RNA干扰技术沉默上皮型钙黏蛋白表达对体外培养的喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的　通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术沉默喉癌He p - 2 细胞上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,探讨E-cadherin对Hep-2细胞增殖能力的影响。方法　设计、合成特异性小干扰RNA（siRNA）和无基因沉默功能的阴性siRNA转染Hep-2细胞,获得下调E-cadherin基因表达的体外培养的Hep-2细胞;荧光定量PCR检测E-cadherin基因的沉默效果;体外细胞增殖实验（MTT）检测Hep-2细胞体外增殖能力的变化。结果　①重组质粒和脂质体质量体积按1：1转染时,转染效率最高组siRNA-3达65%。②荧光定量PCR：重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-siRNA1、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA2、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA3使E-cadherin mRNA的表达下调。以空白对照组为基准（设为1）,E-cadherin相对于β-actin的改变倍数siRNA-1组=0.00092,siRNA-2组=0.00143,siRNA-3组=0.00045,阴性对照组=3.44898,差异有统计学意义。③MTT：经特异性siRNA处理的Hep-2细胞生长速度较对照组增快,差异有统计学意义。结论　有效抑制Hep-2细胞E-cadherin mRNA的表达使Hep-2细胞的增殖能力增强。     

RNA干扰沉默Aurora-A基因抑制喉癌Hep-2细胞生长的实验研究

目的 研究RNA干扰沉默Aurora-A基因后对喉癌Hep-2细胞体外体内生长的抑制作用.方法 构建靶向Aurora-A的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染喉鳞癌Hep-2细胞株,采用CCK-8实验、Transwell实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内接种观察Aurora-A沉默后Hep-2细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力以及体内肿瘤生长情况,Western blot和免疫组化检测参与细胞黏附侵袭的重要因子黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达情况.结果 Hep-2细胞转染Aurora-A siRNA 后,siRNA-3实验组的Aurora-A蛋白的表达下降了52％,CCK-8实验中siRNA-3组细胞的平均(x±s)吸光度值为(3.268±0.106),低于Hep-2细胞组的(3.722 ±0.152),差异有统计学意义(F=17.634,P＜0.01);Transwell实验显示,siRNA-3组每个视野的平均侵袭细胞数目为(110.0±18.0)个,较Hep-2组的(236.0 ±26.0)个减少,两组差异有统计学意义(F=26.462,P＜0.01);克隆形成实验中,siRNA-3组平均集落数目(31.0±6.6)个,低于Hep-2组平均细胞集落数目(104.0±14.0)个(F=75.321,P＜0.001).接种后,体内移植瘤生长受到抑制,siRNA-3组的肿瘤平均体积为(127.77±174.83) mm3,低于Hep-2组的肿瘤平均体积(837.26±101.80) mm3(F=28.187,P＜0.001).在体外和体内黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达也下降.结论 抑制Aurora-A基因后,通过降低黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达,抑制Hep-2细胞的生长,减弱肿瘤细胞的恶性侵袭性,Aurora-A可以成为喉鳞癌治疗良好的干预靶点.     

小RNA干扰细胞周期蛋白Y基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术下调细胞周期蛋白Y(Cyclin Y,CCNY)基因的表达,观察其对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 构建针对CCNY基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,包装慢病毒感染喉癌Hep-2细胞.将细胞分为2组,对照组和实验组(感染CCNY shRNA慢病毒组).运用Real-time PCR检测CCNY在RNA水平的变化;四甲基偶氮唑蓝法和平板克隆形成实验检测CCNY表达下调对细胞增殖的影响.结果 成功包装表达CCNYshRNA的慢病毒并感染Hep-2细胞,shRNA下调CCNY的表达后,与对照组相比CCNY在mRNA水平的表达显著下降,抑制率为75.3％ (P ＜0.05).表达CCNY shRNA的慢病毒感染5d后,继续培养6d,细胞的生长明显受到抑制(P ＜0.001).细胞在体外培养10 d后形成克隆的潜力降低了60％.结论 靶向CCNY基因RNA干扰能够阻抑喉癌Hep-2细胞的CCNY表达,抑制细胞增殖,CCNY基因有望成为喉癌基因治疗靶点.     

