血府逐瘀汤含药血清体外诱导MSC形态学改变及表达cTnT的实验研究

目的：探讨复方血府逐瘀汤含药血清体外诱导MSC分化为心肌细胞的能力,作为细胞移植治疗冠心病、心肌梗死等缺血性心脏病的种子细胞,旨在提高细胞移植治疗冠心病的安全性.方法：分离培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞（MSC）,用血府逐瘀汤含药血清诱导后,倒置荧光相差显微镜观察细胞形态学的改变,免疫细胞荧光染色法检测cTnT的表达.结果：MSC经过血府逐瘀汤含药血清体外诱导后,MSC的细胞形态发生了变化,具有和5-氮胞苷类似的诱导作用,朝着心肌细胞形态学的方向发展,心肌肌钙蛋白T出现了阳性表达.结论：复方血府逐瘀汤含药血清体外可以诱导大鼠MSC分化为心肌样细胞.     

血府逐瘀汤含药血清体外诱导骨髓基质干细胞表达Desmin和α-actin的实验研究

目的 观察血府逐瘀汤含药血清能否诱导骨髓基质干细胞（MSCs）分化为心肌样细胞,以寻找安全有效诱导MSCs向心肌细胞分化的诱导剂。方法 采用血清药理学方法进行诱导,制备血府逐瘀汤大鼠含药血清,分离培养大鼠 MSCs,MTT法检测血清细胞毒性,选用生长良好的P3细胞进行实验,将实验细胞分为3组,即空白对照组、血府逐瘀汤大鼠含药血清诱导组、5－氮胞苷诱导组。免疫细胞化学染色法检测心肌结蛋白（Desmin）,α型心肌肌动蛋白（α-actin）的表达情况。结果 诱导前各组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;其弱阳性表达率各组比较差异无统计学意义（P>0.05）。诱导后空白对照组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;血府逐瘀汤含药血清组和5－氮胞苷体外培养诱导组,MSCs细胞Desmin和α-actin表达阳性,其阳性表达率与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 血府逐瘀汤含药血清具有体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的趋势,其作用可能参与了Desmin和α-actin的表达。     

丹参酮诱导间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

神经干细胞的发现和研究,改变了以往神经细胞不可再生的传统观念.目的:研究丹参酮在体外诱导间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的作用.方法:用Ficoll-Paque液将成人骨髓细胞进行密度梯度离心和贴壁筛选分离出MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达和进行细胞周期测定.采用含丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞,并探讨丹参酮不同浓度对MSC诱导分化为神经元样细胞的影响.以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:MSC原代可获得(6-8)×105、第5代可获得(2-3)×108个细胞.流式细胞仪检测结果CD29、CD44、CD166表达阳性,CD14、CD34、CD45、HLA-DR为阴性;扩增后的各代MSC表面抗原表达无显著差别;90%以上MSC都处在G0/G1期.丹参酮诱导后,MSC形态上转变为典型的神经元样细胞,免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性.结论:采用的细胞培养条件适于MSC的纯化和扩增,培养细胞为MSC;丹参酮可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参酮的浓度有关.     

中药麦冬对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞的诱导作用研究

目的研究为证明浙麦冬可能具有MSCs诱导作用,且其补心阴作用与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells,MSCs)转化率成正比。且阐明浙麦冬对MSCs的诱导作用和机制。方法(1)流式细胞仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标记分子CD73,CD90,CD45,CD34,观察药物对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞形态结构的影响。(2)免疫荧光法检测浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中CTnI和CX43蛋白表达情况。(3)qPCR法检测MSCs诱导分化心肌样细胞中NKx 2.5,GATA4和β-MHC mRNA表达情况。结果(1)与空白对照组比较,给药组的心肌样细胞中肌钙蛋白I(CTnI)和连接蛋白43(CX43)的表达量明显增加,而且呈现剂量依赖性和培养时间依赖性。(2)与空白对照组比较,给药组的心肌样细胞中NKx 2.5,GATA4和β-MHC mRNA相对表达量明显增加,而且呈现剂量依赖性和培养时间依赖性。(3)与空白对照组比较,给药组的MSCs中在1周左右存活的部分细胞体积逐渐增大,呈球状、棒状或长梭形;2周以后细胞间出现连接,排列方向渐趋一致。结论补心阴中药浙麦冬能诱导MSCs分化形成心肌样细胞,而且呈现剂量依赖性。     

