人骨肉瘤细胞系HOS肿瘤干细胞样细胞亚群的分离与鉴定

目的探索无血清培养基培养人骨肉瘤细胞系HOS细胞,筛选并鉴定人骨肉瘤细胞系HOS中肿瘤干细胞相关亚群。方法通过无血清悬浮培养初步富集骨肉瘤细HOS肿瘤干细胞,观察其形成肿瘤干细胞球过程中的细胞形态,并在有血清培养基中诱导其分化。各种浓度化疗药物顺铂(CDDP)和阿霉素(DXR)分别处理HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞,MTT法检测两种细胞对化疗药敏感性。Real-time PCR检测HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞干细胞相关基因ABCG2、Bmi1、Nanog、Oct3/4、Sox10、STAT3表达情况。将HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞分别接种于BALB/c裸鼠,观察成瘤情况。结果人骨肉瘤细胞系HOS细胞能够在无血清培养基中存活、增殖并形成肿瘤干细胞球。HOS悬浮细胞球对于化疗药物的敏感性较HOS贴壁细胞高。Real-time PCR结果显示HOS悬浮细胞球较HOS贴壁细胞高表达肿瘤干细胞相关基因ABCG2、Bmi1、Nanog、Oct3/4、Sox10、STAT3。HOS悬浮细胞球体内成瘤能力较HOS贴壁细胞强。结论无血清悬浮培养可以初步富集人骨肉瘤细胞系HOS悬浮细胞球,且这些细胞具有肿瘤干细胞特性。     

人骨肉瘤细胞株U2-OS中分离并鉴定肿瘤干细胞

目的:采用无血清培养法从人骨肉瘤细胞株U2-OS中分离肿瘤干细胞,检测肿瘤干细胞特异性标志物Stro-1的表达。方法:实验于2006-02/2007-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成。①实验材料:人骨肉瘤细胞株U2-OS由中国科学院细胞库提供;DMEM/F12(1∶1)培养基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);PCR引物由上海生物工程公司合成。②实验方法:取原代培养的骨肉瘤细胞经胰蛋白酶消化制备单细胞悬液,用含表皮生长因子20μg/L、碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、L-谷氨酰胺2mmol/L、胰岛素4U/L、青霉素100U/mL和链霉素100U/mL,pH7.2～7.5的无血清DMEM/F12培养基重悬细胞,常规培养5～7d,待培养基中悬浮的肉瘤细胞球体积较大后,用无血清培养基重新吹打成单细胞悬液,按1∶2或1∶3比例传代。③实验评估:从上述骨肉瘤细胞株中分离出的肿瘤细胞球,用MTT法检测其增殖能力,免疫磁珠分选Stro-1阳性细胞,反转录-聚合酶链法检测Stro-1阳性细胞中Stro-1 mRNA的表达,免疫细胞化学染色的方法检测分化后成骨细胞特异性抗原的表达。结果:①肿瘤干细胞增殖活性:增殖潜伏期约为24h,传代后1～2d即可见肿瘤干细胞形成,以后体积逐渐增大。第7天吸光度值最高,与0d吸光度值比较差异有显著性意义(P<0.01)。②免疫磁珠法分选Stro-1阳性细胞:分选的Stro-1 细胞接种于无血清培养基后,24～48h即可形成和原代肿瘤干细胞球形态一样的干细胞球,而Stro-1-细胞却不能形成肿瘤细胞球。③骨肉瘤干细胞中Stro-1mRNA的表达:Stro-1 细胞和Stro-1-细胞mRNA扩增产物的吸光度值二者比较差异有显著性意义(P<0.05)。④肿瘤干细胞分化:分化2周的肿瘤干细胞骨形态蛋白及Ⅰ型胶原酶均呈阳性表达。结论:骨肉瘤细胞株中存在骨肉瘤干细胞,并具有自我更新和多向分化的能力。     

