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超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导小鼠免疫细胞凋亡 总被引:1,自引:0,他引:1
为探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠免疫细胞调亡的影响,采用形态学观察及DNA断裂指标检测了SEB诱导小鼠免疫细胞凋亡的剂量和效应关系。结果表明,12.5μg,25g和25μg和50μgSEB均要引起部分胸腺细胞、脾细胞和肠系膜淋巴结细胞出现核固缩、核断裂及凋亡小体形成等形态学变化。上述免疫细胞NDA琼脂糖电泳可见典型的“梯状”带。而对照组免疫未见上述明显变化。本实验表明超抗原SEB可诱导小鼠 相似文献
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目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,制备金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的多克隆抗体,应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株,采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB,目的片段经TA克隆后DNA序列测定,重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接,将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E.coli BL21(DE3)株,在0.1mmol/LIPTG诱导下,诱导SEB基因在E-coli BL21(DE3)株中表达,用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白,用SDS—PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达,重组蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗血清,并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因,编码272个氨基酸,在E.coli BL21(DE3)株中表达了rSEB,分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体,此抗体不仅能够与rSEB反应,而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性,制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断,将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系,同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。 相似文献
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目的探索金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对实验性支气管哮喘小鼠肺组织Th0细胞分化的在体调节和对气道炎症的作用。方法32只15~17dBALB/c小鼠,随机分为4组:对照组、模型组、金黄色葡萄球菌组、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)组。用卵蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠慢性哮喘模型,在致敏前14d对幼年鼠做金黄色葡萄球菌或SEB预防性腹腔注射。观察记录小鼠的耗氧量、肺组织切片、支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞及相关细胞因子等的改变。结果金黄色葡萄球菌组与模型组相比,肺组织病理切片结构紊乱减轻、炎症细胞明显减少,小鼠耗氧量降低(5.24±0.12vs5.59±0.18),BALF中IL-4水平明显下降(44.94±4.51vs29.37±4.17),IFN-γ水平明显增加(19.61±3.83vs29.33±4.04),SEB组也有上述作用(耗氧量:5.09±0.20;细胞介素4:36.68±5.10;γ干扰素:24.27±3.46)。结论金黄色葡萄球菌能明显减轻实验性哮喘的气道炎症,纠正哮喘小鼠肺组织中Th1/Th2细胞因子的失衡,其作用可能是通过其分泌的SEB。 相似文献
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目的 应用PCR致突变基因克隆技术,获得抗原性保留,但超原毒性明显下降的葡萄球菌毒素B(SEB)突变体,用作新型淋巴细胞激活分子和超抗原疫苗的研究。方法 用PCR和PCR致变技术,从SEB标准株扩增SEB(SEB-N)和SEB突变基因(SEB-M),分别与原核表达质粒pTrc99A重组,转化大肠杆菌JM109,经筛选获得重组质粒pTrcNb和pTrcMb,用双脱氧链终止法作序列分析。表达的SEB-N和SEB-M蛋白,经双向免疫扩散试验作抗的性鉴定后,刺激小鼠脾细胞并由ELISA法检测培养上清中IL-2的水平。结果 SEB-N150位苏氨酸(密码子ACT)非定向突变为丙氨酸(密码GCT),SEB-M23位天冬酰胺(密码子AAT)定向突变为丝氨酸(密码子AGT)。两种突变基因表达的蛋白均与抗SEB形成明显沉淀线,与天然SEB刺激小鼠脾细胞产生IL-2水平相比,SEB-N格SEB-M突变体蛋白分别下降12.5倍和40倍。结论 获得了能表达SEB-N和SEB-M突变体蛋白的2株工程菌。表达的突变体蛋白具有良好的免疫反应性,但刺激小鼠脾细胞产生白细胞介素2的超抗原生物学活性明显下降。 相似文献
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金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达 总被引:3,自引:1,他引:2
目的 克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrap^TM chelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。 相似文献
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重组葡萄球菌B型肠毒素超抗原的制备及抗肿瘤活性分析 总被引:4,自引:1,他引:4
目的 采用基因工程技术制备葡萄球菌B型肠毒素(SEB),并对其体内外抗肿瘤活性进行分析。方法 对SEB在大肠杆菌中进行高效表达和分离纯化,并对其超抗原活性和免疫学活性与天然SEB进行比较研究,观察重组SEB对人肝癌细胞的体外抑制作用,以及对小鼠肝癌和肉瘤的体内抑瘤效果。结果 SEB获得高效表达,并一步将其纯化至均质,与天然毒素相比较,重组SEB的免疫学活与超抗原活性基本相似,首次证明,即使SEB的浓度为10ng/L,仍然对人肝癌细胞有显著地抑制作用,其对小鼠体内的肝癌和肉瘤有一定的抑制作用。结论 重组SEB在体内外均有一定肿瘤抑制作用。是潜在的肿瘤免疫治疗药物。 相似文献