丹参素定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 研究丹参素体外定向诱导骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分化为神经元样细胞。方法 利用Ficoll-Paque液将骨髓细胞进行密度梯度离心和贴壁筛选分离出MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达。采用含丹参素的无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞,并且探讨丹参素不同浓度及不同作用时间对MSC诱导分化为神经元样细胞的影响。以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、结果 MSC在体外传代扩增后,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD166表达阳性,CDl4、CD34、CD45、HLA-DR为阴性。丹参素诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出,呈典型的核周体形态,类似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论 丹参素可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参素浓度和作用时间有关。     

黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞定向分化的诱导作用研究

目的:研究黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的定向诱导作用.方法:在无菌条件下从成年大鼠胫骨骨髓分离出MSCs,以1:3的比例传代,取第3代的细胞,接种后随机将MSCs分为5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组及对照组,用相差显微镜观察各组细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.结果:培养后的细胞表面CD44表达阳性;黄芪注射液诱导组、5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组诱导后的细胞形态发生改变,细胞之间形成连接,排列方向趋于一致,免疫组化检测结果显示肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)表达均阳性,黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组表达相对更强,与其他组相比有显著差异.结论:黄芪注射液可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,采用黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化的方式相对其他的方法更具优势.     

复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞特异基因GATA-4的表达

目的:观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞特异基因的表达。方法:分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第4代MSCs,观察特异基因GATA-4的表达。结果:大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性,CD34、CD45、CD31阴性。经含药血清、5-Aza体外诱导大鼠MSCs,细胞上清液中调节心肌发生的专有基因GATA-4的浓度有明显改变。结论:复方丹参滴丸可能有调控心肌发生的专有基因GATA-4的作用,启动细胞向心肌样细胞方向分化。     

双龙方干预骨髓间充质干细胞分化过程的蛋白表达

目的:研究中药复方双龙方(人参,丹参)干预骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化过程的蛋白表达;方法:采用双龙方含药血清对中国小型猪MSCs定向诱导分化为心肌样细胞的过程进行人工干预。对分化前后细胞蛋白进行二维电泳分离,PDQuest软件分析蛋白点的表达情况;对差异蛋白进行质谱分析并加以鉴定。结果:成功鉴定16个蛋白,通过对成功鉴定的蛋白功能进行数据库检索,表明这些蛋白的差异表达可能与中药干预过程有关;结论:双龙方含药血清对MSCs体外定向分化过程有一定的辅助作用;同时表明蛋白质组学技术可以应用于细胞增殖、分化和凋亡等过程的机理分析。     

补肾填精法促进骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨补肾填精方右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs).用右归丸含药血清诱导BMSCs分化后,倒置显微镜观察细胞形态变化;用尼氏染色法观察神经细胞特征性结构;用免疫细胞化学染色法鉴定神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.结果:诱导6h后,骨髓基质干细胞胞体收缩,有突起伸出;诱导24 h后突起增多形成网络结构;尼氏染色法显示诱导后的细胞胞体中有尼氏体.免疫细胞化学染色示NSE及MAP-2阳性表达,GFAP无表达.结论:右归丸含药血清可以体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞.     