无血清培养基体外分离培养人胶质瘤干细胞与鉴定

背景:最近有研究者采用神经干细胞的无血清培养基从脑肿瘤组织中培养出肿瘤干细胞.目的:探讨利用无血清培养基从原发胶质母细胞瘤组织中分离培养胶质瘤千细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08在山东省青岛市脑科研究所完成.材料:胶质瘤组织来自青岛大学医学院附属医院神经外科手术切除标本,DMEM/F12培养基、B27为GIBCO公司产品,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子Peprotech公司产品.方法:无菌条件下取肿瘤深部无坏死囊变、来电凝组织,剪切消化成单细胞悬液后,加入含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27添加剂的无血清DMEM/F12培养基,体外分离培养获得胶质瘤干细胞.待培养孔中细胞团数量增多、培养液刚刚变色时,吸取含有细胞团的培养液进行传代.取第3代胶质瘤十细胞,加入巢蛋白和CD133抗体行免疫荧光检测;加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导5 d,行胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色观察分化情况.主要观察指标:原代与传代培养的胶质瘤干细胞形态及生长情况,胶质瘤干细胞巢蛋白、CD133的表达及其分化.结果:原代培养7-10 d可形成大小不一的细胞团,球形或近似球形,呈悬浮或半悬浮状态牛长.细胞形态均,折光性好:传代24 h后次代细胞团形成,细胞的大小,形态与原代无明显差别,连续传代5次后细胞团增殖活跃.第3代胶质瘤干细胞呈巢蛋白和CD133阳性表达,加入胎牛血清后细胞球贴壁分化,呈胶质纤维酸性蛋白阳性.结论:人脑胶质瘤组织中存在胶质瘤下细胞,在体外无血清条件下可保持未分化的悬浮状态;加入血清后贴壁分化呈胶质瘤细胞样或神经元样,符合于细胞的自我繁殖和多向分化特征.     

自制血清替代物行无血清条件培养人表皮干细胞

目的：建立一种人表皮干细胞的无血清培养方法，并与目前表皮干细胞常用的有血清培养方法进行比较，探讨该条件是否更适合表皮干细胞的生长和有利于实施表皮干细胞的调控，提高实验的准确性。方法：实验于2002-05／2004-07在江西医学院第二附属医院医学分子中心完成。①从幼儿包皮中分离表皮细胞、用胶原Ⅳ分别黏附表皮细胞10～15min，收集黏附细胞，即为纯化的表皮干细胞。②分3组进行培养，3组培养条件均有无钙低糖Dulbecco改良的Eagle培养基，0．05mmol／LCaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松；有血清培养组还含有100g／L螯合钙的干细胞专用血清；无血清培养组1还含有100g／L无血清培养基血清替代物。无血清培养组2还含有100g／L无血清培养基血清替代物和50μg／L牛垂体提取物。③培养20d后。在倒置显微镜下对所培养细胞进行形态学观察；同时计数细胞数(大于100个细胞团为1个集落称克隆)，计数各组克隆数；采用胰酶消化传代，计数传代数及多次传代后所得细胞总数；流式细胞术分析α6，CD71(人表皮干细胞表面标记)的表达情况，计算人表皮干细胞α6bri CD71dim细胞百分率；采用流式细胞术进行细胞周期分析处于静止期／DNA合成前期人表皮干细胞百分率，采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白19及5／8(均表明人表皮干细胞生长情况，且以角蛋白19更能明确表明人表皮干细胞生成情况)和角蛋白10表达情况。结果：①人表皮干细胞细胞形态学观察结果：应用倒置显微镜下观察检测，无血清培养组1与有血清培养组人表皮干细胞细胞形态学基本相同，无血清培养组1集落形成时间稍晚于有血清培养组。②形成的克隆数及经胰酶消化可传代数、细胞总得数：胰酶消化传代后，形成的克隆数、细胞总得数及细胞传代数无血清培养组1与有血清培养组相近(P&;gt;0．05)，两组形成的克隆数、细胞总得数明显低于无血清培养组2(P&;lt;0．05)而细胞传代数组明显高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。③细胞周期分析及α6，CD71鉴定结果：采用流式细胞术检测，有血清培养组与无血清培养组1中人表皮生长干细胞α6^briCD71^dim细胞百分率及处于静止期／DNA合成前期细胞(即人表皮干细胞)百分率相近(P&;gt;0．05)，且均高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。④细胞角蛋白19和5／8及10表达情况：免疫细胞化学鉴定结果，有血清培养组与无血清培养组1角蛋白19和5／8及10阳性细胞百分率相近(P&;gt;0．05)，而两组角蛋白19阳性细胞百分率明显高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)，角蛋白5／8和10阳性细胞百分率明显低于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。结论：①利用自制的无血清培养基血清替代物．添加一些辅助因子(0．05mmol／L CaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松)能较好的培养表皮干细胞，传代次数多，培养时间长，形成克隆数较多，说明此类细胞具有较强的自我复制能力，结合所培养细胞中人表皮干细胞α6^briCD71^dim细胞及角蛋白19和5／8阳性细胞比例较高等特点，表明该无血清培养条件适合表皮干细胞的生长。②自制的无血清培养基血清替代物添加一些辅助因子(0．05mmol／LCaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松，50μg／L牛垂体提取物)的无血清培养组2能较快获得大量人表皮细胞，当组织工程需要大量细胞时可用此种培养扩增方法。     

