表面修饰对纳米晶胶原基骨细胞相容性的影响

目的:探索纤维蛋白(fibrin,FB)修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen,nHAC)支架材料上成骨诱导的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)黏附、增殖及分化的情况。方法:实验分为两组:实验组,纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FB-nHAC);对照组,单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC)。将SD大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导为成骨细胞,种植于支架材料上,体外复合培养。通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3,7,10,14 d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶表达量以及扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长状况,比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异。结果:大鼠MSCs经诱导培养14 d后,I型胶原免疫荧光染色为阳性;实验组支架材料的细胞黏附率显著高于对照组(P<0.05);且相同时间点实验组支架材料中的细胞数及碱性磷酸酶表达量也明显高于对照组(P<0.05);电镜观察发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组。结论:表面修饰纤维蛋白后的nHAC支架材料具有更好的细胞黏附、增殖及促成骨分化能力。     

Ⅰ型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的 观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体.方法 将人脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率.结果 脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖.结论 Ⅰ型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体.     

I 型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体。方法将人脂肪干细胞与I型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率。结果脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖。结论I型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体。     

骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞转染增强型绿色荧光蛋白基因后复合生物衍生骨的研究

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因转染本身是否可以改变细胞复合材料的生物学特性,从而影响材料生物相容性的正确评价?方法:将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因技术成功标记人源骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化的成骨样细胞,再与人源生物衍生骨复合培养;同时设立未转染EGFP基因的骨髓MSCs诱导分化的成骨样细胞直接与人源生物衍生骨复合培养作为对照,通过倒置显微镜?荧光显微镜?扫描电镜对比观察?结果:发现转染EGFP基因的MSCs诱导分化的成骨样细胞能够成功地复合于人源生物衍生骨上,且生长状态较好?与未转染组细胞复合材料的情况相比,转染组与其没有明显差异?结论:EGFP基因转染技术没有对MSCs诱导分化的成骨样细胞复合衍生骨的能力以及增殖生长活性造成明显损害,从而不会影响对于材料生物相容性的正确评价?     

选择性激光烧结法构建纳米羟基磷灰石与聚己内酯复合材料人工骨支架

目的 用选择性激光烧结 (Selective laser sintering, SLS) 技术构建纳米羟基磷灰石(Nano-hydroxyapatite, Nano-HA)/聚乙内酯(Poly-ε-caprolactone, PCL)人工骨支架并探索其力学特性、生物相容性和生物活性。 方法 配置不同成分比例（0 wt%、5 wt%、10 wt%、15 wt%）的Nano-HA/PCL混合材料粉末,采用选择性激光烧结技术制备出纯PCL（0 wt%）与Nano-HA/PCL（5 wt%、10 wt%、15 wt%）人工骨支架。测定孔隙率及抗压强度;将分离培养的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）接种至上述两种支架中,观察细胞黏附及增殖情况,并通过ALP表达测定、茜素红法钙结节染色比较其成骨分化情况。 结果 材料表征和力学测试结果表明各组支架均具有良好的力学强度;Nano-HA/PCL人工骨支架有更好的细胞粘附,且未见明显的细胞毒性;培养第1d两组组的ALP表达无明显差异（p＞0.05）,但随着培养时间的延长,实验组的ALP表达明显高于对照组（p＜0.05）,且Nano-HA比例越高,ALP的表达也越强（p＜0.05）;实验组茜素红染色的阳性强度明显强于对照组,且Nano-HA含量越高,其钙结节数量明显增多,染色的阳性强度也随之增加。 结论 本研究通过SLS技术所构建出的Nano-HA/PCL人工骨支架具有良好的生物力学强度、理想的相容性及骨诱导性,有望成为一种应用前景极其广阔的新型骨修复替代材料。     

