～393)是与TRBP1结合的结构域.P53和TRBP1结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关.     

新型甲型H7N9流感病毒血凝素基因进化分析

目的探讨2013年4月流行的新型甲型H7N9禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)基因的进化,以及氨基酸的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)中下载H7N9流感病毒以及有代表性的H7N2、H7N3、H7N7亚型流感病毒的HA基因序列,运用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)version 5.05软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析HA蛋白受体结合位点、糖基化位点和裂解位点的变化。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒与2011年浙江禽类H7N3流感病毒株(JQ906573.1)的相似性达到95.3%～95.6%;受体结合位点氨基酸发生变异,为Q226L,5个糖基化位点高度保守;HA裂解位点位于aa339和aa340之间,仅有1个碱性氨基酸:R。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒HA基因是由中国禽类H7亚型进化而来,Q226L变异导致的受体结合位点的变化可能是新型流感病毒具有人感染性的原因。     

新型甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的探讨2013年新型甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化,及其编码蛋白重要氨基酸位点的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)下载不同年代、不同地区甲型流感病毒N9亚型的NA基因序列,利用MEGA 5.05和BioEdit软件对基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒NA基因与2010年捷克共和国H11N9禽流感病毒的相似性达到96%;新型流感病毒存在5个氨基酸的缺失;其中1株新型病毒可能的酶活性位点发生了变异。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒的NA基因可能是由H11N9进化而来;氨基酸的缺失可能是造成人感染和较高病死率的原因。     

小鼠ACE2基因的克隆和体外表达以及序列分析与组织分布

目的:深入研究血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在心血管疾病发病机理中的作用及在高血压基因治疗中的应用,克隆和体外表达小鼠ACE2基因,并进行核苷酸和氨基酸序列分析和组织分布特征研究.方法:采用RT-PCR方法,从小鼠肾组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,TA克隆到pGEM-T easy载体,亚克隆到pcDNA3.1 载体,构建重组真核表达质粒pmACE2,测序鉴定.采用脂质体法将pmACE2转染Cos7细胞,分别用RT-PCR和SDS-PAGE检测ACE2的转录和表达.CLUSTALX 1.8生物软件分析小鼠和大鼠及人ACE2蛋白的多序列比较.采用RT-PCR技术研究小鼠ACE2组织分布的特异性.结果:①RT-PCR扩增片段约2.6 kb,重组真核表达质粒pmACE2测序结果表明,克隆片段存在A701G、T1102C和T1330C 3处变异,其序列与以往报道不一致,cDNA全长为2 397 bp,而与NCBI Refseq数据库(XM-136130)中cDNA全长1 902 bp不符;②SDS-PAGE显示pmACE2表达产物的相对分子量约80 kD;③氨基酸序列分析表明,小鼠ACE2主要由N末端的信号肽序列(第1-18位残氨)、含有锌结合位点保守序列HHEMGHIQ(第373-380位残氨)的催化结构域和跨膜结构域(第738-765位残氨)组成;④小鼠ACE2与人有84%的相似性,与大鼠有90%的相似性,三者同源;⑤ACE2在肺、心和肾组织中大量表达,在睾丸和肝组织中也有表达.结论:成功克隆并体外表达了小鼠ACE2基因,不同物种ACE2组织分布的特异性不尽相同.     

氯胺-T氧化C5、体外组装补体膜攻击复合物及其鉴定

目的：利用氧化的方法在无酶解反应发生的情况下获得活化形式的C5，进而实现以纯化的补体终末成分体外组装补体膜攻击复合物（MAC）。方法：以蛋氨酸氧化剂氯氨-T与纯化的C5相互作用后，加入C6组装具溶血活性的C56复合物。以此复合物与NHS或纯化的后续终末补体成分组装MAC，检测复合物的溶血活性。结果：反应性溶破实验证实，氯胺-T氧化C5与C6组装形成功能C56复合物，后者可与NHS或纯化的补体终末成分C7-C9体外组装具溶血性的MAC，并且所形成的C56复合物在24h达到最大的溶血活性，48h仍保持稳定。结论：氯胺-T在不裂解C5的条件下产生了C5b样活性分子，该分子能与C6组装形成稳定的活性复合物，并可与其它补体终末成分组装产生活性MAC。     

