干细胞因子反义寡核苷酸对小鼠成纤维细胞-肥大细胞相互作用的影响

目的探讨干细胞因子介导的成纤维细胞-肥大细胞相互作用在哮喘病理生理过程中的作用。方法以SCF反义寡核苷酸(SCF ASON)转染成纤维细胞NIH3T3,免疫组化和RT-PCR法检测SCF的表达;从小鼠骨髓中分离肥大细胞,建立与NIH3T3共育体系,加入10 mg/L SCF ASON,通过ELISA法和荧光测定法检测上清液中组织胺和Eotaxin的含量;绘制NIH3T3和肥大细胞生长曲线;丫啶橙染色、流式细胞仪检测肥大细胞的凋亡。结果SCFASON可显著抑制NIH3T3产生SCF;以SCF ASON干预共培养体系后,成纤维细胞生长受抑,肥大细胞出现凋亡(14.0%±0.81%,96 h);组胺[3.08±0.38]μg/L比较(3.83±0.4)μg/L,P<0.05]和Eotaxin的产生[(4.40±0.33)μg/L比较(5.79±0.40)μg/L,P<0.05]减少。结论SCF可能通过抑制肥大细胞凋亡,促进肥大细胞激活和成纤维细胞增殖,参与哮喘的发生、发展。     

PC-1基因表达诱导NIH3T3细胞恶性转化

目的 通过建立稳定表达外源PC-1基因的小鼠成纤维细胞株,初步探讨PC-1基因表达对肿瘤发生、发展的影响。方法 通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3、1(-)／myc-his-pc-1稳定转染NIH3T3细胞,之后利用PCR、逆转录PCR(RT-PCR)技术,确定外源PC-1基因在靶细胞染色体上的整合及在转录水平的表达。通过细胞形态学分析、MTT实验、细胞周期分析、软琼脂集落形成和裸鼠成瘤实验,观察PC-1基因表达对NIH3T3生物学特性的影响。结果建立了稳定转染PC-1基因的NIH3T3细胞株。PC-1基因表达的小鼠成纤维细胞NIH3T3生长速度加快,在软琼脂上生长并形成集落,接种裸鼠后可成瘤(6／6)。结论 PC-1基因在NIH3T3细胞中稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能。     

IDO修饰的成纤维细胞培养上清对小鼠T淋巴细胞增殖的影响

目的：检测吲哚胺2—3双加氧酶（IDO）基因修饰的细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。方法：将pEGFP-NI-mIDO真核表达载体转染至小鼠NIH 3T3成纤维细胞系。体外检测mIDO修饰的成纤维细胞培养液中色氨酸水平的变化；使用CFSE标记技术，检测mIDO修饰的成纤维细胞培养液对ConA刺激的小鼠T淋巴细胞增殖的影响。结果：将pEGFP-NI-mIDO转入NIH 3T3成纤维细胞，流式细胞术（FCM）检测到EGFP的表达；体外实验表明，成纤维细胞培养上清和转染pEGFP—NI的成纤维细胞培养上清可检测到一定量的色氨酸水平，而转染pEGFP-NI-mIDO的成纤维细胞培养上清未检测到色氨酸，提示pEGFP-NI-mIDO转染的成纤维细胞表达了具有活性的mIDO；使用CFSE标记技术，检测mIDO修饰的成纤维细胞培养上清对小鼠T淋巴细胞增殖的影响，发现ConA刺激的IDO组，72h后亲代细胞占各代细胞的百分率明显高于对照组。结论：IDO基因修饰的成纤维细胞可抑制T淋巴细胞的增殖。     

氧化石墨烯促进NIH3T3细胞在石墨烯/明胶纳米膜上的增殖与粘附的实验研究

本研究旨在探索氧化石墨烯/明胶(graphene oxide/gelatin)薄膜材料对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)活性、增殖与粘附能力的影响规律。利用扫描电镜观察材料表面微观结构。活-死细胞染色检测氧化石墨烯/明胶薄膜材料上的NIH3T3细胞活性,CCK-8法进行细胞增殖评价。利用免疫荧光、Westernblot检测Vimentin表达,采用实时定量RT-PCR检测粘附相关基因α-actin、ColⅠ、ColⅢ、Vinculin、Vimentin的mRNA表达。添加氧化石墨烯后材料表面形成明显的褶皱结构。与对照组相比,实验组的成纤维细胞活性良好,具有更强的增殖能力,且高表达α-actin、ColⅠ、ColⅢ、及Vinculin。氧化石墨烯/明胶薄膜材料促进NIH3T3细胞的增殖与粘附。     