BMP2基因转染犬牙髓成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究

目的 构建骨形成蛋白2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)绿色荧光融合蛋白pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,用其在体外转染犬牙髓细胞(dog dental pulp cells,DDPCs),利用构建的种子细胞BMP2-DDPCs与异种烧结骨(xenogeneic bone ceramice,XBC)复合,检测BMP2-DDPCs增殖活性,扫描电镜观察BMP2-DDPCs在异种烧结骨中的生长情况,评价异种烧结骨作为支架材料的可行性,为将人BMP2基因转染的牙髓成纤维细胞与异种烧结骨复合进行牙体修复的研究奠定基础.方法 构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,采用阳离子脂质体转染法将BMP2基因转染体外培养的犬牙髓细胞,将构建的种子细胞BMP2-DDPCs与异种烧结骨复合,MTT法检测BMP2-DDPCs增殖活性以及应用扫描电镜观察BMP2-DDPCs在异种烧结骨中的生长情况.结果 成功构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,并成功转染犬牙髓细胞.BMP2-DDPCs复合异种烧结骨组的细胞增殖活性与单层贴壁培养BMP2-DDPCs组的细胞增殖情况差异无统计学意义(P＞0.05).说明异种烧结骨上黏附的牙髓细胞增殖情况良好.扫描电镜观察异种烧结骨上BMP2-DDPCs黏附、生长的情况,可见支架材料的孔径为100～600μm,材料表面粗糙,利于细胞的黏附生长;孔隙中可见大量BMP2-DDPCs贴附于材料上,生长旺盛、伸展良好.结论 BMP2-DDPCs可在异种烧结骨表面及孔隙中生长、增殖,异种烧结骨可以作为牙组织工程的支架材料.     

人骨形成蛋白9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞异位成骨实验研究

目的 探讨人骨形成蛋白9(human bone morphogenetic 9, hBMP-9)基因治疗与骨组织工程技术相结合的可行性.方法 采用阳离子脂质体介导hBMP-9基因转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),荧光显微镜观察及流式细胞学检测,碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定及Von Kossa's钙结节染色;MSCs与聚乳酸-羟基乙酸(polylactide-co-glycolide, PLGA)支架共培养,荧光显微镜及扫描电镜观察MSCs在PLGA上的黏附、生长情况;将转染与未转染hBMP-9基因的MSCs分别与PLGA支架复合培养,构建组织工程化骨并回植兔肌肉内,组织植入4、8周后进行HE染色观察.结果 流式细胞仪测定质粒转染率为34.15%;转染组MSCs的ALP活性较未转染组明显增高(P<0.01),Von Kossa's钙结节染色比较转染细胞形成的钙结节明显大于未转染组;荧光显微镜及扫描电镜观察见MSCs在PLGA支架上的黏附、生长良好;异位回植术后4、8周组织HE染色见肌肉内有新生骨基质分泌,成骨面积定量分析转染组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 阳离子脂质体介导的质粒能稳定转染MSCs,BMP-9能刺激MSCs的ALP活性增强,诱导钙结节形成;BMP-9基因转染的MSCs作为一种新型的种子细胞,其与PLGA支架复合用于骨缺损的修复具有较强的可行性.     

联合应用纳米金和磷酸钙骨水泥支架促进牙髓干细胞的增殖和成骨分化

目的：磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement,CPC）支架以其良好的生物相容性和骨引导活性而广泛应用于组织工程骨缺损的修复中,但是其骨引导活性有限。因此考虑联合应用纳米金（gold nanoparticles,AuNPs）以促进牙髓干细胞的增殖和成骨分化。方法：以CPC支架作为基底接种牙髓干细胞,在培养基中添加5 μg/mL AuNPs进行干细胞培养,以常规培养基组为对照。用透射电镜检测AuNPs的形貌。以荧光显微镜检测细胞接种4 h后的黏附状态,以CCK?8检测细胞增殖情况,检测细胞碱性磷酸酶的活性,并进行茜素红染色以说明矿化物形成情况。结果：AuNPs为均匀的球形,直径20 nm左右。细胞接种后4 h,实验组和对照组的细胞黏附状态没有显著差异。CPC上AuNPs培养基中的细胞14 d时数量多于对照组（P < 0.05）;且AuNPs培养基中细胞的碱性磷酸酶活性显著增高（P < 0.05）,矿化物的形成也显著增多（P < 0.05）。结论：CPC支架联合AuNPs可显著促进牙髓干细胞的增殖和成骨分化。     

异种生物衍生骨与兔骨髓间充质干细胞的体外黏附实验研究

目的:探寻良好的骨组织工程支架材料。方法:以市售新鲜猪股骨制备一种生物骨衍生材料,将材料与兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合培养,扫描电镜下对复合培养过程进行动态观察。结果:异种生物衍生骨具有三维立体多孔结构,并有良好的生物相容性和材料细胞界面。结论:异种生物衍生骨是一种具有临床应用前景、适用于构建组织工程骨的支架材料。     

