Sox9基因转染对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 探讨Sox9基因转染对骨髓间充质干细胞(MSCs)成软骨分化的影响.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养法分离兔骨髓MSCs,体外培养扩增.阳离子脂质体介导重组真核表达Sox9质粒转染骨髓MSCs,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹实验(Westem blot)的方法检测基因产物的表达,荧光显微镜和流式细胞术测定细胞转染效率;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定基因转染对细胞增殖能力的影响,流式细胞术对转基因细胞进行细胞周期分析;通过Westem blot,RT-PCR和免疫组织化学染色的方法检测Sox9基因转染对MSCs成软骨分化的影响.结果 脂质体介导Sox9基因可以成功地转染兔骨髓MSCs;Sox9基因转染对细胞增殖能力无明显影响;基因转染后的细胞表达软骨分化特异性分子Ⅱ型胶原,Sox9,aggrecan等明显增加.结论 Sox9基因转染骨髓MSCs可以获得稳定表达,基因表达产物可以促进骨髓MSCs向软骨方向的分化.     

重组大鼠GATA4-pEGFP基因在骨髓间充质干细胞的表达及意义

目的 体外获得表达重组大鼠GATA4-pEGFP基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),为进一步研究后者在心肌梗死治疗中的作用奠定基础.方法 提取胎鼠心肌细胞总RNA,RT-PCR法扩增获得GATA4基因,将目的基因克隆到pEGFP-N3载体并获得重组后GATA4-pEGFP质粒,采用密度梯度离心法联合贴壁法分离骨髓单个核细胞并获得MSCs.将重组质粒GATA4-pEGFP以Lipo2000转染到大鼠MSCs,G418筛选2周,Western blot和荧光检测重组质粒在MSCs中的表达情况.结果 成功构建重组大鼠GATA4-pEGFP真核表达载体并转染入MSCs中,Western blot和荧光检测证实GATA4-pEGFP基因在MSCs中呈阳性表达.结论 成功建立表达大鼠GATA4-pEGFP基因的MSCs,此为利用组织工程学方法治疗心肌梗死的研究奠定了基础.     

脂质体介导转染的绿色荧光蛋白基因在骨髓基质细胞内的表达

目的研究脂质体转染法对骨髓基质细胞进行基因修饰的可行性。方法在体外分离和扩增大鼠骨髓基质细胞,用脂质体转染法介导绿色荧光蛋白基因进入到骨髓基质细胞内,荧光显微镜下检测荧光蛋白的表达,台盼兰排斥试验检测转染细胞的活力。结果绿色荧光蛋白可以在大鼠骨髓基质细胞内表达,转染效率为(28.9±3.6)%;脂质体法转染后的细胞活力为(93.6±4.8)%。结论脂质体转染法可以介导外源基因进入到骨髓基质细胞内表达。     

基因重组质粒pBudCE4.1_Cx43转染骨髓间充质干细胞及其表达和功能的测定

目的用重组质粒pBudCE4.1_Cx43转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)的mRNA和蛋白的表达及细胞间隙连接通讯功能的变化。方法用脂质体转染的方法将重组表达质粒pBudCE4.1_Cx43转染细胞;用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Cx43mRNA表达,免疫细胞化学法检测Cx43蛋白的表达,划痕染料示踪法检测细胞间通讯功能。结果转染Cx43基因后的细胞在形态学、生长能力等方面的特征与未转染的细胞比较没有明显变化;Cx43mRNA与蛋白的相对表达量和对照组相比差异显著(P<0.01);转染组细胞传递的荧光强度与对照组相比亦差异显著(P<0.01)。结论转染Cx43基因的BMSCs能表达有生物学活性的基因产物,改善细胞间通讯功能,能为细胞性心肌成形术提供较理想的基因工程细胞。     