自制血清替代物行无血清条件培养人表皮干细胞

目的:建立一种人表皮干细胞的无血清培养方法,并与目前表皮干细胞常用的有血清培养方法进行比较,探讨该条件是否更适合表皮干细胞的生长和有利于实施表皮干细胞的调控,提高实验的准确性。方法:实验于2002-05/2004-07在江西医学院第二附属医院医学分子中心完成。①从幼儿包皮中分离表皮细胞、用胶原Ⅳ分别黏附表皮细胞10～15min,收集黏附细胞,即为纯化的表皮干细胞。②分3组进行培养,3组培养条件均有无钙低糖Dulbecco改良的Eagle培养基,0.05mmol/LCaCl2,10μg/L表皮细胞生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松;有血清培养组还含有100g/L螯合钙的干细胞专用血清;无血清培养组1还含有100g/L无血清培养基血清替代物。无血清培养组2还含有100g/L无血清培养基血清替代物和50μg/L牛垂体提取物。③培养20d后,在倒置显微镜下对所培养细胞进行形态学观察;同时计数细胞数(大于100个细胞团为1个集落称克隆),计数各组克隆数;采用胰酶消化传代,计数传代数及多次传代后所得细胞总数;流式细胞术分析α6,CD71(人表皮干细胞表面标记)的表达情况,计算人表皮干细胞α6briCD71dim细胞百分率;采用流式细胞术进行细胞周期分析处于静止期/DNA合成前期人表皮干细胞百分率,采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白19及5/8(均表明人表皮干细胞生长情况,且以角蛋白19更能明确表明人表皮干细胞生成情况)和角蛋白10表达情况。结果:①人表皮干细胞细胞形态学观察结果:应用倒置显微镜下观察检测,无血清培养组1与有血清培养组人表皮干细胞细胞形态学基本相同,无血清培养组1集落形成时间稍晚于有血清培养组。②形成的克隆数及经胰酶消化可传代数、细胞总得数:胰酶消化传代后,形成的克隆数、细胞总得数及细胞传代数无血清培养组1与有血清培养组相近(P>0.05),两组形成的克隆数、细胞总得数明显低于无血清培养组2(P<0.05)而细胞传代数组明显高于无血清培养组2(P<0.05)。③细胞周期分析及α6,CD71鉴定结果:采用流式细胞术检测,有血清培养组与无血清培养组1中人表皮生长干细胞α6briCD71dim细胞百分率及处于静止期/DNA合成前期细胞(即人表皮干细胞)百分率相近(P>0.05),且均高于无血清培养组2(P<0.05)。④细胞角蛋白19和5/8及10表达情况:免疫细胞化学鉴定结果,有血清培养组与无血清培养组1角蛋白19和5/8及10阳性细胞百分率相近(P>0.05),而两组角蛋白19阳性细胞百分率明显高于无血清培养组2(P<0.05),角蛋白5/8和10阳性细胞百分率明显低于无血清培养组2(P<0.05)。结论:①利用自制的无血清培养基血清替代物,添加一些辅助因子(0.05mmol/LCaCl2,10μg/L表皮细胞生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松)能较好的培养表皮干细胞,传代次数多,培养时间长,形成克隆数较多,说明此类细胞具有较强的自我复制能力,结合所培养细胞中人表皮干细胞α6briCD71dim细胞及角蛋白19和5/8阳性细胞比例较高等特点,表明该无血清培养条件适合表皮干细胞的生长。②自制的无血清培养基血清替代物添加一些辅助因子(0.05mmol/LCaCl2,10μg/L表皮细胞生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松,50μg/L牛垂体提取物)的无血清培养组2能较快获得大量人表皮细胞,当组织工程需要大量细胞时可用此种培养扩增方法。     

