高迁移率族蛋白B-1与炎症关系的研究进展

在脓毒症发生早期就采取相应的针对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-l)的抗炎治疗是十分困难的.而且这种治疗并未取得预期的良好治疗效果.     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标记的人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni2+-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍(第4轮与第1轮回收量分别为5.2×108、7.0×106 pfu),随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

Objective To construct prokaryotic expression vector of glutathione-S-transferase ( GST) -tagged human high mobility group box 1 protein (HMGB1) and to screen its high affinity binding fused-peptide by phage display technique. Methods Human HMGB1 cDNA gene was amplified by RT-PCR and cloned into vector pGEX4T-1 and then transformed into E. coli. After induction by isopropyl P-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), HMGB1 protein was purified with Ni2+-NTA chromatography and polymyxin B affinity column. Using purified HMGB1 , as target molecule , four rounds of biopanning to a phage display heptapeptides library were carried out. Out of the fourth round eluted product, twenty individual clones were randomly selected and identified by ELISA assay. The absorbance of these clones at 450 nm was determined with a microplate reader. Positive clones were expanded , purified and sequenced to characterize the motifs of fused heptapeptides. Results Recombinant expression plasmid pGEX4T-1-HMGB1 was constructed ( 65 000 by MW) and the purified proteins (648 bp by cDNA) were obtained. Four rounds of biopanning resulted in 74-fold enrichment of the phages (the recovery were 5.2×108、7.0×106 pfu in fourth and first round). Of the twenty phage clones randomly selected, nine were found to bind specifically with HMGB1 proteins. The deduced amino acid sequence analysis showed that six clones displayed a common amino acid sequence (DYFVSSV). Conclusions A heptapeptide is obtained that may bind specifically to HMGB1 protein with high affinity. It remains to be determined whether this heptapeptide may block the effect of HMGB1 or not.     

机械牵张诱导THP-1细胞高迁移率族蛋白B1移位出核

目的:探讨机械牵张对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1细胞内移位的影响。方法:构建HMGB1－增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA载体上,随后转染THP-1细胞并施加机械牵张应变,荧光显微镜观察HMGB1在细胞内的表达及移位情况。结果:重组质粒经酶切鉴定证明构建正确,并在THP-1细胞中大量表达。荧光显微镜观察发现,HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于细胞核,经机械牵张18h,可见细胞中融合蛋白从细胞核移位到细胞质,在细胞浆中观察到明显的绿色荧光。结论:成功构建了HMGB1-EGFP融合蛋白,在THP-1细胞中观察到机械牵张可诱导HMGB1移位出核。     

高迁移率族蛋白B1:从核蛋白到新的细胞因子

对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的认识曾长期局限于其调节基因转录的核蛋白功能。由于其作为细菌内毒素致死性的晚期介质这一重要功能不久前被发现,HMGB1新的生物学活性及其作用机制引起广泛兴趣和深入研究。HMGB1具有细胞因子的各种共同特性,包括其自分泌和旁分泌的特征、其受体依赖性以及它与其他炎症细胞因子相互诱生与协同作用的网络性。在感染性和非感染性的炎症、损伤和细胞坏死中,HMGB1介导了以巨噬细胞为主的固有免疫应答,发挥了至关重要的前炎症细胞因子和趋化因子的作用,同时还发现其对神经突触和肿瘤细胞的生长的促进作用。以HMGB1为靶子的治疗策略,包括对其产生和释放的抑制以及对其与受体（已知RAGE、TLR2和TLR4）结合的拮抗措施,在实验动物获得了可喜的成功并给临床应用带来了希望。     

高迁移率族蛋白B1在脂多糖致幼年大鼠脑损伤中的表达

目的 探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility gnmp box 1,HMGB1)在脂多糖(LPS)致幼年大鼠脑损伤中的表达变化.方法 SD大鼠随机分为对照组(NS组,n=80),颈外动脉注射生理盐水;脂多糖组(LPS组,n=80),颈外动脉注射LPS,于注射药物后6、12、24、48、72 h处死,甲酰胺法测脑组织伊文思蓝(EB)含量;免疫组织化学技术检测脑组织HMGBI、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达;RT-PCR技术检测HMGB1 mRNA的表达变化.结果 LPS组脑组织的EB含量、NSE、GFAP蛋白表达均为6 h开始增加,24 h达高峰;HMGB1蛋白及HMGB1 mRNA于6 h开始增加,24 h达高峰,与EB含量、NSE、GFAP蛋白含量呈正相关.各时间点与NS组比较,差异显著.结论 HMGB1可能作为晚期炎症因子参与LPS致脑损伤的发生发展过程.     

