PCR指印技术对新疆结核病病原Bacter460液体培养标本进行 …

以结核分枝杆菌特异插入序列ＩＳ６１１０两端序列为模板,设计一对外向ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增,从而建立一种结核分枝杆菌的快速分子生物学分型技术,该试验的基础是利用ＩＳ６１１０在结核分支杆菌染色体ＤＮＡ中反复重复且ＩＳ６１１０序列之间相距较近,经ＰＣＲ扩增呈现多条带型构成ＤＮＡ指印。在对新疆结核病人的３１份液体培养标本的ＰＣＲ检测呈现６种指印。该ＰＣＲ分型技术对结核分枝杆菌的分型所需时间短,不需细菌再     

利用PCR技术检测537份新疆结核病人痰标本中的结核分枝杆菌

目的 提高聚合酶链反应在检测人结核分枝杆菌中的特异性和敏感性。方法 在聚合酶链反应中对4种DNA片段即结核杆菌特异插入列IS6110,IS1081,和16SrRNA,65kDa摸板进行了比较;为获取较多的细菌DNA,临床痰标本处理采用了国际标准化方法主要包括用一定量的N－乙酰－L半胱胺酸和氢氧化钠处理痰标本;改进了RCR混和液的成份即添加了甘油,dUTP－尿嘧啶糖基化酶。结果 选择IS6110作为结核杆菌特异性摸板用于检测细菌DNA,制备出了6批人结核杆菌PCR检测试剂盒,在对来自新疆结核病研究所的537份痰标本的检测中发现,谝试剂盒检测的特异性为65.97%,敏感性为93.53%。结论 改良TB－PCR试剂盒显示有较高的敏感性,特异性还有待于进一步完善,该试剂盒在临床诊断中有一定的价值。     

评估一种新的检测瘰疬分枝杆菌菌株的real-time PCR方法

目的 建立针对非结核分枝杆菌中瘰疬分枝杆菌菌株的real-time PCR检测方法。方法 在我们的研究中,根据瘰疬分枝杆菌的SodA基因设计MGB探针和特定的引物,并用来检测模拟样品中的瘰疬分枝杆菌。结果 该方法 最低瘰疬分枝杆菌DNA检测浓度是10¹拷贝数,标准曲线显示阈值周期和SodA基因片段拷贝数之间的相关系数是0.973,斜率为-3.249,表现出良好的线性关系。此外, 模拟样品最低检测浓度是每毫升10¹个细菌,此外,其他9株菌为阴性结果 ,验证了良好的特异性。结论 该方法对于检测瘰疬分枝杆菌模拟标本显示很高的敏感性和特异性,可用于瘰疬分枝杆菌菌株的生态和流行病学监测。     

骨关节结核各类标本进行结核分枝杆菌培养与PCR检测的阳性率结果分析

目的 比较骨关节结核病灶中脓液、干酪、肉芽及死骨组织的结核分枝杆菌培养阳性率,及结核分枝杆菌BACTEC MGIT 960（简称“MGIT 960”）培养、改良罗氏培养基培养、PCR检测的联合阳性率.方法 2011年6月至2012年5月首都医科大学附属北京胸科医院收治的经病理明确诊断为骨关节结核的患者50例,通过手术获取病灶中的脓液（50份）、干酪（42份）、肉芽（48份）及死骨组织标本（43份）,分别进行结核分枝杆菌MGIT 960培养及改良罗氏培养基培养,比较4种组织标本的培养阳性率,计算2种培养方法的联合阳性率;对脓液标本单独通过PCR方法进行了阳性率检测;计算脓液标本3种方法的联合阳性率.结果 4种标本MGIT 960培养的阳性率依次为：死骨组织（41.9％,18/43）＞脓液（40.0％,20/50）＞肉芽（33.3％,16/48）=干酪（33.3 ％,14/42）;4种标本改良罗氏培养阳性率依次为：肉芽（20.8％,10/48）＞脓液（20.0％,10/50）＞死骨组织（16.3 ％,7/43）＞干酪（14.3％,6/42）;脓液的PCR检测阳性率为48.0％（24/50）.MGIT 960和改良罗氏培养2种结核分枝杆菌培养方法的联合阳性率为50.0％（25/50）,而PCR检测、MGIT960和改良罗氏培养3种方法的联合阳性率为68.0（34/50）.结论 骨关节结核患者,应尽可能选择多种标本以提高培养阳性率.MGIT 960培养可以作为首选的细菌学诊断方法,但如果再联合使用改良罗氏培养和PCR扩增技术,能够进一步提高检出阳性率.     