人胚胎干细胞在无血清mTeSR1培养基中维持培养和向内皮细胞的诱导分化

背景：传统的人胚胎干细胞培养扩增方法中应用含动物血清培养基,并依赖饲养层细胞培养,这种培养方法显著制约了干细胞的体外培养规模;另外异源动物血清成分介入,使病原污染及免疫排斥的概率显著增加。目的：明确应用无血清培养基mTeSR1对人胚胎干细胞进行长期体外培养的可行性,并建立诱导人胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的相关技术平台。方法：采用无血清培养基mTeSR1以非饲养层细胞依赖的方式体外培养、扩增人胚胎干细胞株H9。经过40余次体外传代后,于倒置显微镜下观察其生长形态,并利用免疫荧光染色方法评估其细胞表型。此外,应用条件培养基诱导H9细胞株向内皮细胞方向分化。利用免疫荧光染色技术,定量RT-PCR以及低密度脂蛋白摄取实验对该胚胎干细胞源内皮细胞的表型及功能进行评价、分析。结果与结论：mTeSR1培养基能够支持H9细胞株在体外以非饲养层依赖的方式进行长期扩增,同时维持其未分化的干细胞潜能。添加血管内皮细胞的条件培养基能够定向诱导H9细胞向内皮细胞方向分化。该胚胎干细胞源内皮细胞不但表达内皮细胞的标志基因（kdr,pecam）和标记蛋白CD31,而且还能够摄取低密度脂蛋白,形成类似微血管结构。提示实验中所提供的培养及诱导分化体系能够支持胚胎干细胞的增殖与分化行为。     

无血清培养联合化疗药物对人结肠癌干细胞作用的初步研究

目的研究化疗药物对无血清培养下的人结肠癌肿瘤干细胞球进行干预的情况。方法取新鲜的人结肠癌肿瘤组织,分离获得原代人结肠癌细胞,在无血清培养基(SFM)中形成肿瘤干细胞球。用氟尿嘧啶(5-Fu)、伊立替康(CPT-11)、奥沙利铂(L-OHP)和培美曲塞干预原代人结肠癌细胞后,将其置于SFM中培养1周,观察肿瘤干细胞球的形成,检测侧群细胞(SP)比例、结肠癌干细胞特异性标记物CD133的表达及正常肠道干细胞标记物Musash-i 1表达。结果与对照相比,经5-Fu、CPT-11、L-OHP及培美曲塞干预后的原代人结肠癌细胞,在SFM中的肿瘤干细胞球形成率得到提高,SP细胞比例增加,Mushash-i 1及CD133表达增强。结论化疗药物联合无血清培养可能成为富集人结肠癌干细胞的方法之一,为进一步研究人结肠癌干细胞奠定基础。     

