亚砷酸对人肝癌细胞凋亡及ERK-1蛋白表达的影响

目的探讨亚砷酸对人肝癌细胞BEL-7402凋亡及ERK-1蛋白表达的影响.方法通过体外细胞培养,用流式细胞术观察BEL-7402细胞周期及凋亡率变化;HE染色法、荧光显微镜观察细胞的凋亡形态变化;并用免疫组化法检测细胞ERK-1蛋白的表达.结果亚砷酸(1.0～8.0 μmol/L)能诱导BEL-7402细胞凋亡并阻滞细胞周期于S、G2/M期,呈剂量依赖性;亚砷酸(8.0 μmol/L)作用BEL-7402细胞48 h后, HE染色、荧光显微镜观察可见BEL-7402细胞呈现明显的凋亡形态改变;免疫组化法检测发现8.0 μmol/L的亚砷酸作用48 h 后BEL-7402细胞的ERK-1蛋白表达明显减弱. 结论亚砷酸体外有诱导人肝癌细胞凋亡及降低ERK-1蛋白表达的作用.     

姜黄素调节Bcl-2、Bax蛋白表达诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡

目的 研究姜黄素诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及其分子机制.方法 用10、20、40 μmol/L姜黄素(对照组0μmol/L)处理增生性瘢痕成纤维细胞24 h,MTT法检测姜黄素对细胞增殖的影响,Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-9、Caspase-3活性,Western Blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达.结果 MTT结果显示姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制作用,抑制率随姜黄素浓度增加而上升(P＜0.05);Annexin V-FI℃/PI双标法结果显示成纤维细胞凋亡率随姜黄素浓度增加而上升(P＜0.05);经姜黄素作用,Caspase-9、Caspase-3的活性随姜黄素浓度增加而升高(P＜0.05);West-ern Blot结果显示Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达升高,Bax/Bcl-2比值增大,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用,其机制与下调Bcl-2蛋白表达、上调Bax蛋白表达,升高Caspase-9、Caspase-3活性有关.     

甘草酸诱导人乳腺癌细胞凋亡和细胞内Ca2+的相关性研究

目的 探讨甘草酸对人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖抑制和诱导凋亡的作用,了解凋亡发生与细胞内Ca2 的相关性.方法 MTT比色法测定细胞增殖能力,末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP末端标记法、Annexin V流式细胞仪法和单细胞凝胶电泳(彗星试验)法检测凋亡细胞,Fura-2荧光负载方法测定[Ca2 ]i的变化.结果 从5 mmol/L甘草酸浓度起对MCF-7细胞的增殖抑制率显著升高(P＜0.01),呈剂量依赖性,半增殖抑制浓度(IC50)为15.84 mmol/L.7.5 mmol/L和10.0 mmol/L甘草酸使细胞凋亡率显著升高(P＜0.05和P＜0.01).甘草酸处理组的[Ca2 ]i明显低于对照组(P＜0.05).甘草酸与BAPTA-AM组合处理组的凋亡率明显高于单纯的7.5 mmol/L处理组(P＜0.05和P＜0.01).结论 甘草酸具有抑制MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡的作用;其诱导凋亡可能与细胞内Ca2 水平下调有关.     

复尔康注射液对肝癌 HepG2 细胞凋亡和 VEGF 表达的影响

目的 研究复尔康注射液对肝癌 HepG2 细胞凋亡和 VEGF 表达的影响。方法 复尔康注射液干预 HepG2 细胞 48 h 后,CCK8 试剂盒检测细胞的增殖活性,Hoechst 33258 荧光染色观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞仪 Annexin V/PI 双染法检测细胞的凋亡率,免疫组化 SABC 法检测细胞 VEGF 的表达。结果 复尔康注射液可抑制 HepG2 细胞的增殖,IC50值为 (29.63±1.22) mg/L。复尔康注射液 5、10 mg/L 干预 HepG2 细胞 48 h 后,Hoechst 33258 荧光染色可见核浓缩、核碎裂等凋亡形态学改变,Annexin V/PI 双染法检测显示细胞凋亡率明显升高,免疫组化 SABC 法检测显示 VEGF 的表达明显减弱,且呈现出一定的量效关系。结论 复尔康注射液可诱导 HepG2 细胞凋亡,减弱 VEGF 的表达。     