RNA干扰细胞周期蛋白D1对Hep-2周期和凋亡的影响

目的研究小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)抑制细胞周期蛋白D1(cyclin D1)对喉鳞状细胞癌(简称喉癌)细胞生长和凋亡的影响。方法通过脂质体转染试剂将针对cyclin D1的特异小干扰RNA转入喉癌细胞,利用MTT法检测喉癌细胞生长抑制情况,流式细胞技术检测喉癌细胞周期变化和细胞凋亡。结果MTT结果表明喉癌细胞生长受到抑制,并具有时间依赖性。同时实验组喉癌细胞周期受到影响,并检测到喉癌细胞的凋亡。结论Cyclin D1基因沉默后,喉癌细胞生长受到了抑制,细胞周期受到影响,并能够最终导致喉癌细胞凋亡。     

TrkB通过调控PI3K/AKT途径诱导喉癌Hep-2细胞上皮间质化发生的作用机制研究

目的　观察TrkB如何通过PI3K/AKT通路诱导喉癌Hep-2细胞上皮间质化发生的作用机制并探讨其意义。方法　分别用含0、100、500、1000 nmol/L抑制剂K252a作用于Hep-2细胞,CCK-8法检测细胞的增殖活性,划痕法检测细胞的迁移能力,Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,同时用Western-blot检测Hep-2细胞中p-Akt、p-c-Src、E-cadherin蛋白的表达情况。结果 100 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为17.8%、20.5%、19.7%;500 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为48.2%、46.8%、45.9%;1000 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为51.3%、83.0%、81.5%;K252a（1000 nmol/L）组迁移率及穿膜细胞数分别为21%及46,对照组迁移率及穿膜细胞数分别为69%和221,差异均具有统计学意义（t =1.235、t =3.416,P 均<0.01）;与对照组比较,K252a（1000 nmol/L）组Hep-2细胞中p-Akt及p-c-Src蛋白表达量显著降低,分别为0.93±0.12、0.21±0.05、0.72±0.09、0.14±0.02,差异均有统计学意义（t =3.578、2.634,P 均<0.01）;且对照组中E-cadherin蛋白表达量为0.14±0.02,K252a（1000 nmol/L）组Hep-2细胞中E-cadherin蛋白表达量为0.75±0.08,差异有统计学意义（t =2.852,P <0.01）。结论 TrkB可能通过激活PI3K/Akt信号通路来诱导喉癌细胞EMT的发生。     

RNA干扰Jabl基因对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖影响

目的 通过脂质体将人工合成的Jab1 siRNA Ⅱ包裹后导入人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)中,使Jab1基因的表达受到抑制,并通过不同的方法来观察Jab1 siRNA Ⅱ对Jab1基因的表达及细胞增殖影响.方法 MTT法检测Jab1 siRNA Ⅱ不同时间对Hep-2细胞增殖的影响,RT-PCR方...     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

RNA干扰技术沉默热休克蛋白70对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

<正>喉癌是上呼吸道常见的恶性肿瘤,严重影响着人类的健康。研究表明热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)在正常组织中多不表达,但在包括头颈鳞状细胞癌在内的多种肿瘤组织却有异常表达。肿瘤细胞中高表达的HSP70,对细胞的增殖、侵袭及转移、机体对肿瘤治疗耐受性的发生及肿瘤预后等方面均有很重要的作用[1]。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来发展起来的一项新的基因技术,可抑制与肿瘤有关的不同基因而控制     