人胚胎干细胞在无血清mTeSR(r)1培养基中维持培养和向内皮细胞的诱导分化

背景:传统的人胚胎干细胞培养扩增方法中应用含动物血清培养基,并依赖饲养层细胞培养,这种培养方法显著制约了干细胞的体外培养规模;另外异源动物血清成分介入,使病原污染及免疫排斥的概率显著增加.目的:明确应用无血清培养基mTeSR(r)1对人胚胎干细胞进行长期体外培养的可行性,并建立诱导人胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的相关技术平台.方法:采用无血清培养基mTeSR(r)1以非饲养层细胞依赖的方式体外培养、扩增人胚胎干细胞株H9.经过40余次体外传代后,于倒置显微镜下观察其生长形态,并利用免疫荧光染色方法评估其细胞表型.此外,应用条件培养基诱导H9细胞株向内皮细胞方向分化.利用免疫荧光染色技术,定量RT-PCR以及低密度脂蛋白摄取实验对该胚胎干细胞源内皮细胞的表型及功能进行评价、分析.结果与结论:mTeSR(r)1培养基能够支持H9细胞株在体外以非饲养层依赖的方式进行长期扩增,同时维持其未分化的干细胞潜能.添加血管内皮细胞的条件培养基能够定向诱导H9细胞向内皮细胞方向分化.该胚胎干细胞源内皮细胞不但表达内皮细胞的标志基因(kdr,pecam)和标记蛋白CD31,而且还能够摄取低密度脂蛋白,形成类似微血管结构.提示实验中所提供的培养及诱导分化体系能够支持胚胎干细胞的增殖与分化行为.     

人骨肉瘤细胞株MG-63中肿瘤干细胞的生物学特性

背景：骨肉瘤干细胞在骨肉瘤的发生、复发及对化疗药物的耐药性中发挥关键作用,而目前关于骨肉瘤干细胞体外分离培养及生物学特性研究的报道甚少。目的：从人骨肉瘤细胞株MG-63中分离出具有干细胞特征的高致瘤性细胞亚群,检测肿瘤干细胞特异性标志物CD105的表达。方法：无血清悬浮培养法从人骨肉瘤细胞株MG-63中分离出骨肉瘤细胞球,应用流式细胞术检测细胞球中CD73、CD90、CD105的表达,免疫荧光法检测骨肉瘤细胞株及骨肉瘤细胞球中CD105的阳性率,免疫磁珠法分选出CD105＋和CD105-的细胞,传代后分别接种于NOD/SCID小鼠评估其致瘤性。结果与结论：CD105在球体细胞中高表达,此类肿瘤细胞具有高侵袭性和高致瘤性,在NOD-SCID小鼠中仅需移植1000个细胞即可形成肿瘤,这些细胞具有自主生长特性,能够在无血清条件下长期培养,CD105＋骨肉瘤细胞显示了干细胞的生物学特性,CD105可能成为骨肉瘤干细胞的表面标志之一。     

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

背景:研究表明FGF2,TGFβ/activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道.目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系.设计,时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成.材料:12.5～13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司.方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5～7 d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1:3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2 mmol/L glutamine、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、ITS(×1)、10~6 U/L青霉素、100 mg/L 链霉素、4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12 μg/L转化生长因子β1组成.②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层.将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养.主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率.结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1;培养20 d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY).与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P＜0.05),集落分化率明显升高(P＜0.05).结论:实验初步建立了入胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新.     

