缺氧及复氧对去整合蛋白和金属蛋白水解酶10和淀粉样β分泌酶mRNA水平的影响

目的研究缺氧及复氧损伤对去整合蛋白和金属蛋白水解酶10（ADAM10）和淀粉样β分泌酶（BACE1）mRNA的影响。方法研究分为缺氧12h组，缺氧24h组及各自对照组。缺氧组在缺氧条件下（95％N2，5％CO2）分别培养SH-SYSY细胞12h和24h后复氧，分别于0、12、24h利用逆转录一聚合酶链反应（BT-PCB）方法检测ADAM10、BACE1 mRNA水平；对照组在正常情况下培养，与缺氧组同一时间进行接种和处理。结果缺氧培养12h后复氧各时间点ADAM10 mRNA表达下调（分别较对照组下降19．8％、41．4％、64．6％；P=0．005、0．038、0．001），缺氧培养24h后复氧各时间点ADAM10 mRNA表达下调更明显（分别较对照组下降30．1％、75．9％、86．5％；P=0．009、0．005、0．043）；BACE1 mBNA在缺氧24h后复氧12h和24h表达上调（分别较对照组上调31．5％和35．1％；P=0．028、0．005）。结论缺氧及复氧可以降低ADAM10转录水平和增加BACE1转录水平。     

加兰他敏抗β淀粉样蛋白的神经保护机制研究

目的观察加兰他敏(Gal)对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后β淀粉样前体蛋白(APP)代谢通路的影响,探讨Gal的神经保护机制。方法采用5μMAβ_(1-40)作用于SH-SY5Y细胞制备体外细胞损伤模型,0.3μM加兰他敏对Aβ_(1-40)处理的细胞进行干预并与正常细胞进行对照研究。倒置显微镜下观察细胞形态,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活力,Western-blot技术定量检测各组APP,sAPPα,β-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(BACE1)表达水平。结果 Aβ_(1-40)孵育细胞24h之后,细胞损伤明显,存活率从95.78.±2.5%降到62.93±2.1%,与对照组相比差异显著(P0.01);Western-blot显示细胞内BACE1表达增加,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα降低;在Aβ_(1-40)孵育之前给予加兰他敏作用24h,细胞损伤程度减轻,细胞的存活率上升(85.26±5.3%)(P0.01),细胞内BACE1表达较Aβ组下降,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα升高。结论加兰他敏通过抑制Aβ_(1-40)诱导的APP的异常代谢发挥神经保护作用。     

洛伐他汀对淀粉样前体蛋白β位点裂解酶表达和活性的影响

目的研究洛伐他汀对淀粉样前体蛋白β位点裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE1)表达和活性的影响。方法予洛伐他汀对SH-SY5Y细胞系进行处理;通过噻唑蓝比色(MTT)法观察其对细胞活力的影响;采用酶法测定胆固醇含量,采用荧光光度法测定BACE1活性,采用WesternBlot方法检测BACE1蛋白的表达量。结果与对照组相比,5μmol/L洛伐他汀组作用24h后细胞胆固醇水平下降33.0%(胆固醇与总蛋白含量的比值:3.33vs.4.97;F=5.13,P=0.020),同时BACE1活性下降13.8%(343.14vs.398.22;F=3.773,P=0.035);5μmol/L洛伐他汀组作用48h后细胞胆固醇水平下降49.2%(胆固醇与总蛋白含量的比值:2.65vs.5.22;F=12.239,P=0.001),同时BACE1活性下降38.0%(274.75vs.443.14;F=13.610,P0.01);洛伐他汀组BACE1蛋白表达量与对照组相比无统计学差异(P0.05)。结论洛伐他汀不影响BACE1蛋白的表达,但可以抑制BACE1蛋白的活性,同时伴细胞胆固醇水平降低,这为阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD)的防治提供了新的思路。     

稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白细胞模型的建立与鉴定

目的 建立和鉴定稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(APP)的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型.方法 脂质体转染法将含人野生型APP751 cDNA的真核表达质粒pcDNA3/APP APP751WT转染至SH-SY5Y细胞,G418对转染后细胞进行筛选,获得稳定表达人野生型APP751细胞模型.Western blotting法、MTT比色法和放射免疫法检测细胞APP表达水平、细胞生长情况和细胞内外β-淀粉样蛋白(Aβ)表达水平.结果 转染组细胞APP表达水平明显高于未转染组和空载体组.未转染组和空载体组细胞滞留期为12 h,对数生长期为12 h-4 d;转染组细胞滞留期为24h,对数生长期为1～4d;培养12 h后,转染组细胞活力低于未转染组和空载体组(t=4.363,P=0.0012;t=4.040,P=0.003),培养1 d后,转染组细胞活力降低,且低于未转染组和空载体组(t=4.736,P=0.001;t=4.317,P=0.005),其余各时间点差异均无统计学意义(P>0.05).转染组细胞细胞外Ap表达水平高于未转染组和空载体组(t=7.690,P=0.000;t=7.448,P=0.000),而3组细胞细胞内A8表达水平则差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功建立稳定表达人野生型APP751的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制提供了良好的细胞模型.     

利用分化的SH-SY5Y细胞观察加兰他敏对ADAM10和ADAM17表达的影响

目的观察经胆碱酯酶抑制剂加兰他敏处理的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)中解整合素样金属蛋白酶(ADAM)10和ADAM17以及可溶性淀粉样前体蛋白α(sAPPα)表达,探讨加兰他敏干预淀粉样前体蛋白(APP)代谢途径的可能机制。方法 SH-SY5Y细胞经全反式维甲酸诱导分化后,分别在含0.3、0.9或10μmol/L加兰他敏的无血清培养基中培养18h。以Western blot方法检测细胞内APP、ADAM10、ADAM17和sAPPα水平。结果 10μmol/L加兰他敏组ADAM17蛋白相对分子质量(Mr)80 000条带表达量(2.0670±0.0903)高于对照组(1.0000±0.0864,P<0.01),亦高于0.3、0.9μmol/L加兰他敏组(分别为1.4422±0.0374、1.8592±0.1018,均P<0.05);ADAM17蛋白Mr 130 000条带表达量(1.5938±0.0476)高于对照组、0.3和0.9μmol/L加兰他敏组(分别为1.0000±0.0523、1.2533±0.0658、1.4724±0.0576,均P<0.05)。与对照组(1.0000±0.0603)比较,0.3、0.9和10μmol/L加兰他敏组sAPPα蛋白的表达量(分别为1.4192±0.1256、1.6779±0.1055和2.3872±0.1495)均增高(均P<0.01)。0.3、0.9和10μmol/L加兰他敏组APP和AD-AM10蛋白水平与对照组比较,均无统计学差异(P>0.05)。结论加兰他敏可使ADAM17表达增加,促进APP代谢过程中sAPPα生成。     

二十烷酸对大鼠原代皮质神经元APP及BACE1表达的影响

目的 观察二十烷酸对大鼠原代皮质神经元β-淀粉样前体蛋白(APP)及β-分泌酶(BACE1)表达的影响,探讨饱和脂肪酸在阿尔茨海默病发病机制中的作用. 方法 将原代培养的大鼠皮质神经元分为2组:对照组、二十烷酸组.Western blotting法检测神经元APP、BACE1蛋白表达,RT-PCR法分析APP及BACE1 mRNA表达. 结果 与对照组相比,二十烷酸组神经元APP751+770mRNA表达和APP蛋白表达显著升高,BACE1蛋白表达也显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 饱和脂肪酸增加APP及BACE1表达,可能在阿尔茨海默病发病机制中起重要作用.     

常压高氧对淀粉样蛋白前体/早老素1双重转基因小鼠脑内老年斑及β-淀粉样蛋白的影响

目的 探讨常压高氧(40%O_2,60%空气)处理淀粉样蛋白前体/早老素1(APP/PS1)双重转基因小鼠是否发挥神经保护作用.方法 对APP/PS1双重转基因阿尔茨海默病(AD)模型种鼠交配后产下的子代小鼠进行基因分型,待子代达10周龄时,取双重转基因小鼠40只,随机分成A、B、C、D 4组,每组10只,A、B 2组小鼠喂养于常压高氧中8 h/d,A组持续4周,B组持续8周;C、D组喂养于空气中4或8周,分别作为A、B组的对照.高氧处理后采用免疫组织化学、Thioflavin S染色检测小鼠脑组织形态学的变化,Western blot检测APP代谢过程中相关蛋白的表达变化,ELISA定量检测小鼠脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)水平的变化.结果 免疫组织化学和Thioflavin S染色均显示,与对照组相比,高氧处理组小鼠皮质和海马内老年斑数量明显减少,B组比A组减少更显著.高氧处理组小鼠脑内C_(99)、C_(83)水平显著高于对照组,Aβ水平明显低于对照组,但各组小鼠脑内全长APP及β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)蛋白水平无明显改变.ELISA结果提示,B组小鼠海马和皮质内Aβ_(40)[(783.6±97.2)pg/ml]和Aβ_(42)[(175.3±17.1)ps/ml]含量明显低于对照组Aβ_(40)[(1251.6±42.3)pg/ml,t=9.36,P<0.01]和Aβ_(42)[(286.8±13.0)pg/ml,t=13.7,P<0.01]的含量.结论 常压高氧处理能显著减少AD模型小鼠脑内Aβ的产生、沉积及老年斑的形成;这种改变可能通过减少Aβ产生或加速Aβ清除实现.     