OPN转染BMSCs对高转移潜能肝癌细胞的影响

目的观察经骨桥蛋白(osteopontin,OPN)转染人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对高转移潜能肝癌细胞(high metastatic potential hepatocellular carcinoma cells,MHCC97-H)增殖、侵袭能力的影响。方法构建OPN慢病毒载体,转染BMSCs。CCK-8法检测与BMSCs共培养前后MHCC97-H的增殖能力,共培养48 h,检测OD值。Transwell法检测BMSCs与MHCC97-H细胞共培养后细胞侵袭情况,共培养48 h,结晶紫染色,细胞计数。PCR法检测共培养前后MHCC97-H转移相关因子OPN、αV、β3、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)基因表达。结果 BMSCs基因转染成功,OPN高表达。MHCC97-H与BMSCs细胞共培养后,MHCC97-H增殖能力增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。经OPN转染的BMSCs细胞对MHCC97-H细胞增殖无明显作用(P0.05)。经OPN转染的BMSCs细胞对MHCC97-H细胞侵袭具有明显的促进作用(P0.05)。经OPN转染的MHCC97-H细胞OPN表达明显降低,而αv、β3、MMP-2表达明显升高(P0.01)。结论 BMSCs具有促进MHCC97-H细胞增殖的作用,OPN基因转染的BMSCs细胞具有促进MHCC97-H细胞侵袭的作用。外源性OPN抑制内源性OPN表达,外源性OPN通过激活MMP-2活性促进肿瘤侵袭。     

转染Noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

目的 构建Noggin基因的表达载体,分离骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转染Noggin基因的BMSCs在体外分化为神经元样细胞的情况.方法 应用RT-PCR技术扩增Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2+[Tα1]-Noggin,分离、培养大鼠BMSCs,借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs.观察诱导后细胞形态变化,利用免疫细胞化学方法 鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP).利用RT-PCR方法 检测神经细胞标记物mRNA的表达.结果 成功构建Noggin基因的真核表达载体并分离培养BMSCs.转染Noggin基因表达载体后, 分化的BMSCs形态似神经细胞;免疫化学检测到NSE、MAP-2特异性标志物表达,未检测到GFAP表达;RT-PCR测得神经细胞标记物GAP43、NCAM、SYN1表达.结论 从形态、蛋白、基因水平证实转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为具有部分功能的神经细胞.     

小鼠干细胞因子基因以脂质体介导转染骨髓基质细胞

目的　小鼠干细胞因子 (SCF)以脂质体介导转染骨髓基质细胞并表达。方法　采用 PCR技术从 p RC/CMV(含 SCF c DNA)中钓取SCF c DNA膜外段活性区 ,克隆入真核表达载体 pc DNA3,转染体外富集的骨髓基质细胞 ;用 RT- PCR方法检测 m RNA表达水平及通过协同刺激集落形成来检测转染细胞上清的生物学活性。结果　转染 SCF c DNA的骨髓基质细胞 SCF m RNA水平表达量高于对照组 ,其细胞培养上清协同 GM-CSF刺激骨髓细胞形成集落数比 GM- CSF单独作用高。结论　脂质体介导质粒载体转染培养富集的骨髓基质细胞并表达 ,且转染上清具有生物学活性。     

重组腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨以腺相关病毒(rAAV)为血管内皮细胞生长因子165基因(VEGIF165)载体,在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究其相关特性。方法 (1)全骨髓培养法提取培养MSCs,利用免疫组化法检测MSCs表面标志CD34、CD44;流式细胞分析法检测CD90。(2)rAAV-VEGF165转染MSCs,采用ELISA及PCR检测VEGF的表达,比较转染前后细胞的变化情况,观察VEGF165基因转染对MSCs的影响。结果 (1)成功培养出MSCs,CD44阳性表达,CD34阴性表达,CD90阳性表达。(2)在转染rAAV-VEGF165后转染组上清中VFGF165分泌水平明显高于未转染组(p<0.05),5 d时达到高峰,此后表达开始下降。琼脂糖凝胶电泳可见高亮度条带。表明rAAv-VEGF165成功转染进MSCs细胞中,绘制生长曲线,显示rAAV-VEGF165基因转染后对MSC生长无影响。结论rAAV-VEGF表达载体可有效感染MSCs,并在体外高效表达,为MSCs联合基因治疗提供了实验依据。     