大黄素诱导白血病K562细胞凋亡的实验研究

目的:探讨大黄素对人白血病K562细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用.方法:采用MTT法检测大黄素对K562细胞的增殖抑制作用;通过Wight-Giemsa染色(W-G染色),在普通光镜下观察细胞的形态学变化;运用Annexin V/PI双标记法检测大黄素对K562细胞的凋亡效应;采用流式细胞技术检测细胞周期变化与凋亡情况;通过比色法检测Caspase-3、8、9的相对活性,分析大黄素诱导K562细胞凋亡的信号途径.结果:大黄素能显著抑制K562细胞的增殖,作用24、48、72 h后的半数抑制率浓度分别为80、50、40 μmol/L;处理组细胞在普通光镜下可见典型的凋亡形态学改变;Annexin V/PI双标记法检测到K562细胞在大黄索的诱导下出现早期凋亡并呈剂量依赖性(P<0.01);流式细胞仪结果分析发现,处理组的K562细胞被阻滞于G0/G1期,与对照组相比,凋亡率明显升高并呈现剂量依赖性(P<0.01);大黄素可触发caspase-3、8、9的活性增高(P<0.01).结论:大黄素能有效地抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制和Caspase信号途径的活化有关.     

姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用及机制研究

目的:探讨姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制、诱导凋亡作用及其分子作用机制。方法:MTT法检测姜黄素对MCF-7细胞的增殖抑制作用;流式细胞术PI单染法检测细胞周期;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的mRNA表达水平。结果:姜黄素对MCF-7细胞生长有明显抑制作用,并呈剂量、时间依赖性;FCM结果显示姜黄素能使MCF-7细胞阻滞在G1/S期;Annexin V/PI双染法验证姜黄素可以诱导细胞凋亡;RT-PCR结果显示Bax mRNA水平明显上调,而Bcl-2的mRNA表达水平降低。结论:姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖具有显著的抑制作用并可诱导细胞凋亡,其作用机制可能与其上调Bax基因表达水平的同时,下调Bcl-2基因表达水平,从而诱导细胞凋亡有关。     

氟对体外培养的小鼠睾丸间质细胞增殖和细胞凋亡的影响

目的 观察不同浓度氟化钠对睾丸间质细胞增殖和细胞凋亡的影响,为氟中毒的机制研究提供依据.方法 取体外培养的睾丸间质细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,常规培养,待细胞融合率达80％,且未出现细胞分化时,将细胞分4组,加入不同浓度的氟化钠染毒(0,5,10,20 mg/L)睾丸间质细胞,分别干预0,24,48,72,96,120 h后采用MTT法检测各组细胞的增殖.干预48 h后采用流式细胞仪Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡率.结果 ①氟作用24,48 h后,20 mg/L的氟化钠对睾丸间质细胞增殖率有明显抑制作用,而5 mg/L和10 mg/L组没有明显影响；作用72 h后,10 mg/L的氟化钠明显抑制睾丸间质细胞的增殖；各浓度氟作用96 h和120 h后均表现明显抑制作用.②不同浓度氟化钠对睾丸间质细胞作用48 h后,均可诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡.氟化钠浓度为10 mg/L时,晚期凋亡率最高.氟化钠浓度为20 mg/L时,早期凋亡率最高.结论 氟对小鼠睾丸间质细胞的增殖有抑制作用,并诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡.     

川楝素提取物诱导 K562 细胞凋亡的实验研究

目的 探讨川楝素提取物对人白血病 K562 细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制。方法 采用 MTT 法检测川楝素提取物对 K562 细胞增殖的影响;Wright′s染色观察细胞的形态学改变;流式细胞技术检测细胞周期与凋亡率的变化;Annexin V/PI 双标记法检测细胞的早期凋亡变化;DNA 琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 片段化;比色法检测 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 相对活性的改变;RT-PCR 检测凋亡相关基因 p21、bcr/abl、H-ras mRNA 表达水平的改变。结果 川楝素提取物显著抑制 K562 细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖性,作用 72 h 的 IC50值为 20 nmol/L;处理组细胞可见典型的凋亡形态学改变;细胞周期和 Annexin V/PI 双标记检测表明川楝素提取物可诱导 K562 细胞凋亡,并呈剂量-时间依赖性;处理组细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳出现明显的 DNA ladder;处理组细胞 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的活性均显著增加;p21、H-ras mRNA 表达上调,bcr/abl mRNA 表达下调。结论 川楝素提取物对 K562 细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,其机制与 Caspase 信号途径的活化有关。     

青蒿琥酯诱导人白血病细胞K562凋亡的实验研究

目的观察青蒿琥酯对人白血病细胞株K562抑制增殖和凋亡作用.方法通过MTT显色法观察不同浓度青蒿琥酯对K562的生长抑制作用,通过Annexin V/PI双标记法检测青蒿琥酯对K562细胞的凋亡诱导作用.结果青蒿琥酯在1～8μg/ml浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度的依赖性;在2～8μg/ml浓度范围内青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡具有明显的量效关系;4μg/ml浓度组的青蒿琥酯在0～72h内,诱导K562凋亡具有明显的时效关系.结论青蒿琥酯在体外能抑制K562细胞的增殖,可能是通过诱导其发生凋亡而起作用.     