胆红素氧化酶及其变异体在胆红素血症评价中的应用

目的探讨胆红素氧化酶巾配位氨基酸对保持酶活性的重要性和酶促反应的动力学，并评价胆红素氧化酶突变体能否作为一种更好的高胆红素血症的诊断试剂方法胆红素氧化酶突变体1402G和C457S通过聚合酶链反应获得，并经氨基酸序列测定加以证实.钌搀杂的突变体C457S通过变异体与钌配合物的直接反应得到。研究了重组胆红素氧化酶及其变异体的光谱学性质，以及重组胆红素氧化酶和变异体1402G的酶促反应的动力学：结果变异体1402G和C457S被成功的表达和纯化变异体1402G表现出较低的活性（1．67U／mg），C457S则完全失去了活性（0U／mg），但是钌搀杂的突变体C457S表现出较高的活性（5．50和6．42U／mg）.光谱学实验结果表明1402G突变体在较低的pH时第一类铜呈＋1价态，即还原态：突变体C457S中失去第一类铜，使得突变体无法保持完整的活性中心，从而失去了酶活性．酶促反应的动力学实验显示重组胆红素氧化酶和变异体1402G动力学参数kca.分别为235．8min^-1。和6．9min^-1，说明重组胆红素氧化酶具有很高的催化能力结论配位的氨基酸对保持重组胆红素氧化酶及其变异体活性中心的完整性和酶活性具有重要的意义：重组胆红素氧化酶远比突变体1402G和C457S的活性高，说明突变体1402G和C457S不适合作为诊断试剂.钌搀杂有助于在突变体C457S中形成新的完整的活性中心，从而产生酶活性。     

Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 and telomerase activity

Objective To study the effect of hepatitis C virus nonstructural protein NS(3) （HCV NS(3)） on telomerase activity and carcinogenesis.Methods Streptavidin-peroxidase (SP) conjugated method was used to detect the expressio n of HCV NS(3) protein in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-5’ and pRcHCNS(3)-3’. Telomerase activity was detected by an in situ telomerase a ctivity labeling method, telomeric repeat amplification protocol polymerase chai n reaction (TRAP-PCR) and telomerase PCR enzyme linked immunosorbent assay (ELI SA) technology in the transfected and non-transfected NIH3T3 cells.Results HCV NS(3) protein was expressed in the NIH3T3 cells transfected with plasmid pR cHCNS(3)-5’ expressing HCV NS(3) C-terminal deleted protein or with plasmid pR cHCNS(3)-3’ expressing HCV NS(3) N-terminal deleted protein. The positive sig nal of HCV NS(3) protein was localized in the cytoplasm of NIH3T3 cells, and th e signal intensity of the former was stronger. Telomerase activity in NIH3T3 c ells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-5’ was stronger than that in NIH3T3 c ells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-3’ (P&lt;0.01), whereas telomerase a ctivity in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcCMV or untreated NIH3T3 ce lls was weaker than that in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-3 ’ (P&lt;0.05). The expression level of HCV NS(3) protein was significantly co rrelated with the strength of telomerase activity (P&lt;0.05). The results ob tained by in situ telomerase activity labeling corresponded to the results by te lomerase PCR ELISA technology. Conclusions HCV NS(3) protein may activate telomerase through endogenous mechanism to induce host cell transformation. The effect of HCV NS(3) C-terminal deleted protein on telomerase activity in the host cell may be stronger than that of HCV NS(3) N -terminal deleted protein. In situ telomerase activity labeling was a reliabl e technology for studying pathological morphology and telomerase activity in tis sues and cells.     

Molecular analysis of THH—induced mutations at HPRT locus in human promyelocytic leukemia cells with multiplex polymerase chain reaction

Objective: To study the genotoxicity and antitumor activity of a Chinese medicinal herb, Triptery-gium Hypoglaucum (Level) Hutch (THH). Methods: The genotoxicity and antitumor activity of THH were investigated in human promyelocytic leukemia cells on the mutation of hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene by using single cell clone culture, two-way screening counting, multiplex PCR amplification and gel electrophoresis. Results: The results showed that different mutant spectra existed between the spontaneous mutation and induced mutation by THH. Only 7. 7% (1/13) of spontaneous mutants showed deletion mutations, whereas the induced mutants included 46. 6% (27/58) deletions. Mapping of all intra-genic deletion breakpoints showed a random distribution in all 9 exons, but toward the 3'-end of the HPRT gene. Deletion of exon 1 only appeared when whole gene was deleted. Deletions of exon 7/8 and 9 often showed linkage deletions (71. 4%). Conclusion: THH can induce the mutation, mainly dele     

毕赤酵母表达人胰岛素前体的纯化和N末端不均一性分析

利用毕赤酵母生产人胰岛素前体时,在胰岛素前体的N末端引入一段由10个氨基酸组成的间隔肽(EEAEAEAEPK)虽然可以提高目的产物的表达量,但间隔肽中的多个酶切位点有可能造成目的产物N末端的不均一性。对毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体蛋白进行分离纯化,得到的样品经过MALDI TOF MS和N末端测序,证实了胰岛素前体N末端不均一性的现象,并对产生不均一性的原因进行了分析。实验同时证实,利用毕赤酵母得到的胰岛素前体,经胰蛋白酶酶切后,生成了B链缺少第30位苏氨酸但N末端均一的胰岛素产物desB30,且C末端未发生降解,这为人胰岛素和地特胰岛素的制备提供了新思路。