长期900MHz射频电磁辐射对NIH/3T3细胞凋亡与周期的影响

目的探讨长期900 MHz电磁辐射对NIH/3T3细胞凋亡与周期的影响,以为进一步深入研究电磁辐射的细胞生物学效应提供一定理论依据。方法将NIH/3T3细胞分为对照组和辐射组,对照组NIH/3T3细胞为正常条件培养,电磁辐射组用SAR值为4.0 W/kg的900 MHz电磁辐射辐照,辐照时间为2 h/d。分别取正常培养和电磁辐射辐照的4 d、7 d、10 d和12 d的对照组和辐射组NIH/3T3细胞,用流式细胞法进行细胞凋亡和细胞周期检测和分析。结果长期900 MHz电磁辐射引起NIH/3T3细胞出现显著的早期和晚期凋亡。细胞辐照12 d时产生S期阻滞。结论在12 d的辐照周期里,900 MHz电磁辐射持续地诱导NIH/3T3细胞凋亡,在辐照超过10 d后开始对细胞周期产生一定影响。     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6小鼠与雄性M.spretus小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系。方法:从孕12.5～14.5d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达。结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长。染色体核型检测SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性。实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对SF1-G细胞保持正常未分化状态培养。     

草鱼鱼皮胶原蛋白与NIH3T3成纤维细胞的相容性

体外检测草鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白(FASC)的细胞相容性。采用MTT实验,检测不同浓度的FASC溶液或FASC涂层胶对NIH3T3成纤维细胞增殖能力的影响(n=6);利用transwell趋化实验,检测不同浓度的FASC溶液对成纤维细胞的趋化作用(n=3);利用transwell侵袭实验,检测不同浓度FASC涂层胶的细胞通透性(n=3)。结果表明,FASC溶液浓度依赖性地促进NIH3T3成纤维细胞增殖,16 μg/mL的FASC溶液在48和96 h的增殖率分别为63.7%±7.9%和87.3%±8.7%,较对照组有显著性差异(P<0.001)。NIH3T3细胞能够在FASC涂层胶上生长,各实验组与对照组相比,增殖率均无显著性差异(P > 0.05)。趋化实验显示,FASC溶液各浓度梯度组与阴性对照组的趋化指数均有显著性差异(P < 0.05),提示FASC对成纤维细胞具有趋化作用。侵袭实验结果显示,成纤维细胞可以通过FASC涂层胶。实验证实,FASC与NIH3T3细胞具有良好的相容性。     

5-aza-dC和TSA对NIH/3T3细胞多能性基因表达作用的实验研究

目的本实验通过联合应用甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichstatin A,TSA)对NIH/3T3胎鼠成纤维细胞进行DNA去甲基化重编程,以期使其表达与多向分化潜能性密切相关的基因。方法药物处理组与正常对照组NIH/3T3细胞的形态学观察。流式细胞技术检测药物处理前后NIH/3T3细胞的DNA甲基化水平。应用RT-PCR的方法检测多能性基因Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4的表达情况。结果经过药物处理后的NIH/3T3细胞与对照组的细胞比较,从细胞形态来观察,没有明显的区别,均呈现成纤维细胞的外观。药物处理组的DNA甲基化水平较对照组明显降低。药物处理后细胞均呈现出Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4基因的阳性表达。结论 5-aza-dC和TSA对NIH/3T3细胞进行表观重编程,可以使重编程后的体细胞中呈现与多向分化潜能基因的阳性表达。     

互隔交链孢酚通过PKA-CREB信号通路激活NIH3T3细胞中DNA聚合酶β表达

目的： 探讨互隔交链孢酚（AOH）诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中DNA聚合酶β（DNA polβ）表达增高的分子信号通路。方法: ①15 μmol/L AOH作用NIH3T3细胞16 h,利用Western blotting 方法检测细胞中DNA polβ的表达,并利用磷酸化CREB抗体检测AOH作用后NIH3T3细胞中CREB信号分子是否被激活。②利用PKA-CREB信号通路特异性抑制剂H89预处理NIH3T3细胞1 h,再加入AOH作用,分别检测磷酸化CREB和DNA polβ表达的变化。结果: ①与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中DNA polβ表达明显增高,而且磷酸化CREB蛋白含量也明显增加,差异均显著。②用PKA特异性抑制剂H89预处理,可部分抑制NIH3T3细胞中CREB蛋白的磷酸化,并且降低了AOH引起的NIH3T3细胞中DNA polβ的表达增加。结论: PKA-CREB信号通路在AOH诱导的 NIH3T3细胞中DNA polβ表达起重要作用。     

