用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的 :寻找新的肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关基因。方法 :应用荧光 差异显示 (fluorescentdifferentialdisplay)技术分析人HCC、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达 ,差异表达cDNA片段 ,经测序后 ,再用RNA狭缝杂交对部分差异片段在上述 4种组织中的表达进行验证。结果 :共得到差异表达cDNA片段 110条。经狭缝杂交筛选 ,获得了 4条阳性片段 ,未知cDNA片段L2和与人醛缩酶B 99.5 %同源的cDNA片段L7在部分HCC中特异性低表达 ,未知cDNA片段LC2 7和与人Nip3基因 99.4%同源的cDNA片段LC2 0在部分HCC中特异性高表达。结论 :确认了 4条HCC相关基因。其中L2和人醛缩酶B基因可能为阻抑HCC发生、发展的基因 ,而人Nip3基因和LC2 7可能为促进HCC发生、发展的基因。L2和LC2 7为目前未知的新基因。     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

人成骨肉瘤MG-63细胞雌激素相关基因的分离

目的 :筛查 17β雌二醇 (17β estradiol,E2 )诱导人成骨肉瘤MG 6 3细胞株差异表达cDNA片段 ,寻找雌激素相关基因。方法 :改良的cDNA代表性差异分析法 (cDNArepresentationaldifferenceanalysis,cDNARDA)分离E2 干预MG 6 3细胞株表达上调cDNA片段 ,经Southern和快速Northern杂交证实表达上调的cDNA片段来源后 ,将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,蓝白筛选后挑取阳性克隆进行测序和同源比较分析 ,最后选取其中部分克隆行Northern印迹杂交。结果 :第 4轮消减杂交得到 5个E2 诱导人成骨肉瘤MG 6 3细胞表达上调的差异cDNA条带 ,Southern和快速Northern杂交证明表达上调的cDNA片段来自E2 干预的MG 6 3细胞 ;随机选 2 5个克隆测序得到13个序列 ,7个与已知基因高度同源 ;其中 2个克隆经Northern杂交证实E2 干预后表达上调。结论 :cDNARDA能有效筛查差异表达基因 ,人成骨肉瘤MG 6 3细胞中某些基因受雌激素诱导表达上调 ,可能与绝经后骨质疏松的发病相关。     

PPARγ2诱导脂肪细胞分化相关基因的克隆及鉴定

目的分离和克隆小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2)诱导脂肪细胞分化的相关基因.方法在体外建立mPPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞分化成脂肪细胞模型基础上,采用mRNA差异显示技术分离、克隆PPARγ2诱导的脂肪细胞高表达或低表达的cDNA片段,再通过半定量RT--PCR证实. 结果经mRNA差异显示技术分离到20条差异显示片段,进一步对差异显示片段进行PCR扩增、T/A亚克隆及测序分析,与Gen Bank基因数据库比较后,得到8个已知基因,一条新基因序列,2个EST序列和7个新的EST序列.半定量RT--PCR结果显示UNR基因在PPARγ2诱导的脂肪细胞中表达上调,而凋亡抑制因子5(API5)的表达则下调. 结论UNR基因的高表达和API5基因的低表达可能与PPARγ2诱导脂肪细胞分化有关.     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

人成骨肉瘤MG-63细胞雌激素相关基因的分离

目的：筛查17β雌二醇(17β-estradiol，E2)诱导人成骨肉瘤MG-63细胞株差异表达cDNA片段，寻找雌激素相关基因。方法：改良的cDNA代表性差异分析法(cDNA representational difference analysis,cDNA RDA)分离E2干预MG-63细胞株表达上调cDNA片段，经Southern和快速Nortthern杂交证实表达上调的cDNA片段来源后，将其克隆到pGEM-T easy载体，蓝白筛选后挑取阳性克隆进行测序和同源比较分析，最后选取其中部分克隆行Norern印迹杂交。结果：第4轮消减杂交得到5个E2诱导人成骨肉瘤MG-63细胞表达上调的差异cDNA条带，Southern和快速Northern杂交证明表达上调的cDNA片段来自E2干预的MG-63细胞；随机选25个克隆测序得到13个序列，7个与已知基因高度同源；其中2个克隆经Northern杂交证实E2干预后表达上调。结论：cDNA RDA能有效筛查差异表达基因，人成骨肉瘤MG-63细胞中某些基因受雌激素诱导表达上调，可能与绝经后骨质疏松的发病相关。     