黄芪含药血清对衰老骨髓间充质干细胞CYP24A1，CYP27B1 mRNA和蛋白的影响

目的:通过探讨不同浓度黄芪含药血清对衰老骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中24-羟基化酶(CYP24A1),1α羟化酶(CYP27B1)mRNA及蛋白表达的影响,初步探讨其治疗原发性骨质疏松症作用机制。方法:将SD大鼠随机分为6组,正常组、模型组、黄芪含药血清低、中、高质量分数组(20%,40%,60%),维生素D组。细胞增殖毒性检测(CCK-8)法检测不同浓度黄芪含药血清对衰老BMSCs成骨分化细胞存活率的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同浓度黄芪含药血清对衰老BMSCs成骨分化细胞CYP24A1,CYP27B1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:CCK-8法显示,与正常组比较,模型组BMSCs成骨分化细胞经D-半乳糖诱导后细胞增殖存活率显著降低(P0.01);与模型组比较,黄芪含药血清中、高质量分数组及维生素D组均可在不同程度上提高衰老BMSCs成骨分化细胞增殖存活率(P0.01);Real-time PCR和Western blot结果显示,与正常组比较,模型组CYP27B1 mRNA和蛋白相对表达量显著降低,CYP24A1 mRNA和蛋白相对表达量显著升高(P0.01);与模型组比较,黄芪高质量分数组均可升高CYP27B1 mRNA和蛋白相对表达量(P0.01),降低CYP24A1 mRNA和蛋白相对表达量(P0.01),呈质量分数依赖性。结论:不同浓度黄芪含药血清可治疗骨质疏松症,其机制可能与调节衰老骨髓间充质干细胞成骨分化过程中CYP24A1,CYP27B1 mRNA及蛋白表达水平有关。     

黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠TGF-β_1表达的实验研究

目的研究黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠TGF-β1表达的影响,探讨其在糖尿病肾病大鼠肾脏的保护机制。方法采用高脂饲料喂养加STZ腹腔注射制作糖尿病肾病大鼠模型。分为正常对照组、模型对照组、中药治疗组(黄芪水蛭制剂)、雷公藤治疗组(雷公藤)、西药治疗组(洛汀新)、中西药治疗组(黄芪水蛭制剂加洛汀新),观察各组大鼠治疗后血糖变化,并于实验结束前进行留尿,测24 h尿蛋白定量。免疫组化方法测定大鼠TGF-β1的表达。结果经黄芪水蛭制剂治疗2个月后,各治疗组空腹血糖、24 h尿蛋白定量均明显低于模型对照组。模型对照组TGF-β1表达显著高于各治疗组。结论黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠的肾保护作用可能与其抑制TGF-β1表达有关。     

舒心通脉方对心肌重构小鼠T淋巴细胞亚群的影响

目的 观察舒心通脉方对心肌重构小鼠T淋巴细胞亚群的影响.方法 将51只Balb/c小鼠随机分为6组（正常组、正常加中药中剂量组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组）,采用腹主动脉结扎法建立心肌重构小鼠模型.予舒心通脉方灌胃干预30d,检测血清与心肌CD4＋和CD8＋含量.结果 模型组小鼠血清与心肌的CD4＋含量以及CD4＋/CD8＋值较正常组显著降低（P＜0.05）,中药中、高剂量组血清与心肌的CD4＋含量以及CD4＋/CD8＋值较模型组显著上升（P＜0.05）.结论 舒心通脉方可调节心肌重构小鼠的CD4＋/CD8＋失衡,可能有一定的改善心肌重构作用.     

黄芪、水蛭、大黄及其复方含药血清影响大鼠MC产生FN及Col-Ⅳ的研究

目的:研究黄芪、水蛭、大黄及其复方抑制大鼠系膜细胞(mesangial cells,MC)产生纤维连接蛋白(fibronec-tin,FN)及Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen,Col-Ⅳ)的强弱。方法:在大鼠MC体外培养的基础上,将脂多苷糖(lipopolysac-charide,LPS)刺激的MC增生模型分为9组:控制组、模型组、对照组、黄芪组、水蛭组、大黄组、雷公藤多苷组、复方组、复方+雷公藤多苷组。采用ELISA法检测黄芪、水蛭、大黄及其复方等含药血清对MC表达FN及Col-Ⅳ的影响。结果:各含药血清组均能明显降低经LPS刺激后的大鼠MC产生FN及Col-Ⅳ的量,以复方+雷公藤组作用最佳,水蛭组、大黄组抑制作用较强,优于黄芪组。结论:证实了化瘀、泄浊中药水蛭、大黄在抑制MC产生FN及Col-Ⅳ方面优于益气类中药黄芪,复方+雷公藤组作用效果最佳。     