C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性及饲养层制备

背景：昆明小鼠胚胎成纤维细胞是目前最常用的饲养层细胞,C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层的研究鲜有报道。目的：体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞,制备饲养层,力求扩大小鼠胚胎成纤维细胞的来源。方法：用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性,研究其生长规律,并制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,检测干细胞在所制备饲养层上的生长状态。结果与结论：不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生长状态好,获得的成纤维细胞数量多,增殖活跃。在细胞冻存后1,2周、1,3,6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞在第2-5代增殖旺盛,第6代以后细胞增殖出现明显下降。种植到培养皿上的C57BL/6小鼠饲养层细胞在种植后3 d内活力高,种植4 d以后细胞活力急剧下降。所以C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞来源的饲养层的最佳使用时间为灭活后3 d内,C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层一样,能很好地支持胚胎干细胞及诱导多能干细胞生长。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础     

重组人aFGF的克隆、表达及活性测定

目的：为了研究酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)的临床应用价值,将其开发为多肽类药物。方法：以RT－PCR从人肺成纤维细胞钓取人aFGF全编码区cDNA,使用Pichia分泌型酵母表达系统表达重组人aFGF,重组蛋白经肝素亲和层析纯化后,以NIH3T3成纤维细胞增殖实验、鸡胚尿囊膜法血管生成实验及小鼠创伤愈合实验检测活性。结果：重组人aFGF蛋白在酵母系统中得到较高量表达（12mg/L,并能够促进NIH3T3增殖、促进血管增生、促进伤口愈合,而且这种活性能被受体（FG－FR）的细胞外段拮抗。结论：重组人aFGF在酵母系统中实现高效表达,并具有很好的生物学活性。     

不同代昆明小鼠胚胎成纤维细胞的生长特性研究

目的分离培养昆明小鼠成纤维细胞,研究其体外生长特性并用于胚胎干细胞培养。方法消化法分离培养获得昆明小鼠胚胎成纤维细胞,利用MTT法绘制各代细胞生长曲线,免疫荧光对各代细胞进行细胞骨架分析;用不同浓度丝裂霉素C(10μg/m L、20μg/m L和30μg/m L)分别处理MEFs 1、2、3 h,MTT法筛选饲养层制备的最佳条件,制备饲养层用于小鼠胚胎干细胞的培养。结果分离的小鼠胚胎成纤维细胞3～5代细胞增殖能力较好; 1～3代细胞微管微丝排列整齐,5代以后的细胞微管微丝排列紊乱; 10μg/m L丝裂霉素C处理2 h有利于小鼠胚胎干细胞的培养。结论体外分离培养的3～5代小鼠胚胎成纤维细胞可用于小鼠胚胎干细胞的培养。     

人CXCR1基因Tet-on可调控载体的构建及其在NIH3T3中的表达

目的构建CXCR1-pTREhyg可调控性真核表达载体,检测其在NIH3T3细胞内的表达情况。方法通过RT-PCR的方法从原代培养的类风湿性关节炎患者滑膜成纤维细胞中克隆得到CXCR1的全长基因,测序正确后将其亚克隆入pTREhyg载体中。用脂质体将pTet-on质粒和CXCR1-pTRE-hyg共转染入NIH3T3细胞,以不同浓度的强力霉素诱导,用Westernblot检测CXCR1蛋白表达水平。结果Westernblot显示,我们所构建的可调控性表达载体能在NIH3T3细胞内表达,不同浓度药物诱导的CXCR1表达水平明显不同;同时还观察到IL-8刺激后,NIH3T3细胞中Erk-1/2磷酸化水平升高。结论成功构建了CXCR1-pTREhyg真核表达载体,并可在NIH3T3细胞内表达。经IL-8刺激的转染NIH3T3细胞中Erk-1/2活性发生变化。为进一步观察CXCR1与类风湿性关节炎损伤之间的关系奠定了基础。     