链置换扩增技术在结核病诊断中的应用

目的探讨链置换扩增（SDA）技术检测结核分枝杆菌复合群（MTBC）的临床意义和可信性。方法应用SDA技术与荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR），直接检测了453份结核性样本，其中痰标本332份、胸腔积液78份、脑脊液43份。结果332份痰标本培养阳性131份，其中110株（涂阳88份）为MTBC，21株（涂阳20份）为非结核分枝杆菌。在110份证实有MTBC、21份证实有非结核分枝杆菌生长的样本中，SDA和FQ-PCR的敏感性分别为99．1％和95．2％，特异性分别为94．6％和95．2％。在311例结核分枝杆菌感染的患者中，SDA和FQ-PCR的阳性率分别为55．3％（172／311）和47.0％（146／311）。121份结核性胸腔积液、脑脊液样本中，分枝杆菌阳性20例，经鉴定其中19例为结核分枝杆菌，1例为非结核分枝杆菌，SDA和FQ—PCR检测的阳性率分别为43．4％（52／120）和33．4％（40／120）。SDA技术设立的内扩增质量控制（IAC）可确保检测结果的准确性。结论自动检测分析系统能快速、特异地检测临床样本中MTBC，设立IAC可提高结果的可信性。     

以PCR为基础的结核分枝杆菌DNA分型技术及其应用

1998年结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组测序工作宣告完成，这就为建立分子生物学方法鉴定结核分枝杆菌并对其分型提供了更有力的依据。H37Rv整个基因组由4，411，529对碱基组成，含有约4，000个基因，整个基因组内有56个区与插入序列(ISs)同源。     

TB-SA基因检测在结核病诊断的临床应用研究

目的研究结核分枝杆菌特异性基因(Tuberculosis-Specific AntigenTB-SA)在结核病诊断中的应用价值。方法选择2004年4—9月期间在成都市结核病防治院的住院结核病患者371例。其中肺结核307例;肺外结核64例(结核性胸膜炎47例、结核性腹膜炎7例、结核性脑膜炎10例);非结核病的呼吸系统疾病患者61例(肺炎4例、肺癌9例,急性支气管炎7例、慢性支气管炎14例、哮喘10例,COPD12例、肺间质纤维化1例、支气管扩张3例、矽肺1例);同时选择无结核疾患健康志愿者40例,全部选例均知情同意。入选肺结核病例和健康选择痰液、肺外结核病例选择胸腔积液、腹腔积液、脑脊液等标本进行抗酸杆菌浓缩集菌,结核杆菌培养和TB-SA基因扩增(PCR)。结果307例肺结核患者中PCR检测TB-SA阳性259例,敏感性为84.4%(259/307);细菌学培养阳性193例,敏感性62.9%(193/307);痰浓缩集菌镜检阳性95例,敏感性30.9%(95/307)。64例肺外结核患者中,TB-SA阳性35例;敏感性54.7%(35/64);核杆菌培养阳性5例,敏感性7.8%(5/64)。61例非结核呼吸系...     

DNA固定技术对结核分枝杆菌PCR产物杂交结果影响的研究

目的 比较各种ＤＮＡ固定方法对结核分枝菌ＰＣＲ产物杂交结果的影响。方法 选取结核分杆枝菌ＰＣＲ扩增产物并点于尼龙膜上,用紫外线、加热和碱液三种方法固定ＤＮＡ,然后以ＰＣＲ产物作探针用增强化学发光标记试剂进行标记,并对三种不同方法固定的ＰＣＲ产物杂交分析。结果 结核分枝杆菌ＤＮＡ固定方法对ＰＣＲ扩增产物的检测结果较大的影响,碱液固定具有较好的敏感性和重复性。结论 各地结核分枝杆菌ＰＣＲ实验室可考虑用     

TB-SA基因检测在结核病诊断的临床应用研究

目的　研究结核分枝杆菌特异性基因(Tuberculosis-Specific AntigenTB-SA)在结核病诊断中的应用价值。方法 选择2004年4—9月期间在成都市结核病防治院的住院结核病患者371例。其中肺结核307例;肺外结核64例(结核性胸膜炎47例、结核性腹膜炎7例、结核性脑膜炎10例);非结核病的呼吸系统疾病患者61例(肺炎4例、肺癌9例,急性支气管炎7例、慢性支气管炎14例、哮喘10例,COPD12例、肺间质纤维化1例、支气管扩张3例、矽肺1例);同时选择无结核疾患健康志愿者40例,全部选例均知情同意。入选肺结核病例和健康选择痰液、肺外结核病例选择胸腔积液、腹腔积液、脑脊液等标本进行抗酸杆菌浓缩集菌,结核杆菌培养和TB-SA基因扩增(PCR)。结果 307例肺结核患者中PCR检测TB-SA阳性259例,敏感性为84.4%(259/307);细菌学培养阳性193例,敏感性62.9%(193/307);痰浓缩集菌镜检阳性95例,敏感性30.9%(95/307)。64例肺外结核患者中,TB-SA阳性35例;敏感性54.7%(35/64);核杆菌培养阳性5例,敏感性7.8%(5/64)。61例非结核呼吸系统病患者中,TB-SA阳性2例,特异性96.7%(59/61)痰涂片无阳性病例。40例健康志愿者,TB-SA及痰涂片均无阳性出现,特异性达100%(40/40)。结论 TB-SA基因检测的特异性及敏感性都取得了满意的效果。操作也较为简单。     