全反式维甲酸对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察全反式维甲酸对体外培养的眼眶成纤维细胞增殖的影响以及促胞凋亡的作用.方法 体外培养甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞;将不同浓度的ATRA(0、10-9 mmol/L、10-8mmol/L、10-7mmol/L、10-6 mmol/L和10-5 mmol/L)作用于成纤维细胞细胞分别达24、48和72 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法观察ATRA对细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测ATRA处理48h后细胞周期的改变及细胞凋亡率;检测ATRA处理48 h后细胞内bcl-2蛋白的表达水平.结果 MTT法显示ATRA能降低成纤维细胞的A值(P＜0.05),细胞生长抑制率随作用时间和药物浓度的增加而增加.流式细胞仪检测细胞周期阻滞在G1期;凋亡率随着浓度的增加而上升;bcl-2蛋白的表达水平较正常对照组细胞明显下调.结论 ATRA能够抑制成纤维细胞的增殖,抑制作用呈时间和剂量依赖性;ATRA通过将细胞阻滞在G1期而起到抑制作用;ATRA可以诱导成纤维细胞凋亡,诱导细胞凋亡作用与下调细胞内bcl-2蛋白的表达有关.     

活性氧介导重楼皂苷诱导脑胶质瘤细胞凋亡的研究

目的 探讨重楼皂苷类化合物对脑胶质瘤细胞L N229的增殖抑制作用,并初步阐释重楼皂苷Ⅶ(PPⅦ)诱导LN229细胞死亡的机制.方法 采用CCK-8法测定4种重楼皂苷类化合物对LN229细胞的增殖抑制效应;倒置显微镜成像法分析PPⅦ对LN229细胞形态的影响;DCFH-DA探针法检测PPⅦ作用后LN229细胞内活性氧(ROS)的变化;JC-1染色法检测PPⅦ诱导LN229细胞线粒体膜电位的改变情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测PPⅦ作用LN229细胞后对细胞凋亡的诱导效应.结果 CCK-8结果表明,4种重楼皂苷类化合物均能抑制LN229细胞增殖,其中PPⅦ的增殖抑制效果最好,其24 h的IC50为2.029μmol/L;形态学结果显示,PPⅦ可诱导LN229细胞形态发生凋亡样改变;DCFH-DA和JC-1染色结果提示,PPⅦ增加细胞内ROS水平并诱导LN229细胞线粒体膜电位改变;Annexin V-FITC/PI双染结果显示,PPⅦ诱导LN229细胞凋亡.结论 重楼皂苷类化合物能有效抑制人胶质瘤细胞LN229增殖;PPⅦ对LN229细胞的增殖抑制作用可能是通过ROS介导的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,进而发挥抗胶质瘤效应.     

5味中药对体外培养原代人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响

目的 利用原代培养的人外阴正常皮肤成纤维细胞,观察中药对人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响.方法 胰蛋白酶消化、分离及培养人外阴皮肤成纤维细胞;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;测定细胞生长曲线;MTT法测定莪术、黄芪、丹参、川穹及当归5种中药作用后细胞增殖能力.结果 生长曲线测定结果显示:传6代内以及传6代内复苏人外阴皮肤成纤维细胞增殖能力均很强.MTT检测结果显示:5种药物在特定浓度范围内均能抑制人外阴皮肤成纤维细胞的增殖.分别作用于人外阴皮肤成纤维细胞72 h后,莪术5、10、100 mg/L浓度组,黄芪500、1 000 mg/L浓度组,丹参1 000 mg/L浓度组,川穹500、1 000 mg/L浓度组,当归100、500、1 000 mg/L浓度组均显示抑制增殖作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其中莪术和川穹的抑制强度呈剂量依赖性.结论 成功建立了体外人外阴皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定方法;特定浓度范围内的莪术、黄芪、丹参、川穹和当归能够抑制人外阴皮肤成纤维细胞的体外增殖.     

柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02细胞增殖和凋亡的初步观察

目的:探讨柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine,SASP)对正常肝细胞和肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖和凋亡的影响.方法:以正常人肝细胞株(L02细胞)和大鼠肝星状细胞株(HSC-T6细胞)为研究靶细胞,用CCK-8比色法检测细胞增殖;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测HSC-T6细胞凋亡率;AO/EB染色法观察细胞凋亡形态.结果:同对照组比较,一定浓度范围的SASP对HSC的增殖具有显著的抑制作用,呈现时间和剂量效应.膜联蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(PI)双染显示SASP诱导HSC-T6凋亡也旱现时间和剂量效应;AO/EB染色出现凋亡细胞的特征性改变.而SASP干预L02后,与对照组相比,增殖和凋亡率均无统计学意义,AO/EB染色后,未出现凋亡细胞.结论:同等干预浓度的SASP能够选择性的抑制HSC增殖,诱导其凋亡.     

苦参碱体外诱导人结肠腺癌SW620细胞凋亡的实验研究

目的 观察苦参碱(MT)诱导结肠腺癌细胞株SW620凋亡的作用并探讨其可能机制.方法 采用MTT法检测MT对SW620细胞的增殖抑制作用.应用流式细胞仪检测MT对SW620胞生长周期的影响,光学显微镜、荧光显微镜、电镜下观察细胞形态学变化.Annexin V-FITC法检测MT对SW620细胞凋亡的影响.结果 MT抑制SW620细胞增殖和诱导SW620细胞的凋亡作用均呈剂量和时间依赖性,其48 h IC50=0.934 mg/ml.与对照组相比,苦参碱处理后的SW620细胞G0/G12期百分比明显增高,S期细胞比例下降.细胞爬片HE染色以及透射电镜可见实验组细胞出现典型的细胞凋亡形态改变:细胞皱缩,体积减小,胞浆凝聚,空泡化明显,凋亡小体形成以及所谓的"印戒"细胞.结论 MT在体外能抑制SW620细胞的增殖.诱导细胞凋亡,其诱导作用具有明显的量效和时效关系.     

藤黄酸诱导Burkitt淋巴瘤细胞株凋亡及增殖抑制的分子学机制

[目的]研究藤黄酸对Burkitt淋巴瘤细胞株Namalva细胞增殖与凋亡的影响及其分子学机制,探讨藤黄酸治疗Burkitt淋巴瘤的潜在应用价值.[方法]用不同剂量藤黄酸处理细胞,采用MTS法对淋巴瘤细胞进行细胞活力及增殖抑制测定;0.25、0.5、0.75μmol/L藤黄酸分别处理细胞24 h,0.75μmol/L藤黄酸分别处理细胞6、12、24h后收集细胞,采用Annexin V-FTIC/PI流式细胞术检测藤黄酸剂量依赖性细胞凋亡情况;利用Western blot方法检测凋亡相关蛋白和细胞增殖信号通路相关蛋白剂量与时间依赖的变化情况.[结果]藤黄酸明显抑制Namalva细胞的增殖,诱导Namalva细胞发生凋亡.随藤黄酸浓度升高与作用时间延长,细胞中PARP,caspase 8出现切割,Bax表达上调,Pro-caspase 3,Pro-caspase 9,Bcl-2表达下调.增殖通路蛋白STAT5、p-STAT5、ERK、p-ERK的表达受到明显抑制.[结论]藤黄酸通过影响Burkitt淋巴瘤细胞株Namalva细胞凋亡相关蛋白的表达,促进细胞凋亡;通过抑制JAKs/STATs、MEK/ERK信号转导通路的活化,抑制Burkitt淋巴瘤细胞的增殖.     

亚砷酸对人肺腺癌细胞的体外抑制作用及机制研究

【目的】探讨中药砒霜有效成分亚砷酸的体外抑瘤作用及机理。【方法】以体外培养的人肺腺癌细胞株(LAC)细胞为研究对象,选用对数生长期细胞,培养24 h后,分别加入不同浓度的亚砷酸(0.75、1.0、1.5、2.0 mg/L),并设模型对照组;采用倒置相差显微镜观察细胞形态,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测LAC细胞的生长抑制率;酶联免疫吸附(ELISA)法检测p53基因的表达变化情况。【结果】各浓度亚砷酸均能使LAC细胞发生凋亡特征性形态改变,能显著性抑制LAC株的增殖,且呈现一定的时间效应关系,并能显著性升高p53基因的含量(均P<0.05或P<0.01)。【结论】亚砷酸抗肺癌的作用可能是通过上调p53基因的表达来诱导LAC肿瘤细胞凋亡,从而抑制LAC细胞的增殖,这可能也是中药砒霜能治疗肿瘤的机理之一。     