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目的探讨催乳素(PRL)在T细胞的活化诱导凋亡(activation induced cell death,AICD)中的作用。方法用葡萄球菌肠毒素(SEA)体外刺激人外周血T细胞作为T细胞AICD的模型,在第2次向模型中加入SEA诱导T细胞凋亡的同时,分别加入3种不同浓度的hPRL(20、300和1000ng/ml)进行干预,同时设不含hPRL的对照组。0~24h内,以MTT法检测T细胞的增殖情况。PI染色后用流式技术检测细胞凋亡情况,并通过琼脂糖凝胶电泳检测T细胞凋亡DNA。流式检测T细胞的Fas和FasL的表达水平变化。Westem blot法检测T细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax。结果在T细胞的AICD模型中高浓度PRL组(300、1000ng/ml)其T细胞增殖得到显著维持(P〈0.05),各PRL处理组T细胞凋亡率比对照组降低了32.9%~78.2%(P〈0.05)。PRL组(300、1000ng/ml)Bax/Bcl-2比值比对照组下降了44.4%~46.0%(P〈0.05)。PRL可明显抑制细胞表面Fas和FasL的表达,其中各PRL处理组Fas的细胞阳性率比对照组下降了51.1%~75.0%(P〈0.01),FasL的细胞阳性率比对照组下降了28.2%~39.1%(P〈0.01)。结论在SEA诱导T细胞的AICD过程中,PRL可通过抑制Fas、FasL和Bax的表达,并提高Bcl-2的表达,来抑制T细胞凋亡,维持T细胞的增殖。 相似文献
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目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)对豚鼠支气管哮喘(简称哮喘)模型气道炎症及Th1/Th2细胞因子的影响。方法27只豚鼠随机分为对照组,模型组,SEB组各9只,用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。末次激发豚鼠24-48 h内处理,支气管肺泡灌洗,直接记数总白细胞和嗜酸性粒细胞,观察肺组织病理改变,分装冻存支气管肺泡灌洗液做细胞因子检测。结果SEB组豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量为(2.6±0.64)×106,显著低于模型组的(13.0±1.8)×106(P<0.01);肺组织哮喘炎症反应也轻于模型组;SEB组肺泡灌洗液中Th1细胞因子IFNγ-浓度(126.41±5.17)pg/mL,高于模型组(86.52±5.10)pg/mL(P<0.05);而Th2细胞因子IL-4浓度(50.02±2.79)pg/mL低于模型组(78.30±3.88)pg/mL(P<0.05)。结论SEB能减少哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量,可以通过调节Th1/Th2细胞因子的比值来减轻气道哮喘炎症反应。 相似文献
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目的 :制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB)突变体 ,观察其抗肿瘤活性变化。方法 :将诱导表达的SEB突变体重组蛋白包涵体进行变性复性和分离纯化 ,并对其肿瘤抑制活性与野生型SEB进行比较。观察突变体蛋白的抑瘤效果。结果 :建立了可行的包涵体复性条件和纯化方法 ,获得的突变体蛋白具有明显的抗肿瘤作用 ,其抑瘤活性比野生型SEB至少高 10倍。结论 :获得的突变体SEB K172E的抗肿瘤效果经体外实验证实优于野生型SEB ,有可能成为一种较具潜力的抗肿瘤药物 相似文献
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超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素基因B的原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建重组pET-30a-SEB原核表达载体,转化感受态大肠杆菌BL-21(DE3),诱导表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalenterotoxinB,SEB)。方法利用PCR技术从产SEB的金黄色葡萄球菌标准菌株CMCC-26075基因组DNA中克隆SEB全长序列,将其克隆到pGEM-TEasy载体中并进行测序。构建pET-30a-SEB原核表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,经镍离子螯合亲和层析纯化后免疫鉴定。结果PCR获得超抗原SEB基因片段,与克隆载体连接后经测序与文献报道的基本一致;成功构建了pET-30a-SEB原核表达质粒且成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约31×103的蛋白。结论成功克隆了seb基因序列,并进行了原核表达和鉴定,获得了SEB蛋白,为后续对超抗原SEB的进一步研究奠定了基础。 相似文献
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目的建立重组金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)蛋白的可溶性微针体外检测方法及体内免疫效果评价。方法通过动态光散射(DLS)检测蛋白粒径、BCA法检测单片微针的蛋白浓度、活体成像实验检测微针皮内注射后蛋白在体内的停留时间,通过DRIZE评分评价微针注射后的皮肤情况,通过动物实验评价重组SEB蛋白可溶性微针的免疫原性及免疫保护效果。结果DLS分析显示SEB蛋白可溶性微针负载的重组SEB蛋白粒径与重组SEB蛋白溶液中的SEB蛋白粒径无明显差别,单片微针中重组SEB蛋白含量为(13.2±1.4)μg,活体成像实验显示相对于肌肉注射,重组SEB蛋白可溶性微针皮内给药后荧光蛋白在体内的停留时间延长,动物实验显示13.0μg的重组SEB蛋白可溶性微针即能引发免疫反应,并且在2LD50SEB攻毒剂量下能够产生很好保护效果。结论重组SEB蛋白可溶性微针能够刺激小鼠机体产生较好的免疫原性及免疫保护效果,为发展疫苗新型免疫途径提供了新策略。 相似文献