体外无血清培养基条件下诱导人骨髓基质细胞为神经干细胞的特征

背景:体外诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化的方法主要是应用抗氧化剂如β-巯基乙醇、全反式维甲酸、丹参等,这些诱导方法分化的主要是神经元样细胞,这种细胞是否具有神经元的功能有待进一步观察。目的:观察体外无血清培养基条件下人骨髓基质细胞向神经细胞分化的特点。设计:观察实验。单位:潮州市中心医院。材料:实验于2004-04/2005-12在潮州市中心医院完成。成人骨髓来源于3例骨折患者的股骨和胫骨骨髓,获得患者及其家属的同意及潮州市中心医院伦理委员会批准。重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子为Sigma公司产品;鼠抗波形蛋白单克隆抗体、鼠抗S100单克隆抗体、鼠抗TrkC单克隆抗体、鼠抗髓鞘基础蛋白单克隆抗体、SP-9000试剂盒和即用型AEC为北京中山公司产品;鼠抗GFAP单克隆抗体、兔抗巢蛋白多克隆抗体、鼠抗神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和鼠抗神经微丝200单克隆抗体在武汉博士德公司购买;鼠抗βⅢ管蛋白单克隆抗体为Sigma公司产品。方法:在手术骨折内固定过程中获得成人骨髓,缓冲液冲洗后分离细胞,原代培养的细胞融合时传代培养,细胞种植在神经干细胞的N2培养基或B27培养基,同时加入20μg/L的碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子,放入含体积分数0.05CO2的培养箱中37℃常规培养,相差显微镜下观察骨髓基质细胞在无血清培养基中的形态变化,培养2d后采用免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的神经细胞相关标志物的表达。主要观察指标:骨髓基质细胞的形态变化及神经细胞相关标志物的表达。结果:①从成年人的骨髓中分离出骨髓基质细胞,在体外生长形态类似成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外扩增可超过10代。骨髓基质细胞在无血清神经干细胞的培养基中生长状态类似神经干细胞,可以形成典型的球状结构。②细胞球可表达神经干细胞的标志物波形蛋白和巢蛋白;细胞分化可以表达神经元的标志物神经微丝200、神经元特异性烯醇化酶、TrkC和βⅢ管蛋白;部分分化的细胞表达胶质纤维酸性蛋白和S100,说明细胞分化为星形胶质细胞。结论:骨髓基质细胞在神经干细胞的无血清的培养基中细胞的生长状态、表达的标志物和分化的细胞类型与神经干细胞类似。     

无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化

背景：体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的：建立大鼠神经干细胞的分离、培养、纯化方法,进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：利用无血清悬浮神经球方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,进行形态学观察,用免疫细胞化学方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物,流式细胞仪检测细胞标志物及其比例。结果与结论：无血清悬浮神经球培养下大鼠神经干细胞生长稳定,操作简单,可大量分离、纯化、扩增神经干细胞,所获细胞具有神经干细胞的一股生物学特性,流式细胞仪检测第3代神经干细胞巢蛋白达91．5％,并具有多向分化潜能,免疫化学染色及流式细胞仪示神经干细胞可分化形成神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞。     

无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

背景:传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制. 目的:拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞.方法:抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及鸶茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力.取传至4～6代的大鼠骨髓间充质千细胞.加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定. 结果与结论:P5骨髓间充质千细胞(91.5±3.1)%处于G1期.高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节.骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达.表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞:在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力.     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

Human mesenchymal stem cell culture: rapid and efficient isolation and expansion in a defined serum-free medium

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are typically obtained for research or therapeutic applications by isolating and subculturing adherent cells from bone marrow on tissue-culture substrates using growth media. The purity and properties of the resulting populations can be affected greatly by the conditions under which they are cultured. Fetal bovine serum (FBS), although ill-defined, has been widely used as a critical requirement for conventional hMSC culture. However, a defined serum-free medium would greatly facilitate the development of robust, clinically acceptable bioprocesses for reproducibly generating quality-assured cells. The present study provides evidence demonstrating that a defined serum-free medium (PPRF-msc6) shows several beneficial features over a conventional FBS-containing medium for the production of hMSCs. When compared to control FBS-based cultures, PPRF-msc6 medium supported the derivation of hMSCs from primary cultures of bone marrow cells in a more rapid and consistent manner. Furthermore, hMSCs cultured in PPRF-msc6 exhibited: (a) a greater colony-forming capacity in primary as well as passaged cultures; (b) negligible lag phase and explicit exponential growth; (c) lower population doubling times (21-26 h vs 35-38 h between passage levels 1 and 10); (d) a greater number of population doublings (62 ± 4 vs 43 ± 2; over a 2 month period); and (e) a higher degree of homogeneity in size. Our data demonstrate that PPRF-msc6 is an important development which opens the door for the rapid, efficient and reproducible production of hMSCs in clinical settings.