糖基化终末产物对人神经母细胞瘤细胞APP表达及Aβ生成的影响

目的通过研究糖基化终末产物（AGEs-BSA）以及阻断其与特异性受体RAGE的结合对培养的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的表达以及β淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）生成的影响。方法以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分为4组,空白对照组、BSA组、AGEs-BSA组、AGEs-BSA＋抗RAGE中和抗体组。用MTT法观察细胞形态以及确定AGEs-BSA的最佳干预时间及浓度。用免疫细胞化学方法及免疫印迹方法来检测各组细胞内APP、RAGE表达和Aβ生成情况。结果不同蛋白浓度的BSA处理细胞24、48、72h,与空白对照组比较细胞MTT代谢率,APP、RAGE及Aβ的表达水平没有明显差异,（P〉0.05）;不同蛋白浓度的AGEs-BSA（〉50μg/ml）处理细胞与BSA组比较,细胞MTT代谢率明显降低,并随蛋白浓度升高差异越明显,APP、RAGE、Aβ的表达水平较BSA组明显增加（P〈0.05）,预先用抗RAGE中和抗体（1∶100）1h后再加入AGEs-BSA,APP、Aβ的表达水平较AGEs-BSA组明显减少（P〈0.05）,但仍高于BSA组（P〈0.05）。结论糖基化终末产物能够促使SH-SY5Y细胞中APP、RAGE、Aβ的表达和生成增加。通过阻断其与特异性受体RAGE的结合可以部分减少APP、Aβ的表达和生成。     

降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽生成的影响

目的观察降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)生成的影响,初步探讨胆固醇和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的相关性。方法以稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为模型,分别给予β-甲基环糊精或洛伐他汀对细胞系进行处理;胆固醇定量试剂盒测定细胞内胆固醇水平的变化,放射免疫法测定细胞培养液中Aβ的含量,Western Blot方法半定量检测全长型APP和可溶性APPα的水平。结果β-甲基环糊精和洛伐他汀处理组分别降低细胞胆固醇水平67.5%和49.5%(P<0.05),细胞培养液中Aβ含量分别降低39.5%和25.7%(P<0.05),sAPPα含量分别增加3.5倍和2.0倍(P<0.05)。结论降低细胞胆固醇水平使细胞外Aβ含量减少,sAPPα含量增加,这提示胆固醇可能通过影响APP代谢途径而参与AD的病理过程。     

β-淀粉样肽对人SH-SY5Y细胞突触素、发动蛋白Ⅰ及衔接蛋白180表达的影响

目的 探讨β-淀粉样肽(Aβ)对人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞突触素(Syn)、发动蛋白Ⅰ (Dyn Ⅰ)及衔接蛋白180(AP180)表达的影响。 方法 分别应用0.01、0.1、1、2及5μmol/LAβ1-42处理SH-SY5Y细胞,对照组细胞不加任何处理。MTT法检测细胞增殖情况,Western blotting 检测0.5、1μmol/L Aβ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynⅠ和AP180蛋白表达,RT-PCR检测1 μmol/L Aβ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynⅠ和AP180 mRNA表达。 结果 0.1 μmol/L Aβ1-42处理细胞即可出现细胞增殖率下降,并呈剂量依赖性负性相关关系,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05); 0.5 μmol/L Aβ1-42处理细胞可见DynⅠ蛋白表达降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);1 μmol/L Aβ1-42处理细胞可见Syn、DynⅠ蛋白及mRNA表达均降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);但未见AP180蛋白及mRNA表达水平发生改变。 结论 Aβ1-42可引起人SH-SY5Y细胞Syn和DynⅠ表达降低,该改变可能与AD发病中学习记忆能力减退有关。     