当归补血汤对移植肌卫星细胞γ射线照射小鼠早期造血重建作用的影响

目的观察当归补血汤对移植骨骼肌卫星细胞的受体小鼠早期造血功能重建的影响。方法分离培养雄性同系小鼠的肌卫星细胞并鉴定。经8Gy137Cs-γ射线照射的雌性昆明种受体鼠随机分为6组:空白对照组、移植肌卫星细胞组、当归补血汤不同剂量(1,3,5,10倍灌胃7 d)干预的移植肌卫星细胞4组。观察移植后8周内受体鼠存活率、外周血血常规、脾脏指数、脾形态学的变化,并采用PCR方法鉴定其造血重建的来源。结果培养的肌卫星细胞呈desmin染色阳性;当归补血汤各剂量组受体鼠脾脏指数、脾结节数、白细胞数、血小板数、血红蛋白数、8周内存活数均高于空白对照组和移植肌卫星细胞组,特别是给药3组及4组(P<0.05);对移植的存活小鼠进行Y染色体PCR分析,证实重建雌性受体鼠造血功能的细胞来自雄性供体。结论经当归补血汤干预后,肌卫星细胞能使受体鼠早期造血功能得以重建。     

复方黄芪有效部位对冠脉结扎致缺血大鼠心肌细胞超微结构的影响

目的观察复方黄芪有效部位（HQSM）对冠脉结扎致缺血大鼠心肌细胞形态学及超微结构的影响。方法将SD大鼠随机分成5组：假手术组、模型对照组、黄芪生脉饮组、HQSM高、低剂量组。每天灌胃给药1次，连续30d。末次给药后2h，结扎左冠状动脉造成急性心肌缺血模型。描记心电图，连续观察6h。取心肌组织，于光镜下观察心肌组织的形态学、透射电镜下观察心肌细胞的超微结构。结果光镜下心肌组织形态学：HQSM能改善冠脉结扎致缺血心肌细胞的形态学变化，肌纤维排列较整齐，横纹较清晰。透射电镜下心肌细胞超微结构：HQSM能减轻冠脉结扎所致缺血心肌细胞的超微结构损害，心肌细胞明暗带清晰，肌丝排列基本有序，线粒体轻度肿大。结论HQSM对冠脉结扎所致心肌缺血大鼠的心肌细胞变化具有改善作用。     

SDS-PAGE分析树舌多糖GF对H22小鼠血清蛋白质组的影响

目的：观察移植性肿瘤H22对动物血清蛋白表达的影响,并探讨树舌多糖GF注射液（GASPGF）抑制肿瘤的血清蛋白质组学机制。方法：小鼠随机分为正常组、肿瘤组、GAPSGF组。通过SDS-PAGE技术对各组血清进行分离,利用PDQuest6．1软件对各组图谱进行对比分析,观察其改变。结果：分离得到正常组样品组分20个,肿瘤组24个,GAPSGF组22个。肿瘤组与正常组相比,多出8条带,缺失4条。GAPSGF组能使在肿瘤组多表达的3条带和缺失的2条带恢复正常组水平。结论：树舌多糖GF能通过影响移植性肿瘤动物的血清蛋白质组达到抗肿瘤作用。     

隐丹参酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：观察隐丹参酮体外定向诱导成人骨髓间质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞。方法：采用Ficoll-Paque液分离成人MSC，体外扩增，FACScan流式细胞仪检测表面抗原表达，采用含隐丹参酮的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF－M，NF－H）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白（Nestin)的表达。结果：成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10^6个细胞，15代可获得（2－3）×10^12个细胞，流式细胞仪检测显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入隐丹参酮诱导后，MSC胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF－M，NF－H、Nestin表达阳性，GFAP阴性。结论：隐丹参酮在体外可诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。