高迁移率族蛋白-1对增生性瘢痕成纤维细胞的调控作用

目的 探讨高迁移率族蛋白-1（HMGB1）对增生性瘢痕成纤维细胞（HSFbs）的调控作用.方法 增生性瘢痕组织取自中山大学附属第一医院烧伤科行瘢痕整复术的患者,组织块法培养HSFbs.通过细胞增殖、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、迁移和胶原网收缩实验检测不同浓度（0～200 ng/mL） HMGB1对HSFbs的影响.结果 1.56、3.13、6.25、12.50、25.00 ng/mL HMGB1呈剂量依赖方式刺激HSFbs的增殖,HMGB1对HSFbs Toll样受体4（TLR4）、α-滑肌肌动蛋白（α-SMA）、非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NMMⅡ）mRNA的表达有促进作用而对基质金属蛋白酶1-α （MMP1-α）无,HMGB1对HSFbs迁移及收缩有促进作用但可被TLR4阻断剂抑制.结论 HMGB1可能通过TLR4调控HSFbs而在增生性瘢痕的形成过程中起作用.     

下调人高迁移率族蛋白1对人前列腺癌细胞PC-3的影响

目的研究小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对PC-3侵袭和转移的影响。方法构建真核表达载体Pgenesil-1/HMGB1siRNA,转染PC-3细胞系,通过RT-PCR和Western blot检测HMGB1的mRNA及蛋白;通过细胞划痕、transwell和明胶酶谱分析检测PC-3体外侵袭能力。结果成功构建siRNA表达载体Pgene-sil-1/HMGB1siRNA,可使PC-3细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),并能有效抑制PC-3体外侵袭和转移活性(P<0.05)。结论应用siRNA技术能有效的抑制基因的表达,同时也能有效抑制PC-3细胞的体外侵袭和转移,为肿瘤的生物学治疗提供了新思路。     

脂多糖诱导血管内皮细胞凝血途径相关因子基因表达变化

目的：观察脂多糖(LPS)对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织因子(TF)、组织因子抑制物(TFPI)和凝血酶调节蛋白(TM)的影响。方法：应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行实验。同时应用CCK-8测定细胞在不同浓度的LPS(1-100mg/L)处理前后细胞活性;应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TM、TF和TFPImRNA水平。结果：浓度为10mg/L的LPS对细胞活力与对照组相比没有显著差异。浓度为10mg/L的LPS作用使HUVECs显著上调TFmRNA表达,6-24h可以使细胞TFPImRNA表达下调,以后渐恢复正常表达,72h达到正常对照组水平,同时下调TMmRNA表达。结论：LPS(10mg/L)对HUVECs的活性不造成直接的影响,可显著上调HUVECs的TFmRNA转录,抑制TFPImRNA的转录,而不改变TMmRNA的转录,这可能与LPS在感染过程中诱导血栓形成,血液凝固和DIC发生相关。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC低氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇（ZAL）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）低氧/复氧损伤的保护作用及其机制。方法:低氧(93%N2-5%CO2-2%O2)环境中培养HUVECs3h后再恢复正常氧供应1h。用MTT法检测细胞存活率,分光光度法测定细胞培养上清液中LDH、SOD活性及MDA含量。结果:HUVECs经低氧/复氧处理后,细胞存活率及SOD活性显著低于对照(P<0.01),LDH活性及MDA含量显著高于对照(P<0.01);经不同浓度(10-9-10-6mol/L)的ZAL或雌二醇（E2）预处理后,均可显著缓解上述改变,此作用为剂量依赖性,同浓度ZAL与E2的作用无显著差异。结论:ZAL对低氧/复氧损伤的HUVECs可产生与E2类似的保护作用,机制可能与促进自由基清除而减轻细胞氧化应激损伤有关。     

雷帕霉素抑制LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGB1的机制

目的：探讨雷帕霉素抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞表达和释放HMGB1的作用机制。方法:传代培养的小鼠RAW264.7细胞分5组接种于6孔板,即仅加培养液的对照组;加250μg/LLPS的诱导组;诱导组基础上加100μg/L雷帕霉素的干预组;干预组基础上加rTNF-α50μg/L的抗干预组;及抗干预组基础上加抗鼠TNF-α100μg/L的抗体中和组。培养4h后,ELISA法检测对照组、诱导组和干预组上清液中TNF-α水平;培养24h后,RT-PCR和Westernblotting法分别检测各组细胞内HMGB1mRNA表达水平和上清液中HMGB1含量。结果:培养4h,干预组上清液中TNF-α水平与对照组比无显著差异（P>0.05）,但明显低于诱导组（P0.05）。结论:雷帕霉素抑制LPS诱导RAW264.7细胞表达和释放HMGB1,可能部分地与其抑制TNF-α的表达有关。     

脂联素抗人脐静脉内皮细胞氧化损伤的作用研究

目的:研究脂联素（APN）对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)脂质过氧化的影响。方法：采用AnnexinV-FITC标记后流式细胞检测方法观测H2O2引起的细胞凋亡情况。用硫代巴比妥酸微量法测定丙二醛(MDA),黄嘌呤氧化酶法测总超氧化物歧化酶(SOD),可见光法测过氧化氢酶(CAT）。体外自由基捕捉实验检测APN对超氧阴离子和羟自由基的清除率。结果：APN能明显抑制H2O2引起的细胞凋亡。APN预处理HUVECs后,H2O2（200μmol/L,6h）所致的细胞膜脂质过氧化反应明显减弱,MDA产生减少,CAT和SOD活性增加,但仅以APN孵育HUVECs对SOD和CAT活性没有明显的影响。结论：结果表明APN对超氧阴离子和羟自由基有明显的清除效果。APN通过抗脂质过氧化发挥抑制细胞凋亡,保护血管内皮细胞抵抗损伤的作用。     