基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型的临床应用研究

目的 利用基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型方法(McSpoligotyping)对结核分枝杆菌分离株进行基因分型,以评价其在结核病流行病学调查中的应用价值。方法 对广西2017年结核耐药监测点收集的949株结核分枝杆菌,采用McSpoligotyping分型方法对其进行基因分型。首先,通过对其中的361株菌株的McSpoligotyping 分型结果与全基因组测序(WGS)结果的一致性比较来评价McSpoligotyping分型方法。其次,对949株菌株分型数据与SITVITWEB数据库进行比对,获取间隔区寡核苷酸国际型别(spoligotype intemational type,SIT)编号,将分型结果提交到https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces 网站进行聚类分析。结果 McSpoligotyping分型与WGS结果一致率为94.18%(340/361),在结果不一致标本中,出现不一致较多间隔序列在第5间隔。在949株菌株中新发现基因型为121株,已定义基因型为828株;其中已定义基因型共分为84种基因型,主要归属于5种基因家族(BEIJING、T、H、EAI、LAM)和3个家系(Lineage 1、Lineage 2、Lineage 4);5种基因家族主要流行为BEIJING和T基因家族,家系中主要流行为Lineage 2。949株菌株中的822株聚为49个簇(2~528株),最大一簇为Beijing家族SIT1基因型,其余的127株菌表现为独特的基因型。结论 利用PCR熔解曲线技术可快速对MTB进行基因分型,此技术较传统方法操作简便、耗时短,对结核病疫情处置及结核病分子流行病学研究具有重要意义。     

MOLECULAR TYPING OF Candida albicans ISOLATES FROM HOSPITALIZED PATIENTS

SUMMARY

Introduction: The majority of nosocomial fungal infections are caused by Candida spp. where C. albicans is the species most commonly identified. Molecular methods are important tools for assessing the origin of the yeasts isolated in hospitals. Methods: This is a study on the genetic profifiles of 39 nosocomial clinical isolates of C. albicans using two typing methods: random amplifified polymorphic DNA (RAPD) and microsatellite, two different primers for each technique were used. Results: RAPD provided 10 and 11 different profiles with values for S_AB of 0.84 ± 0.126 and 0.88 ± 0.08 for primers M2 and P4, respectively. Microsatellite using two markers, CDC3 and HIS3, allowed the observation of six and seven different alleles, respectively, with combined discriminatory power of 0.91. Conclusions: Although genetic variability is clear, it was possible to identify high similarity, suggesting a common origin for at least a part of isolates. It is important to emphasize that common origin was proven from yeasts isolated from colonization (urine, catheter or endotracheal secretions) and blood culture from the same patient, indicating that the candidemia must have started from a site of colonization. The combination of RAPD and microsatellite provides a quick and efficient analysis for investigation of similarity among nosocomial isolates of C. albicans.     

聚合酶链反应对脑脊液标本中结核杆菌DNA重复序列的检测

采用聚台酶链反应（ＰＣＲ）对３４例结核性脑膜炎（结脑）患者脑脊液（ＣＳＦ）进行检测，其中５份结核杆菌培养阳性的标本，ＰＣＲ检测均阳性；２９例ＣＳＦ结核杆菌培养阴性的标本，１９例ＰＣＲ检测阳性，总的阳性率为７０．５％。而作为对照的２０例非结脑患者的ＣＳＦ标本则无阳性。利用育法微量结核杆菌与对照菌测试，可以反证本方法的准确性，其符合率为１００％，提示本方法可以用于临床标本中结核杆菌ＤＮＡ的快速检测，不失为一快速，灵敏而又特异的诊断手段。关键词     