人类癌基因

定义反转录病毒癌基因(v-onc);反转录病毒中能够使靶细胞发生恶性转化的基因。原癌基因,也叫细胞癌基因(c-onc):这是一种细胞基因,它不能转化已建系的鼠NIH/3T3成纤维细胞和/或其它适当的靶细胞,但通过反转录病毒的转导、突变或重排可以使之激活,变成反转录病毒癌基因或细胞转化基因。细胞转化基因:即激活的原癌基因,它是能够转化NIH/3T3成纤维细胞或其他适当靶细胞的肿瘤细胞基因。     

肿瘤坏死因子α干预小鼠成骨细胞cbfa1/runx2基因的表达

背景：肿瘤坏死因子α可降低牙周膜纤维细胞碱性磷酸酶的活性,抑制牙周膜纤维细胞向成骨细胞的功能转化。 目的：观察肿瘤坏死因子α对小鼠成骨细胞生长及cbfa1/runx2基因表达的影响。 方法：取生长良好的小鼠成骨细胞系MC3T3/E1细胞,分别以20,40,60,80 μg/L的肿瘤坏死因子α进行干预,以正常培养的细胞作为对照。采用RT-PCR法检测MC3T3/E1细胞cbfa1/runx2 mRNA的表达;PNPP法测定碱性磷酸酶活性;MTT法检测细胞活力。 结果与结论：正常培养的MC3T3/E1细胞cbfa1/runx2 mRNA呈阳性表达,随着肿瘤坏死因子α浓度的增高,其表达水平逐渐下降。同时MC3T3/E1细胞活力和碱性磷酸酶活性也随肿瘤坏死因子α浓度的增高而下降。提示肿瘤坏死因子α可抑制MC3T3/E1细胞生长,而cbfa1/runx2可能参与了成骨细胞的分化过程。     

重组人骨形态发生蛋白-7对NIH3T3细胞生物学行为的影响

目的:探讨重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)对NIH3T3增殖和骨向分化的影响。方法:向培养的成纤维细胞NIH3T3中加入不同浓度的rhBMP-7,观察NIH3T3增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量的变化。结果:rh-BMP-7在一定浓度范围内可以明显促进NIH3T3细胞增殖、提高ALP活性与OCN水平。结论:rhBMP-7可以刺激NIH3T3细胞增殖,诱导NIH3T3细胞向成骨细胞表型分化。     

肥大细胞对眼眶成纤维细胞生长的影响

目的:探讨肥大细胞对眼眶成纤维细胞生长的影响。方法:将分离纯化的小鼠骨髓源性肥大细胞(BMMC)与眼眶成纤维细胞(OFb)共育,共育分为两组:两种细胞接触共育组和非接触共育组,眼眶成纤维细胞单独培养为对照组;应用光镜、电镜及细胞生长计数等方法研究肥大细胞对眼眶成纤维细胞生长的影响。结果:与BMMC接触共育的OFb增殖活跃,呈复层生长,单位面积内细胞计数明显增加;接触共育组中OFb的增殖数分别与非接触共育组和对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);而非接触共育组的OFb增殖数和对照组比较,差异没有统计学意义(P>0.05);电镜见接触共育组OFb中粗面内质网(RER)增生扩张,BMMC与OFb紧密接触,部分BMMC有脱颗粒现象。结论:肥大细胞对眼眶成纤维细胞的生存和增殖有显著的促进作用,并使其功能活跃,这种作用主要是通过两种细胞间的紧密接触而实现的。     

互隔交链孢酚增加NIH3T3细胞中DNA聚合酶β表达

目的 研究互隔交链孢酚(AOH)对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中DNA聚合酶β(DNA PoLβ)表达的影响.方法 采用半定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western blot方法检测细胞中DNA POLβ mRNA和蛋白的表达.结果 与对照组相比,AOH可以引起NIH3T3细胞中DNA POLβ基因的mRNA水平和蛋白水平表达增高(并呈一定的剂量效应关系)(P0.05).结论 AOH可以引起NIH3T3细胞中DNA POLβ基因表达增高,可能有助于细胞应对AOH引起的DNA损伤.     

小鼠NGE基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的：构建小鼠β-NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法：用基因重组技术，将小鼠β-NGF的成熟cDNA序列及其前导序列，克隆到真核表达载体pcDNA3．1 中，用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENET^TM6方法，转染NIH3T3细胞。转染后72h，用G418筛选阳性克隆并培养至20d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Western blot分析并观察该上清中NGF对PCI2细胞突起生长的作用。结果：β-NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论：重组真核表达载体PcDNA3．1 ／NGF构建成功，NGF蛋白在NIH3T3细胞中表达，并具有良好的生物学活性，为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础。