RAN干扰抑制AQP1表达对Hep-2细胞迁移能力影响的实验

目的通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）抑制Hep-2细胞中水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP1）的表达,探讨AQP1对喉癌细胞黏附、运动及侵袭能力的影响。方法构建AQPl特异性的siRNA重组质粒,免疫组化检测RNAi抑制AQP1表达的效果;分别用细胞基质黏附实验、Transwell小室和Matrigel基质侵袭实验检测细胞黏附、运动和侵袭能力。结果AQP1-siRNA重组质粒有效的抑制了Hep-2细胞中AQP1的表达。细胞基质黏附实验结果显示：Hep-2细胞与细胞外基质的黏附率,AQP1-siRNA实验组为（41．6±4．2）％与阴性对照组（43．6±3．9）％和空白对照组（45．2±4．0）％无明显差异（尸均〉0．05）;体外细胞运动和侵袭实验结果显示：Hep-2的穿膜细胞数,实验组分别为（36±3）和（23±4）个／高倍镜,显著低于空白对照组的（70±5）和（65±4）个,高倍镜以及阴性对照组的（72±4）和（69±4）个／高倍镜（P均〈0．01）,而后两组细胞间运动和侵袭能力方面差异均无显著性（P〉0．05）。结论AQP1 RNAi重组质粒能够阻断AQP1的表达,对Hep-2细胞的黏附力没有影响,但能够抑制喉癌细胞的运动和侵袭能力,与喉癌的转移机制密切相关。     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

表皮生长因子受体信号通路调控E-cadherin表达影响喉癌细胞增殖和侵袭的机制

目的　探讨表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路调控喉癌细胞E-cadherin表达并影响细胞增殖、侵袭等生物学行为的机制。方法　采用外源性的EGFR激动剂表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼干预体外培养喉癌Hep-2细胞,检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移力和侵袭力及相关蛋白表达改变。结果 EGF呈时间和浓度依赖性促进喉癌细胞增殖,并使喉癌细胞G1期比例减少而S期比例增加,细胞迁移距离及侵袭能力明显增加;厄洛替尼呈时间和浓度依赖性抑制喉癌细胞增殖,并导致喉癌细胞G1期比例增加而S期比例减少,同时增加细胞凋亡率,细胞迁移距离及侵袭能力均明显低于对照组。Western blot检测发现EGF干预使喉癌细胞E-cadherin表达下调而Vimentin表达上调,而厄洛替尼干预后喉癌细胞E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调。结论 小分子酪氨酸激酶抑制剂阻断EGFR信号通路导致喉癌Hep-2细胞E-cadherin表达上调,并抑制细胞增殖和侵袭转移能力。     

MDR1基因RNA干扰逆转喉癌细胞多药耐药性的研究

目的采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术通过敲减MDR1基因编码的P糖蛋白的表达,逆转人喉癌耐药细胞系（LSC-1,WⅨ）对于化疗药物的多药耐药性（multidrugresistance,MDR）。方法采用表达MDR1shRNA（smallhairpinRNA）的慢病毒载体转染LSC-1/TAX细胞,干扰MDR1mRNA。体外MTT实验观察其对各种化疗药物敏感性,裸鼠荷瘤试验在体检测其对TAX的敏感性,通过免疫组化方法在蛋白水平检测体内外细胞中MDR1基因的表达。结果体外逆转LSC-1／TAX喉癌细胞对多种化疗药物的MDR,裸鼠荷瘤试验显示细胞化疗药物的敏感性被成功回复。免疫组化方法证实MDR1shRNA可以在体内外有效地敲减MDRl基因的表达。结论表达MDR1shRNA的慢病毒载体可以在转录后明显降低MDR1基因的表达,从而提高喉癌细胞对常用化疗药物的敏感性。     

靶向c-myc基因的siRNA抑制喉癌细胞系Hep-2的研究

目的:探讨siRNA靶向人c-myc基因对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的抑制作用.方法:根据人c-myc基因设计和合成siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep-2细胞,进行MTT、形态学和实时PCR法检测,观察其干扰效果.结果:①MTT结果显示人端粒酶siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖;②实时PCR结果显示转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-myc mRNA表达明显减弱,转染组S3 c-myc mRNA 抑制率达到94%;③形态学结果显示人c-myc siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,肿瘤细胞异形性减小.结论:靶向c-myc的siRNA能显著抑制喉鳞状细胞癌生长增殖.