正加速度重复暴露大鼠脑差异表达基因的筛选

目的 筛选大鼠经正加速度(Gosiliveacceleration， Gz)重复暴露后脑的差异表达基因，探讨 Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术，构建高消减效率的 Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库；用差异筛选技术筛选阳性克隆；用序列分析确定阳性克隆的性质；用RT—PCR证实阳性克隆的可靠性。结果 从消减库中获得70个阳性克隆；经差异筛选后，选取其中10个阳性克隆，序列分析表明，7个克隆与已知基因高度同源，3个为新的候选基因。RT—PCR证实了差异表达基因在 Gz重复暴露大鼠脑中高表达。结论 用抑制性消减杂交技术筛选发现的3个新的cDNA可能在 Gz脑损伤的病理过程中起重要作用。     

mRNA差异显示法筛选大肠癌相关基因

目的：分离并克隆大肠癌相关基因。方法：分别提取大肠癌与正常大肠粘膜的组织总RNA,用mRNA差异显示法（Differential display polymerase chain reaction,DD-PCR)筛选大肠癌特异性表达产物的cDNA片段,对其进行克隆、测序、序列分析以及斑点杂交初步鉴定。结果：获得了2个在大肠癌高表达而在正常大肠粘膜组织低表达的新基因片段。结论：这2条差异显示新基因片段很可能是与大肠癌相关的致癌基因。     

PPARγ2诱导脂肪细胞分化相关基因的克隆及鉴定

目的 分离和克隆小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2（mPPARγ2)诱导脂肪细胞分化的相关基因。方法 在体外建立mPPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞分化成脂肪细胞模型基础上,采用mRNA差异显示技术分离、克隆PPARγ2诱导的脂肪细胞高表达或低表达的cDNA片段,再通过半定量RT－PCR证实。结果 经mRNA差异显示技术分离到20条差异显示片段,进一步对差异显示片段进行PCR扩增,T／A亚克隆及测序分析,与Gen Bank基因数据库比较后,得到8个已知基因,一条新基因序列,2个EST序列和7个新的EST序列。半定量RT－PCR结果显示UNR基因在PPARγ2诱导的脂肪细胞中表达上调,而凋亡抑制因子5（AP15）的表达则下调。结论 UNR基因的高表达和API5基因的低表达可能与PPARγ2诱导脂肪细胞分化有关。     

肝癌细胞表达差异cDNA克隆的研究

目的：筛选肝细胞癌(HCC)相关基因，探讨其在HCC发病中的临床意义。方法：用差异显示技术对比研究正常肝组织，胎肝组织，HCC组织及癌旁肝组织之间mRNA的表达差异，以肝癌cDNA片段MRG8．2为探针，对10例HCC及癌旁肝组织进行斑点印渍分析，并通过逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测这些标本血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平。结果：获得55个HCC差示cDNA片段，其中24个cDNA片段同时表达于HCC和胎肝组织cHCC差示片段MRG98．2在7例HCC标本中表达阳性(7／10)，癌旁肝组织弱表达(2／10)或元表达。VEGFmRNA在7例MRG98．2阳性表达的HCC标本中6例表达上调。结论：胚胎期某些基因的激活与HCC发生有关，差示片段MRG98．2可能是HCC相关的基因片段，其表达与VEGFmRNA一致，并可能与肿瘤浸润转移及顶后不良有关。     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

新生大鼠大脑特异表达基因的初步筛选

目的 获得新生大鼠大脑特异表达的cDNA序列,筛选与新生大鼠大脑发育相关的未知的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）。方法 以新生大鼠的大脑mＲＮＡ逆转录cDNA作为实验组（tester）,成年大鼠大脑mRNA逆转录cDNA作为对照组（driver）,经抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH)方法消除同成年大鼠大脑相同的cDNA,并富集低丰度基因,克隆建立新生大鼠大脑特异表达的cDNA文库。结果 获得11个cDNA基因片段,同时将测序结果与Genebank进行同源性比较,发现5个首次在大鼠大脑中检测到的基因序列。结论 SSH是目前寻找差异表达基因的最为简便有效的方法,为寻找大鼠大脑发育差异表达基因提供了一些线索。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