线粒体相关性β淀粉样前体蛋白及线粒体相关性β淀粉样蛋白针对阿尔茨海默病致病机制的研究

线粒体相关性β淀粉样前体蛋白(APP)和线粒体相关性β淀粉样蛋白(Aβ)正逐渐成为研究阿尔茨海默病(AD)病理生理学改变的热点。线粒体相关性APP和线粒体相关性Aβ是指以线粒体为特异性靶点,存在于线粒体膜上或沉积于线粒体基质内的APP和Aβ。文中将分别介绍线粒体相关性APP和线粒体相关性Aβ的来源、结构、功能等方面的研究进展,揭示其与AD发病的密切关系。     

丁基苯酞通过调节自噬干预淀粉样蛋白前体β位剪切酶1的代谢

目的在氧糖剥夺(OGD)细胞模型中,初步探讨丁基苯酞(NBP)调节β淀粉样蛋白(Aβ)代谢中关键酶淀粉样蛋白前体β位剪切酶1(BACE1)水平的可能机制。方法采用Neuro-2a/APP695细胞,建立脑缺血体外OGD细胞模型,观察NBP对自噬抑制剂(3-MA)和自噬诱导剂雷帕霉素(Rapa)的作用。以NBP 10μmol·L-1为后续实验干预浓度分组:1对照组,不做处理;2 OGD组,OGD 1 h;3 OGD+NBP组;4 OGD+NBP+Rapa组,200 ng·L-1 Rapa预处理1 h;5 OGD+NBP+3-MA组,5 mmol·L-1 3-MA预处理1 h。采用单丹染色、Western blot及电镜等方法检测BACE1、LC3蛋白、抗凋亡蛋白(Bcl-2)和Beclin1蛋白水平以观察NBP调节自噬。结果 OGD处理后,细胞中BACE1蛋白表达降低(P0.05)。3-MA可增加BACE1蛋白表达(P0.01)。上调自噬及NBP可降低BACE1蛋白表达(P0.05)。此外,NBP增加Bcl-2表达而减弱应激损伤(P0.05)。结论 NBP可下调BACE1表达,其可能通过抑制自噬过度激活和(或)抗凋亡作用而保护细胞应对应激损伤。     

阿尔茨海默病患者血小板淀粉样前体蛋白代谢的改变

目的 通过观察血小板活化后β淀粉样蛋白(Aβ)水平变化,探讨阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者血小板β-淀粉样前体蛋白(APP)代谢特点.方法 分离36例AD患者和30名健康对照的血小板,用免疫印迹检测凝血酶作用后的可溶性APP水平;同时用放射免疫法测定Aβ含量.结果 凝血酶作用后,血小板上清中可以检测到可溶性APP和Aβ.活化后AD患者血小板上清中可溶性APP水平较对照组水平下降31.0%(P＜0.05).凝血酶活化后,AD组血小板上清Aβ水平从(3.1±2.7)ng/L增加至(5.8±3.2)ng/L(P＜0.01),对照组Aβ水平由(6.1±4.4)ng/L增加为(11.5±5.9)ng/L(P＜0.01).AD组Aβ平均增加(2.8±2.1)ng/L,低于对照组增加水平(5.5±3.6)ng/L(P＜0.01).结论 血小板中含有APP的代谢产物可溶性APP和Aβ.AD血小板可能存在APP代谢异常.     

多光子激光扫描成像技术对活细胞内淀粉样前体蛋白裂解和β-淀粉样蛋白生成的观察(英文)

目的在活细胞内探究淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的裂解和p一淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的生成机制。方法利用PCR扩增CFP(编码蓝色荧光蛋白),YFP(编码黄色荧光蛋白)和C99(编码APP最后99个氨基酸)三片段。含有54个碱基(编码APP中间18个氨基酸)的片段54bp由生物公司合成。CFP,YFP,54bp和C99四个片段连入载体质粒pcDNA3.0得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP- C99。将这两个重组质粒分别瞬时转染SH-SY5Y细胞。利用多光子激光扫描显微镜观察融合基因的表达,荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测APP的β裂解。免疫细胞化学和多光了激光扫描显微镜观察Aβ的生成。MTT检测转染细胞活性。结果(1)限制性内切酶双酶切消化和测序分析鉴定重组质粒序列完全正确。(2)转染细胞内可以观察剑蓝色平和黄色荧光。(3)在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP转染细胞中存在FRET现象;在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染细胞中观察不到FRET现象。(4)免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察到在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染的细胞中有Aβ的牛成。(5)Aβ的沉积广泛分布于细胞内。(6)随着Aβ在细胞内的产生和聚集,细胞的活性逐步下降。结论C99对于APP的β裂解非常重要。早期Aβ首先在细胞内生成并在细胞内形成广泛沉秋。细咆内聚集的Aβ会影响细胞活性,带来不利结果。     