MOLECULAR TYPING OF Giardia duodenalis ISOLATES FROM NONHUMAN PRIMATES HOUSED IN A BRAZILIAN ZOO

Giardia infections in captive nonhuman primates (NHP) housed at aBrazilian zoo were investigated in order to address their zoonotic potential. Freshfecal samples were collected from the floors of 22 enclosures where 47 primates of 18different species were housed. The diagnosis of intestinal parasites afterconcentration by sedimentation and flotation methods revealed the following parasitesand their frequencies: Giardia (18%); Entamoebaspp. (18%); Endolimax nana (4.5%); Iodamoeba spp.(4.5%); Oxyurid (4.5%) and Strongylid (4.5%). Genomic DNA extracted from all sampleswas processed by PCR methods in order to amplify fragments of gdhand tpi genes of Giardia. Amplicons were obtainedfrom samples of Ateles belzebuth, Alouatta caraya,Alouatta fusca and Alouatta seniculus. Clearsequences were only obtained for the isolates from Ateles belzebuth(BA1), Alouatta fusca (BA2) and Alouatta caraya(BA3). According to the phenetic analyses of these sequences, all were classified asassemblage A. For the tpi gene, all three isolates were grouped intosub-assemblage AII (BA1, BA2 and BA3) whereas for the gdh gene, onlyBA3 was sub-assemblage AII, and the BA1 and BA2 were sub-assemblage AI. Consideringthe zoonotic potential of the assemblage A, and that the animals of the present studyshow no clinical signs of infection, the data obtained here stresses that regularcoproparasitological surveys are necessary to implement preventive measures andsafeguard the health of the captive animals, of their caretakers and of peoplevisiting the zoological gardens.     

应用分子生物学技术检测布鲁氏菌抗原的研究——Ⅱ PCR技术在动物布鲁氏菌病早期诊断中的应用

用PCR技术诊断动物布病,还未见报道。作者首次用牛种布氏菌104M株100万1只的菌量感染普通小鼠,分别在感染第5d、10d 采血,同时做血清学反应和PCR检测为阳性,同时,还检查了感染15d的豚鼠,其SAT和PCR结果均为阳性,PCR和SAT在感染的后期有很高的符合率。     

一种简单的检测甲型肝炎病人血清循环免疫复合物中HAV RNA的免疫捕获聚合酶链反应方法

目的 建立一种简单的检测甲型肝炎病人血清循环免疫复合物中HAV RNA的方法。方法 应用差速离心法分离甲肝病人血清中的循环免疫复合物,置于已用抗人μ链包被的离心管中吸咐,再用RT/PCR法扩增,用PAGE银染法检定扩增结果。结果 检测24份甲肝病人血清标本,其中19份为HAV RNA阳性,而检测正常人与乙型肝炎及丙型肝炎病人血清标本均为阴性。结论 该方法简便,敏感性及特异性较高,是检测甲型肝炎病人血清循环免疫复合物中HAV RNA的较好方法之一。     

荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用

目的 建立荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法,评估其在肺结核的临床诊断和疗效评估中的应用价值.方法 针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针,建立荧光定量PCR方法.分别以荧光定量PCR、集菌培养和染色镜检法检测疑似肺结核和确诊肺结核患者随访的痰标本,比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用.结果 荧光定量PCR的检测灵敏度为4 Copies/反应,远高于抗酸染色法和集菌培养法.荧光定量PCR法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为64.29％、35.12％和12.5％.患者治疗效果的随访检测结果显示,结核分枝杆菌的数量呈持续减少的趋势.结论 荧光定量PCR方法具有快速、敏感和特异性高的特点,可以快速、及时获取肺结核患者服药后的治疗效果,为医生的后续督导治疗提供依据,具有重要的临床意义.     

套式PCR检测不同地理株间日疟原虫及部分SSU rRNA基因序列鉴定

为了确定扩增的特定 Ｓ Ｓ Ｕｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因片段是否适用于不同地理株间日疟原虫的检测,在以往工作的基础上,用同一套式 Ｐ Ｃ Ｒ 体系对 ２２ 例四川和 ３０ 例云南患者及１ 例在印度感染疟疾的归国患者进行间日疟筛查,并从 Ｐ．ｖ 阳性的四川和云南血样中任取 １ 例,与 Ｐ．ｖ 阳性的印度血样分别扩增,用 Ｐ Ｃ Ｒ 产物测序,结果显示３ 者序列完全一致;与美国 Ｎ Ｃ Ｂ Ｉ的网上基因数据库比较,发现这３ 者又与萨尔瓦多等其他５ 个间日疟原虫不同地理株的小亚单位核糖体核糖核酸相应基因片段完全一致。该结果进一步证实了所扩增的片段确为目的片段,并提示该诊断体系可以适用于不同地区的间日疟原虫地理株的检测。