高密度脂蛋白诱导内皮细胞系差异表达基因的研究

目的：研究高密度脂蛋白（HDL）抗动脉粥样硬化（AS）的分子机理,克隆并分析血管内皮细胞在HDL作用下差异表达的已知和未知基因。方法：应用差异显示逆转录聚合酶链反应技术,分析人脐静脉内皮细胞系（ECV）304经高密度脂蛋白诱导后表达明显差异的cDNA。对差异基因进行序列测定和同源性比较,Northern印迹分析部分差异基因的表达情况。结果：HDL诱导ECV304细胞出现一些上调和下调表达的cDNA,差异表达明显的书籍基因有9个,其中上调表达的基因包括STE20样激酶、PBK1蛋白、转谷氨酰胺酶、肌球蛋白轻链、apobec-1结合蛋白、DAP蛋白;下调表达的基因有核糖体蛋白L7a（RPL7A）、线粒体外膜电压依赖性阴离子通道蛋白基因、甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶。差异表达明显的未知基因4个。Northern印迹证实,转谷氨酰胺酶基因表达上调50％,apobec-1结合蛋白基因表达上调70％。结论：HDL可诱导ECV304细胞转谷氨酰胺酶、apobec-1结合蛋白表达水平上调。这两个基因表达水平的升高可能与HDL抗动脉粥样硬化作用相关。     

抑制性消减杂交技术在研究热适应机制中的应用

目的探索热适应动物体内在常温静息状态下是否存在与热适应相关的基因差异表达,评估从基因差异表达角度研究热适应机理的可行性。方法在大鼠肝组织标本上提取mRNA,反转录成双链cDNA,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)比较热适应组与常温对照组基因的差异,构建差异表达基因消减文库。采用PCR-Select Differential Screening技术鉴定是否存在差异表达的基因。结果初期实验证实6个cDNA片段为差异表达。结论热适应大鼠在常温静息状态下肝脏组织中存在热适应相关基因的差异表达,推测可能与大鼠保持热适应能力有关。提示通过分离热适应相关的差异表达基因研究热适应机制是一种可行的思路。     

抑制性消减杂交技术在研究热适应机制中的应用

目的 探索热适应动物体内在常温静息状态下是否存在与热适应相关的基因差异表达。评估从基因差异表达角度研究热适应机理的可行性。方法在大鼠肝组织标本上提取mRNA，反转录成双链cDNA，应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)比较热适应组与常温对照组基因的差异，构建差异表达基因消减文库。采用PCR-Select Differential Screening技术鉴定是否存在差异表达的基因。结果初期实验证实6个cDNA片段为差异表达。结论热适应大鼠在常温静息状态下肝脏组织中存在热适应相关基因的差异表达。推测可能与大鼠保持热适应能力有关。提示通过分离热适应相关的差异表达基因研究热适应机制是一种可行的思路。     

用mRNA差异显示PCR技术筛查慢性砷中毒相关基因片段

目的：对慢性砷中毒组织的表达差异基因进行分析。方法：采用mRNA差异显示PCR技术(mRNA differential display PCR)，以慢性砷中毒病人具有皮损表现的手掌部皮肤组织为标本，正常人体手掌部皮肤组织为对照，提取组织mRNA，对砷中毒组织的表达差异基因进行分析，选择高表达和低表达的基因片段各一条进行了克隆和序列分析，经RNA印迹法确证，并在基因数据库中进行了同源性比较。结果：获得25条差异表达明显的cDNA片段，分别在砷中毒病人组织中呈高表达和低表达，已测序的两个序列均为未知基因序列。结论：慢性砷中毒病人病变皮肤组织与正常人体皮肤组织相比在mRNA水平有基因表达差异，差异表达的片段可能为砷中毒相关基因片段。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库的构建

目的构建高凝状态(prothrombotic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因反向清减cDNA文库．方法用高淀粉饲料喂养制备大鼠PTS模型,从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取poly A^ mRNA,分别以1．5 μg poly A^ mRNA起始,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成平均大小为400-600 bp的片段。以PTS大鼠cDNA作为Driver,对照大鼠cDNA为Tester。将Tester分为两组,分别连上不同的接头,与Driver进行两次消减杂交和两次抑制性PCR。将第二次PCR产物cDNA克隆至pMD18-T载体上,然后转化细菌,转化后的细菌接种于含50 μg／ml ampicillin、IPTG、和X-gal的LB琼脂平板上,将克隆计数。结果获得的克隆78％为白色克隆,成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库．结论以1．5 μg poly A^ mRNA起始,采用抑制性清减杂交,构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库。