脱细胞骨软骨支架的细胞相容性测定及与软骨细胞体外的复合

目的测定脱细胞和脱钙处理的脱细胞骨软骨支架的细胞相容性及该支架与软骨细胞体外复合培养的生物学特性和黏附关系,以探讨脱细胞骨软骨支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法采用自制脱细胞骨软骨支架与软骨细胞体外复合培养,用细胞增殖度法测定脱细胞骨软骨支架的细胞相容性,并行电镜观察其相互黏附关系。结果脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验中,软骨细胞可贴附于材料上生长增殖,并分泌细胞外基质。结论细胞增殖实验显示脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验显示脱细胞骨软骨支架可与软骨细胞良好复合,适于软骨细胞贴附生长。     

BMSCs复合CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性研究

目的:研究CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性,为骨组织工程提供一种新型复合支架材料。方法:制备CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料联合培养,体外成骨诱导培养2周,扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法分析细胞增殖情况以评价其组织相容性。结果:扫描电镜示细胞在新型支架上吸附、生长良好。MTT示BMSCs在材料上和单纯诱导的细胞增殖能力基本相同。结论:CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料是一种具有良好生物相容性的支架材料,有望在骨组织工程中得到广泛应用。     

仿生矿化前后静电纺复合支架的性能对比

目的：用10倍模拟体液（10×SBF）仿生矿化丝素/壳聚糖（SF/CS）电纺支架制备骨仿生支架,并对比矿化前后支架的物理性能及诱导细胞成骨分化的能力。方法：通过扫描电镜（SEM）、傅里叶红外光谱（FT?IR）、吸水率和力学性能检测对比矿化前后支架成分及物理性能。通过活细胞染色和Cell Counting Kit?8（CCK?8）对比仿生矿化对于人骨髓间充质干细胞（HBMSC）在支架上黏附和增殖的影响。通过碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色（ARS）对比支架矿化前后对HBMSC成骨分化的诱导能力。结果：SEM、FT?IR、吸水率和力学性能证实了矿化的成功及支架物理性能的提高。活细胞染色和CCK8证明仿生矿化行为并未增加支架的细胞毒性,ALP和ARS证明矿化后支架更易诱导HBMSC的成骨分化。结论：经SBF仿生矿化后支架较原支架更符合骨组织工程的要求。     

新型生物玻璃支架细胞相容性的实验研究

目的探讨新型生物玻璃支架BG-20的细胞相容性,为组织工程支架材料的选择提供依据。方法将骨髓基质干细胞（BMSc）与BG-20体外复合培养,进行形态学观察、细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP）测定。结果BMSc能贴附在BG-20上,增殖、生长不受影响,且BG-20有一定的促细胞增殖的作用。ALP测定结果BG-20组与对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论BG-20具有良好的细胞相容性,能作为BMSc的载体用于组织工程骨的构建。     

儿童脂肪干细胞与多种尿道生物支架相容性的对比研究

目的:比较儿童脂肪干细胞与多种尿道生物支架的相容性。方法:将儿童脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质、小肠粘膜下层组织、脱细胞尿道海绵体基质分别体外复合培养,运用倒置相差显微镜观察干细胞在这3种支架上的生长、增殖情况,并且测定细胞活性与细胞黏附率。结果:脂肪干细胞能够在3种支架上生长良好,生物活性无统计学差异(P>0.05),膀胱脱细胞基质细胞黏附率高于脱细胞尿道海绵体基质(P<0.05)。结论:脂肪干细胞与3种生物支架均有较好的相容性,膀胱脱细胞基质或是最好的选择。     

转化生长因子β1基因修饰的间充质干细胞／仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β1（TGF－β1)基因转染对间充质干细胞（MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸（PLYS）的聚DL乳酸（PDLIA）仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF－β1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞－－间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88％,其中孔径为150－200μm的有效孔占80％。所有细胞增能很好地粘附于基质材料上,其中TGF－β1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用扮子组织工程学原理可使TGF－β1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞－－基质材料之间非的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价

目的 探讨丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架与兔骨髓间充质干细胞的体外细胞毒性.方法 采用丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的生物支架与兔骨髓间充质干细胞体外共培养,用材料的细胞毒性、细胞黏附率、细胞增殖活力指标以MTT法、倒置显微镜及电镜观察来评价.结果 细胞在支架材料上黏附、生长良好,分裂增殖活跃,细胞毒性检测CTG均为0级,实验组与时照组细胞黏附率比较无统计学差异（P＞0.05）,实验组与对照组细胞增殖活力随着时间增加,细胞在支架增殖速度增快.第1、3、5、7天实验组与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）.扫描电镜观察发现细胞培养7天后生长良好,分裂正常,与支架材料黏附紧密.结论 支架材料对细胞无毒性,具有很好的细胞相容性.     