腺相关病毒介导的仓鼠δ-SG基因在TO-2型仓鼠骨髓间充干细胞的表达

目的构建含有δ-SG基因的腺相关病毒载体并检测经腺相关病毒介导基因转染的TO-2型仓鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中目的基因的表达。方法用EcoRI酶和XhoI酶酶切含有δ-SG基因的pUC57-SG质粒,获得δ-SG基因。片段回收后定向插入腺相关病毒载体质粒pITR-GFP中重组成pITR-GFP-SG,并同pXX680、pHelper三质粒经钙磷沉淀法共转染HEK293细胞,斑点杂交法测定重组病毒颗粒滴度,再将重组病毒颗粒转染TO-2型仓鼠的MSCs,利用RT-PCR法,免疫荧光检测目的基因的表达,MTT检测转染细胞增殖能力。结果成功构建了δ-SG基因的腺相关病毒载体。含δ-SG基因的腺相关病毒感染TO-2型仓鼠MSCs48h后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现884bp-DNA片段;免疫荧光检测显示TO-2型仓鼠MSCs中呈现绿色颗粒,大小深浅不一;MTT证实转染后细胞的增殖能力未受明显影响。结论采用腺相关病毒介导的方法,可以将δ-SG基因导入TO-2型仓鼠的MSCs并成功表达。     

转染Noggin基因的骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞的初步研究

目的构建Noggin基因的表达载体,初步探讨转染Noggin基因的骨髓基质细胞(BMSCs)在体外分化为神经细胞的情况。方法应用RT-PCR技术,从正常人胎脑组织中扩增出Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2 Tα1-Noggin。用Percoll分离液分离出大鼠BMSCs,借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs。观察细胞形态的改变,并利用免疫组化鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果成功构建Noggin基因的真核表达载体pCS2 Tα1-Noggin。Percoll分离液分离出BMSCs,转染Noggin基因表达载体后,形似神经细胞;免疫组化检测到NSE、MAP-2表达,未检测到GFAP表达。结论转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为神经元样细胞。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ/P4启动子调控胸苷激酶载体的构建

目的 探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ/(IGF-Ⅱ)P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应.方法用分子生物学方法构建IGF-Ⅱ P4启动子和巨细胞病毒启动子(CMV)调控下HSV-tk 与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并用脂质体转染法将其转入肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中,在荧光显微镜下观察荧光表达情况.加入GCV使总浓度分别为0、1.0、10.0和100.0μg/ml,用四甲基偶氮唑盐实验检测HSV-tk/GCV系统对各种细胞的杀伤作用,用RT-PCR法检测转染前后胸苷激酶(tk)和EGFP mRNA的表达情况.用方差分析进行统计学处理.结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;pDC316-tkEGFP-CMV和pDC316-tkEGFP-P4转染的HepG2细胞均出现明显的细胞生长抑制现象,两者转染细胞的抑制率分别为6.95%±0.67%、24.99%±1.53%、49.68%±1.68%和71.85%±3.28%,4.83%±0.35%、17.34%±1.15%、30.17%±1.30%和40.39%±0.82%,转染后者对HepG2细胞的抑制率低(F=24.055,P<0.05),pDC316-tkEGFP-CMV转染的HeLa细胞也出现明显的细胞生长抑制现象,其抑制率分别是6.36%±0.83%、23.95%±1.72%、45.13%±1.64%和69.38%±3.17%.转染质粒pDC3 16-tkEGFP-P4的HeLa细胞未发现明显的细胞抑制现象.结论成功构建IGF-ⅡP4启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础.

Abstract：

Objective To investigate the selective killing effect of herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir(HSV-tk/GCV)suicide gene system controlled by human IGF-II P4 promoter on HCC cells in vitro.Methods Recombinant shuttle plasmid vectors driven by IGFⅡ P4 promoter and driven by CMV promoter were constructed by techniques of gene recombination.The recombinant shuttle plasmids were then transfected into HepG2 and HeLa cells by techniques of lipidosome transfection.EGFP expression was detected by fluoroscopy.Tk and EGFP mRNA expression were detected by RT-PCR.The selective killing effect after GCV application was determined with MTT method.Statistical analysis was performed with ANOVA analysis.Results Identification of pDC3 16-tkEGFP-P4 by enzyme digestion and sequencing analysis showed that the construction of the recombinant shuttle plasmid was correct.It was found that green fluorescence protein could only be seen in HepG2 cells.not in HeLa cells.The results of RT-PCR showed only two bands could be seen in the samples of pDC316-tkEGFP-P4 transfected HepG2 cells.The growth of HepG2 cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV and pDC316-tkEGFP-P4 were inhibited remarkably,the growth inhibition rates were 6.95% ± 0.67%,24.99% ± 1.53%,49.68% ±1.68%,71.85% ± 3.28% and 4.83% ± 0.35% vs 17.34% ± 1.15%,30.17% ± 1.30%,40.39% ± 0.82%(F = 24.055,P < 0.05),respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV were also inhibed,the growth inhibition rates were 6.36% ± 0.83%,23.95% ± 1.72%,45.13% ± 1.64%and 69.38 % ± 3.17%,respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-P4 was not inhibed. The growth inhibition rates were 0.91 ± 0.04,1.18 ± 1.32,1.19 ± 0.10 and 1.32 ± 0.05(F = 26.469,P < 0.01),respectively. Conclusion The shuttle plasmid vector carrying the tkEGFP fusion protein gene driven by IGF-Ⅱ P4 promoter has been constructed successfully and its specific expression in HepG2 cells provided the basis for targeted gene therapy for HCC.     