地塞米松抑制人肺成纤维细胞增殖和丝裂原活化蛋白激酶信号转导途径

目的探讨地塞米松对人肺成纤维细胞周期和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的作用.方法不同浓度的地塞米松作用于培养的人肺成纤维细胞,采用直接计数法测定细胞的增殖,PI(propidium iodide)染色流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡,用特异的抗磷酸化抗体、Western印迹法分别检测c-Jun N-末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)和p38蛋白的磷酸化,用特异的MAPK抗体分别检测相应的JNK、ERK和p38蛋白.结果1×10-7mol/L和1×10-6mol/L地塞米松抑制肺成纤维细胞增殖,4 d时细胞增殖分别减少了34%和72%,呈剂量依赖关系;地塞米松阻断肺成纤维细胞的细胞周期,G0/G1期细胞比率从(81.9±3.0)%增加到(90.1±1.4)%(P＜0.05),但地塞米松不能诱导肺成纤维细胞的凋亡;地塞米松抑制ERK的磷酸化,但不影响肺成纤维细胞中JNK和p38的激活.结论地塞米松能够抑制肺成纤维细胞的增殖,这种作用部分是通过抑制MAPK信号转导通路的ERK途径实现的,对JNK和p38途径影响较少;地塞米松不能直接诱导肺成纤维细胞的凋亡.     

免疫抑制剂对人外周血活化T淋巴细胞凋亡的影响

目的研究免疫抑制剂霉酚酸(MPA)和环孢素A(CsA)对人外周血活化T淋巴细胞凋亡的影响,并探讨其作用的途径及机理.方法以植物血凝集素M活化人外周血T淋巴细胞,光学显微镜及透射电镜观察细胞凋亡的形态学特征,琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂,流式细胞仪分析细胞膜联蛋白V(Annexin V)表达.结果MPA作用后,外周血活化T淋巴细胞出现凋亡特征性形态改变和DNA梯形条带,CsA作用后则无此表现.0.1～10mmol/L的MPA作用外周血活化T淋巴细胞24、48h,Annexin V阳性细胞均明显增加(P＜0.05或0.01),并呈药物浓度依赖性(r=0.752,P＜0.01)和作用时间依赖性(r=0.583,P＜0.01);0.1～1mmo/L CsA作用外周血活化T淋巴细胞24、48h,Annexin V阳性细胞均明显减少(均P＜0.05).结论治疗浓度的MPA可诱导人外周血活化T淋巴细胞凋亡,CsA则抑制活化T淋巴细胞凋亡.     

海兔中新环氧甾醇的体外抗肿瘤活性研究

目的:研究一种海兔中新环氧甾醇(HEO)的体外抗肿瘤活性.方法:以体外培养的人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60作为研究对象,采用3H-TdR掺入实验、Annexin Ⅴ荧光染色检测、流式细胞术、透射电镜等观察HEO对细胞周期和诱导凋亡的作用,以考察HEO的抑瘤活性.结果:HEO对HL-60作用24 h的半数抑制浓度IC 50为1.4 mg/L,在0.8 mg/L时已明显抑制HL-60细胞的对数生长;3H-TdR掺入实验表明,随着HEO作用时间的延长,对HL-60细胞的增殖抑制作用明显增强.Annexin Ⅴ荧光染色表明HEO在作用24 h后,大量HL-60细胞开始出现凋亡.透射电镜显示肿瘤细胞染色质呈现凋亡表现.细胞周期分析显示G2 M期细胞增多.结论:HEO明显抑制HL-60生长,并通过诱导凋亡杀伤肿瘤细胞,抗肿瘤活性强;对细胞周期的影响提示其抑瘤机制可能为M期阻滞.     

PPARγ激动剂对白血病NB4细胞的诱导凋亡作用及其作用机制

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮(rosiglitazone,RGZ)对白血病NB4细胞的诱导凋亡作用及其作用机制。方法以不同浓度的RGZ作用于体外培养的NB4细胞0、24、48及72h,应用MTT法检测细胞生长抑制率,用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,并对细胞凋亡前后P53蛋白的表达水平进行检测。结果RGZ可显著抑制细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,呈现出明显的量-效与时-效关系,在细胞凋亡的同时,P53蛋白的表达水平明显升高。结论PPARγ激动剂RGZ能显著抑制NB4细胞的生长并诱导细胞发生凋亡,升高促凋亡蛋白P53的表达水平可能是RGZ诱导NB4细胞发生凋亡的重要作用机制之一。