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目的 构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定.方法 设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb) FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化.采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析.结果 成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸.PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功.转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白.经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90%以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性.结论 成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体. 相似文献
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目的:探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)在烫伤脓毒症大鼠早期肠损害中的作用。方法:雄性Wistar大鼠86只,随机分为正常对照组(n=10)、烫伤对照组(n=10)、烫伤后金葡菌感染组(n=50)和SEB单克隆抗体(单抗)拮抗组(n=16)。留取血样品测定SEB、内毒素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)水平;同时测定组织内毒素水平及小肠组织二胺氧化酶(DAO)活性。结果:烫伤后金葡菌感染动物血浆SEB、TNF-α和IFN-γ水平均显著高于正常对照组,并于2 h、6 h达峰值(P<0.05或P<0.01),此后降低;而小肠组织DAO活性则持续低于对照组(P<0.05)。相关分析显示,小肠组织DAO活性与血浆SEB水平呈显著负相关(r=-0.4398,P<0.05)。此外,金葡菌攻击后动物血浆及心、肝、肺、肾等组织中内毒素含量亦明显高于正常和烫伤对照组水平(P<0.05);SEB单抗干预可不同程度抑制血浆及组织内毒素水平的变化,其中伤后2 h肾脏改变显著(P<0.05)。结论:在严重烫伤后金葡菌感染时,金葡菌的重要致病因子-SEB可加重动物小肠粘膜屏障功能损害,促进肠源性内毒素移位并蓄积于局部组织,后者可能与金葡菌致病因子协同作用导致脓毒症的病理生理过程进一步恶化。 相似文献
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原核表达的葡萄球菌D型肠毒素超抗原的纯化及其促淋巴细胞增殖作用 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 纯化原核表达的葡萄球菌D型肠毒素 (StaphylococcalenterotoxinD ,SED) ,检测其促淋巴细胞增殖活性 ,为SED免疫识别研究奠定基础。方法 用Ni2 + NTA金属螯合亲和层析法纯化 6×His SED融合蛋白 ,SDS PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度 ,BCA法进行定量 ,以3H TdR掺入法检测纯化的SED对人和小鼠淋巴细胞的促增殖活性。结果 获得可满足后续功能实验纯度较高的蛋白质 ;SED对人淋巴细胞的促增殖作用呈质量浓度依赖关系 ,0 .1μg mL时 ,细胞增殖最明显 ;淋巴细胞的增殖与IL 2分泌水平呈正相关。结论 原核表达的SED具有促人和小鼠淋巴细胞增殖活性 相似文献
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抗B型葡萄球菌肠毒素(SEB)单克隆抗体的研制及其初步鉴定(简报) 总被引:2,自引:0,他引:2
葡萄球菌肠毒素是一组分子量为24,000—34,000的单肽链蛋白质。已知有SEA、SEB、SECs(包括SEC1,SEC2及SEC8),SED及SEE等血清型。都能引起食物中毒。并证实SEA和SEB还具有强烈的有丝分裂原效应。对机体可产生广泛地免疫调节作用。因此,建立抗SEB单抗的杂交癌细胞系具有重要的实际意义。 相似文献
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目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化。间接免疫荧光法检测融合蛋白的靶向结合活性,MTT法检测靶向杀伤效率。结果:成功构建了融合基因ND-1scFv/SEA,实现功能性表达,纯化的ND-1scFv/SEA融合蛋白与表达有ND-1相应抗原的大肠癌细胞CCL-187有高度亲和活性,通过激活外周血单核细胞,可特异性杀伤靶细胞,在4μg/mL浓度下对CCL-187的杀伤率达到91%,明显优于SEA的杀伤活性。结论:融合蛋白ND-1 scFv/SEA对大肠癌细胞CCL-187具有靶向结合和杀伤活性,为SEA用于靶向性的大肠癌治疗奠定了基础。 相似文献
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目的:探讨葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A, SEA)对甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate,IM)抑制T淋巴细胞活化的影响。方法:2 mg/L SEA 和50 nmol/L IM联合作用于Jurkat细胞24 h后,用实时荧光定量PCR技术检测CD3ε和ζ链mRNA表达水平变化;Western blotting技术检测CD3ε和ζ链蛋白水平变化。结果:单纯IM组CD3ε和ζ链mRNA及蛋白表达均表现下调;SEA与IM联合用药组可以逆转IM下调CD3ε和ζ链mRNA及蛋白表达水平作用。SEA拮抗IM抑制作用中,对CD3ε链mRNA表达上调的作用明显大于CD3ζ链。结论:SEA能拮抗IM对T细胞CD3ε和ζ链表达的抑制作用。 相似文献
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重组人促红细胞生成素对体外培养内皮细胞增殖的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对体外培养内皮细胞增殖的影响.方法:从脐静脉体外分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用形态学观察及Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)检测进行内皮细胞鉴定,免疫组织化学方法检测rhEPO对HUVEC增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达变化.结果:rhEPO实验组内皮细胞PCNA与Cyclin D1表达均明显高于对照组.当rhEPO剂量提高到20U/ml时其作用最强.结论:rhEPO对内皮细胞增殖有明显促进作用,这种促进作用町能是其影响血管生成的主要原因之一. 相似文献