携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

CEA启动子驱动下表达Hsp70基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子驱动下靶向表达热休克蛋白70 (Hsp70)基因的重组腺病毒。方法 通过RT-PCR和PCR的方法分别扩增人Hsp70基因和CEA启动子,构建穿梭质粒pDC316-pCEA-Hsp70。将所得的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70。通过梯度离心纯化病毒,采用半数细胞培养物感染量测定病毒滴度。分别以重组的腺病毒感染CEA阳性的人胰腺癌BxPC3细胞和CEA阴性的SW1990细胞,通过RT-PCR和ELISA法检测Hsp70 mRNA和蛋白的表达。结果 酶切和测序证实Hsp70基因和CEA启动子成功插入PDC316质粒。与骨架质粒共转染293细胞获得的病毒经PCR扩增证实重组腺病毒构建成功。最终获得的病毒颗粒数达2.2 ×1011 vp/ml,滴度为1.5×1010 PFU/ml。重组腺病毒感染CEA阳性表达的BxPC3细胞后,可显著增加Hsp70 mRNA和蛋白的表达,而感染CEA阴性的SW1990细胞,Hsp70 mRNA和蛋白的表达无变化。结论 成功构建了能够在CEA阳性细胞中靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70,为进一步研究奠定了基础。     

人Notch1受体胞内段重组腺病毒构建及转染

目的构建人Notch1受体胞内段重组腺病毒并转染人肝癌细胞株HepG2,为Notch信号对肝癌侵袭转移的影响研究奠定实验基础。方法构建Notch1受体胞内段(notch intracellular domain,NICD)基因的重组质粒pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc,采用AdMax腺病毒包装系统将重组质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc,RTPCR鉴定重组腺病毒EGFP及NICD基因表达。重组腺病毒转染人肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜观察EGFP及NICD蛋白的表达。结果重组腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc经鉴定基因表达正确,此病毒转染人肝癌细胞株HepG2后阳性表达EGFP及NICD蛋白。结论人Notch1受体胞内段重组腺病毒成功构建,为进一步Notch信号对肝癌侵袭转移的影响研究奠定了实验基础。     

VEGF真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建血管内皮生长因子（vascu lar endothelial growth factor,VEGF）真核表达载体,并研究其在骨髓间充质干细胞（m esenchym al stem cells,MSCs）中的表达情况。方法运用DNA重组技术,构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,将载体转染大鼠MSCs,RT-PCR,ELISA及免疫细胞化学等方法检测VEGF在大鼠MSCs中的表达情况,MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF的生物活性。结果成功构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,其转染后的大鼠MSCs中VEGF表达水平明显增高,转染后细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论VEGF真核表达载体转染大鼠MSCs后能有效增加VEGF表达,并表现出较强的促内皮细胞增殖作用。     

小鼠活体内hMSCs干细胞生物发光示踪监测

目的:利用慢病毒载体转染和生物发光技术实时监测小鼠活体内人骨髓间充质干细胞(hMSCs)。方法:构建萤火虫荧光素酶(LUC)慢病毒载体,转染hMSCs后注射到小鼠皮下,(IVIS)生物发光成像系统连续检测体外hMSCs和小鼠注射部位的发光强度。结果:1.慢病毒载体对hMSCs的转染率为(29.6±1.5)%,转染后20代的hMSCs仍稳定表达LUC;2.慢病毒载体对hMSCs的生长和增值没有影响;3.小鼠活体内生物发光强度与注射细胞数量成正比(R2=0.9826);4.小鼠活体内生物发光时间持续6d。结论:可利用慢病毒载体转染LUC对小鼠活体内移植的hMSCs进行生物发光示踪监测。