胎兔成骨细胞与复合肝细胞生长因子/异种脱蛋白松质骨的体外培养

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养的胎兔成骨细胞在异种脱蛋白松质骨(DPB)支架上黏附行为及增殖和分化功能的影响.方法:成骨细胞从胎兔中分离,实验组为HGF/DPB与成骨细胞复合培养,对照组为DPB与成骨细胞常规培养.通过电镜观察成骨细胞在HGF/DPB表面生长与附着状态,同时检测细胞增殖状况和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性等,评价成骨细胞生长情况和细胞活性.结果:成骨细胞在复合肝细胞生长因子脱蛋白骨外表面及孔隙内表面均可贴附生长,增殖、分化良好.HGF/DPB对成骨细胞的ALP活性有明显的促进作用,并能促进成骨细胞的增殖.结论:HGF/DPB具有良好的生物相容性和骨诱导作用,可作为骨组织工程备选的复合支架材料.     

脱钙骨基质支架构建组织工程骨的实验研究

目的以同种异体骨脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)为支架材料,复合体外诱导培养的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),构建组织工程骨并通过裸鼠皮下异位成骨实验及裸鼠皮下致瘤性实验验证其成骨效果及安全性.方法贴壁法培养hMSCs,体外诱导培养扩增,以1.857×106/ml的密度与DBM复合构建组织工程骨,体外培养,并在扫描电镜下观察细胞与材料复合情况,进行组织学观察.同时进行了裸鼠皮下异位成骨实验.结果细胞与支架复合后3 d,细胞与DBM表面及孔隙可实现良好复合;复合后5 d,扫描电镜观察到细胞基质分泌旺盛,充满支架孔隙.裸鼠皮下成骨实验证明其成骨效果良好.结论以本实验中使用的细胞培养方法扩增、诱导分化的种子细胞生物安全性好,自制的DBM具有良好的生物相容性,可为种子细胞生长提供较好的三维空间,按照标准化工艺流程制备的组织工程骨安全、有效.     

RGD序列胶原缓释微球涂层生物活性多孔支架细胞相容性的研究

背景本课题组已经成功制备了硫酸钙与冻干骨复合多孔生物支架,设法提高其细胞相容性仍需继续探索。目的研究RGD缓释微球表面修饰的硫酸钙冻干骨新型生物支架的细胞相容性。方法首先利用煅烧和挂浆的方法制备RGD涂层生物活性多孔支架,通过倒置显微镜观察第三代成骨细胞在对照组(原支架)和实验组(表面修饰后的支架)复合培养的生长分布情况,然后利用扫描电镜观察新型涂层支架和复合培养后的表面情况。分别测定细胞与新型RGD复合直接培养后的细胞蛋白质和细胞黏附率来分析其增殖和分化的能力。结果经过复合培养和对照,新型RGD涂层生物支架组的细胞黏附率明显高于对照组,不同时期的细胞蛋白质也明显要高于对照组(P<0.05),并且新型RGD涂层生物支架的孔隙中有细胞长入的情况。结论 RGD序列缓释微球涂层表面修饰可以提高硫酸钙/冻干骨生物多孔支架的细胞相容性。     

鹿茸多肽纳米复合材料诱导兔骨髓间质细胞向成骨细胞的分化效应

目的：探讨鹿茸多肽纳米复合材料诱导兔骨髓间质细胞（MSCs）向成骨细胞分化的效应,阐明复合材料作用机制。方法：将含5 mg/g鹿茸多肽、20%纳米β-磷酸三钙（β-TCP）和明胶的复合材料（以下简称复合材料）与第3代MSCs共培养 48 h,用MTT法和流式细胞术检测复合材料对MSCs增殖及细胞周期的影响;AO/EB荧光染色观察MSCs凋亡形态的变化;将MSCs与复合材料共培养,扫描电镜下观察细胞黏附、生长情况;复合材料连续作用于MSCs 21 d,全自动生化分析仪检测细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色法观察复合材料对MSCs矿化结节形成的作用。结果：复合材料作用于MSCs 48 h,可明显促进MSCs增殖,相对增殖率为126.45%,此时的MSCs主要处于S期,占细胞总数45.84%（对照组为7.96%）,凋亡率为2.08%（对照组为13.68%）;MSCs在复合材料上黏附、生长良好,呈多角或梭形。复合材料连续作用MSCs 21 d,显著增加了矿化结节形成;随着作用时间的延长,细胞的ALP活性也逐渐增强,21  d 复合材料组与对照组比较明显升高（P<0.001）。结论：复合材料在体外可促进MSCs增殖,并可诱导MSCs向成骨细胞分化,具有良好的成骨效能。