SH-SY5Y神经细胞APP高表达对胆碱酯酶活性影响

目的研究类阿尔茨海默病(AD)神经细胞模型中APP异常代谢下胆碱酯酶活性变化,探讨AD的发病机制。方法采用脂质体转染法将含有瑞典家族性AD双突变的淀粉样蛋白前体蛋白APP670/671基因(APPSWE)转染至神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中;利用实时荧光定量PCR方法和Western blotting的方法测定APPmRNA、可溶性APP(αAPPs)和总APP蛋白表达水平;采用改进的Ellman比色法测定细胞培养基中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BuChE)活性。结果转染APPSWE质粒的SH-SY5Y细胞APP总mRNA和蛋白表达水平显著升高,αAPPs分泌量下降。转染组SH-SY5Y细胞与对照组相比,AChE和BuChE活性都升高。结论体外神经细胞实验证明APP蛋白过度表达能升高AChE和BuChE的活性,其机制可能与APP蛋白代谢紊乱使Aβ升高及下调αAPPs分泌有关。     

糖尿病加剧大鼠脑缺血损伤及皮层淀粉样蛋白的生成

目的探讨糖尿病对缺血所致脑损伤和痴呆相关蛋白表达的影响。方法通过高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病模型;用大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型诱导脑卒中。再灌注1周后,采用免疫组织化学染色观察糖尿病对脑缺血后梗塞灶体积以及皮层神经细胞内淀粉样蛋白（Aβ）及其生成关键酶β-分泌酶（BACE）表达的影响。结果脑缺血后,与正常对照组相比,糖尿病组实验动物梗塞灶体积增大,且皮层存在大量神经元样及活化的胶质细胞样细胞内表达Aβ和BACE。结论糖尿病加剧脑缺血损伤及皮层淀粉样蛋白的表达,可能与糖尿病患者卒中后更为严重的认知功能障碍产生有关。     

胰岛素信号通路磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶对海马神经元β-淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的 通过胰岛素和磷脂酰肌醇-3激酶(PDK)抑制剂渥曼青霉素(wortmannin,WORT)对PI3K/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PDK/Akt)信号通路的激活和抑制作用,观察PI3K/Akt信号通路对海马神经元B-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响.方法 40只SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、胰岛素组和WORT组(每组10只),海马立体定向注射胰岛素和PI3K抑制剂WORT.免疫组织化学和Western blot法检测PI3K/Akt信号传导相关蛋白以及BACE1的表达水平.结果 注射胰岛素的海马PI3K信号通路下游信号分子较对照组:Akt表达增加(0.952±0.060与0.835±0.029,t=4.9150,P=0.0001),Akt set473位点磷酸化(pAkt)水平上调(0.800±0.075与0.657±0.025,t=4.5598,P=0.0002),糖原合成激酶-3α(GSK-3α)磷酸化水平降低(0.604±0.062与0.726±0. 041,t=3.5871,P=0.0018),而成熟的BACE1及其裂解产物β分泌酶C末端(β-CTF)表达下调.WORT组的PI3K下游信号分子Akt、pAkt表达明显被抑制,磷酸化GSK-3α表达增加,同时成熟的BACE1(1.004±0.096)和β-CTF(1.031±0.048)的表达较对照组(分别0.498±0.064,0.786±0.101)上调(分别t=11.5980,P=0.0000;t=4.2194,P=0.0004).结论 胰岛素信号通路PI3K/AKt可以调节BACE1的表达和活性并参与阿尔茨海默病的发病机制.     