缺氧促进人脐静脉内皮细胞血红素氧合酶表达及［Ca2+］i变化

目的:　观察低氧培养诱导人脐静脉内皮细胞增殖和血红素氧合酶表达，以及对细胞内游离钙离子浓度［Ca²⁺］_i）的影响。方法:　采用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞技术检测人脐静脉内皮细胞增殖；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测缺氧与血红素氧合酶表达间的关系；钙荧光探针(Fura-2/AM)负载培养的人脐静脉内皮细胞, 观察常氧、低氧条件下［Ca²⁺］_i的变化。结果:　缺氧可促进脐静脉内皮细胞增殖和上调血红素氧合酶的表达，且与血红素氧合酶表达量间具有一定时间范围内的依赖性；同时促进［Ca²⁺］_i升高。结论:　缺氧促进人脐静脉内皮细胞增殖并上调血红素氧合酶的表达、细胞内游离钙离子水平升高，三者可能共同参与血管张力的调节。     

脑源性神经营养因子对细胞外蛋白水解酶激活作用的研究

目的：研究脑源性神经营养因子(BDNF)对细胞外蛋白水解酶表达和激活作用的影响。方法：体外分离并培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,RT-PCR法检测HUVEC基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达,明胶酶谱检测MMP-2和MMP-9蛋白酶活性,纤维蛋白酶谱检测尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）蛋白酶活性,Westernblotting检测uPA、纤溶酶原激活剂抑制剂（PAI）、TIMP-1及TIMP-2表达。结果：在对HUVEC增殖无明显促进作用的浓度范围内,BDNF可促进无血清培养的HUVECMMP-2和MMP-9mRNA表达,并可促进MMP-2和MMP-9酶原的激活产生活性明胶酶,BDNF对TIMP-1和TIMP-2的表达无明显影响。BDNF以浓度和时间依赖性方式上调HUVECuPA和PAI-1的表达,并可促进uPA的活性。结论：BDNF可激活MMPs和uPA/PAI相关的蛋白级联。     

睾酮双向影响脐静脉内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白1

雄激素与动脉硬化(arteriosc lerosis,AS)的关系日益受到关注,单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant prote in-1,MCP-1)是促进AS的重要炎症介质。本研究以人脐静脉内皮细胞(hum an umb ilical ve in endothelial cell,HUVEC)为对象,观察不同浓度睾酮对MCP-1蛋白表达的影     

腺苷促进人脐静脉内皮细胞bFGF的表达

目的：探讨腺苷对人脐静脉内皮细胞合成和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白及bFGFmRNA的影响。方法：免疫组化法检测bFGF蛋白质表达;逆转录-聚合酶链反应测定bFGFmRNA。结果：对照组（腺苷0mol/L）bFGF染色阳性细胞少,染色程度轻;10-4mol/L、10-6mol/L腺苷组作用48h后阳性细胞多,染色深,平均吸光度值与对照组比较有显著差异(P0.05);RT-PCR分析显示10-4mol/L、10-6mol/L腺苷组bFGFmRNA表达显著高于对照组(P0.05)。结论：腺苷可能部分通过促进内皮细胞合成和表达bFGF而实现其促进内皮细胞生长和血管新生的作用。     

克拉屈滨对人脐静脉内皮细胞活力和代谢的影响

目的:研究克拉屈滨对人脐静脉内皮细胞EA.hy926生长及分泌活性的影响,探讨克拉屈滨通过抑制内皮细胞活力发挥抗肿瘤的作用机制。方法:采用CCK-8法检测不同浓度(0.4~1μmol/L)克拉屈滨对内皮细胞活力的影响;用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;Western blot检测细胞凋亡和周期相关蛋白的表达水平;用ELISA法检测上清液肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平;Gries法检测上清液一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果:克拉屈滨作用48 h对细胞活力有明显的抑制作用,其半数抑制浓度约为3.644μmol/L,随药物浓度升高和作用时间的延长而抑制作用增强。克拉屈滨作用48 h后,细胞周期被明显阻滞在S期,0.4μmol/L时S期细胞约43.74%,1μmol/L时S期细胞约77.23%。克拉屈滨处理后,各组内皮细胞的凋亡率没有显著差异。克拉屈滨处理后,caspase-3与Bax蛋白水平无明显差异;p21水平随着药物浓度增加而增高,而p53水平随着药物浓度增加而降低(P0.05)。克拉屈滨处理后,上清液中TGF-β1和TNF-α水平升高,VEGF含量减少(P0.05)。克拉屈滨处理后,上清液中NO含量减少(P0.05)。结论:克拉屈滨能明显抑制内皮细胞EA.hy926的活力,其主要机制与细胞周期阻滞有关。同时克拉屈滨能促进内皮细胞EA.hy926分泌TNF-α和TGF-β1,抑制其分泌VEGF和NO。