促红细胞生成素对Aβ25-35诱导的细胞tau蛋白磷酸化的抑制作用

目的 探讨促红细胞生成素(Epo)对凝聚态β淀粉样蛋白25-35片断(Aβ25-35)诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响.方法 MTT法观察不同浓度的Epo(0、5、10、20、50 U)单独作用24 h对SH-SY5Y细胞存活率的影响;20 μmol/L的凝聚态Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞不同时间点(0 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)后,Western blot法检测tau蛋白磷酸化(Ser199、Ser396及taul)水平的变化;观察不同浓度的Epo(5、10、20 U)预处理细胞3 h后对Aβ25-35作用的影响以及P13K/Akt抑制剂LY294002(50μmol/L)预处理细胞1 h后Epo抑制作用受到的影响.结果 不同浓度的Epo作用24 h后,MTT示细胞存活率无明显变化.20 μmol/L的Aβ25-35作用不同时间点后,tau蛋白Ser396、Ser199位点的磷酸化水平3 h时开始增加,6 h达到最高峰,12 h后又逐渐下降,24h时仍维持较高水平,与0min、30min时比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而总的tau蛋白没有任何变化.5、10、20U Epo预处理均可有效地抑制Aβ25-35引起的Ser396、Ser199位点的磷酸化,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).LY294002预处理细胞后,Epo的作用受到抑制.结论 Epo可通过P13K/Akt途径对Aβ25-35诱导的tau蛋白磷酸化发挥抑制作用,本研究为研究AD的发病机制及探索新的有效治疗药物提供了重要的理论基础.     

亚低温治疗对颅脑创伤后β-淀粉样蛋白表达影响的实验研究

目的 探讨亚低温治疗对大鼠颅脑创伤( TBI)后β-淀粉样蛋白(Aβ)基因和蛋白表达的影响.方法 将60只SD大鼠分为假手术组(n=20)、常温脑创伤组(37C,n=20)和亚低温脑创伤组(32℃,n =20).建立SD大鼠液压打击致颅脑创伤模型.亚低温脑创伤组在液压打击伤后立即接受持续6h的亚低温治疗.伤后24h处死大鼠并取海马组织行HE染色,用RT-PCR、蛋白免疫印迹( Western blot)和免疫组化法检测Aβ基因转录和蛋白的表达.结果 与假手术组比较,颅脑创伤后24hAβ免疫阳性细胞数明显增加(P＜0.01),其mRNA和蛋白表达分别升高1.58和1.76倍.与常温脑创伤组比较,亚低温组Aβ免疫阳性细胞数明显减少(P＜0.01),其mRNA和蛋白表达分别下降68％和64％.结论 亚低温治疗可降低颅脑创伤后Aβ基因转录和蛋白的上调表达,通过抑制Aβ的神经毒性来发挥神经保护作用,而亚低温与Aβ的确切关系还有待进一步研究.     

荧光标记的突变型淀粉样前体蛋白裂解过程的细胞研究

目的 研究淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶解过程,构建含有Swedish和APP717两种突变的荧光真核表达系统.方法 以pcDNA3.0-APP为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)得到含有APP717突变的APP最后300个碱基片段(C99);以pcDNA3.0-CFP-CaM-YFP酶切产物为模板,通过PCR分别得到编码蓝色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)碱基序列;生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54 bp).利用基因工程技术将CFP、54 bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切、PCR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54 bp-YFP,并将其转染至人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞中,利用多光子共聚焦显微镜观察荧光表达,检测荧光共振能量转移(FRET)以及免疫细胞化学染色观察B淀粉样蛋白(Aβ).结果 (1)基因序列分析证明重组质粒构建成功.(2)利用多光子共聚焦显微镜观察转染细胞,显示融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光.(3)表达CFP-54bp-YFP的细胞有FRET现象,而表达CFP-54bp-YFP-C99的细胞中观察不到FRET现象.(4)利用多光子共聚焦显微镜发现CFP-54bp-YFP-C99转染的细胞中有YFP标记的A13产生并沉积在胞质胞膜以及细胞间隙中.(5)免疫细胞化学检测证实CFP-54bp-YFP-C99经过裂解可以产生Aβ,Aβ在细胞膜、细胞质、细胞间隙聚集沉积.结论 (1)融合基因的表达产物能够完成APP的有序裂解产生Aβ.(2)Aβ有可能产生于APP由胞质至胞膜的运输过程中.(3)研究显示C99对于APP被裂解有重要意义,可能起到信号肽样的引导定位作用.(4)在细胞外形成沉积之前,Aβ已经在细胞内聚集导致细胞形态改变.