快速构建腺病毒载体的新方法

目前腺病毒载体已成为重要的基因治疗载体,随着分子生物学技术的迅速发展,构建重组腺病毒的方法有了很大改进。本文主要介绍3种快速构建腺病毒载体的新方法：一是细菌内同源重组法构建重组腺病毒;二是细胞外连接法构建重组腺病毒,三是在黏粒中构建重组腺病毒。3种构建腺病毒载体的新方法相比于传统方法,具有简便,快速,实验周期短的优点。     

人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性

引言近年来,阻止肿瘤血管生成,控制肿瘤的生长和转移,成为肿瘤治疗的一项新策略[1,2],其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成,以内皮抑素最为理想[3]。本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体,研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达,为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。1材料与方法1.1材料携带人内皮抑素基因(humanendostatin,hE)的质粒pBlast hEndostatin购于美国InvitroGen公司;腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于MicrobixBiosystems公司;人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7、人脐静脉内皮细胞株ECV304购于美国ATCC细胞库;LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司;各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司;QIAprepspin miniprepkit、QIAampDNABloodMiniKit购自QIAGEN公司;M PERMammalianProteinEx tractionReagent购自PIERCE公司;Western显色液LumiGLOchemiluminescentreag...     

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究

目的：构建含胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因）重组腺病毒（AdE1CMVCD），并鉴定；用自杀基因治疗系统（AdE1CMVCD/5-FC）对肺癌进行抑瘤作用的实验研究。方法：体外实验：用不同稀释度的AdE1CMVCD)转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶（5-FC），用MTT法检测OD570nm值，按公式计算细胞生长抑制率；体内实验：建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型，瘤体内导入AdE1CMVCD，腹腔注射5-Fc，观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异。结果：该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加，最大抑制率达61.29％，同时观察到了明显的旁杀伤作用；在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用，明显延长荷瘤小鼠生存期。结论：本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用，为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。     

肿瘤端粒酶靶向腺病毒载体的表达活性

目的　构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体 ,研究其介导目的基因在肿瘤细胞内的定向表达能力。方法　将端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子克隆入质粒 pDC3 12的多克隆位点构成外源基因表达盒 ,在基因表达盒上下游分别插入 1个绝缘子序列 ,构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体pSG TPE ;采用Luciferase报告基因进行hTERT启动子的活性分析 ;以pSG TPE携带绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因 ,重组腺病毒AdTPE EGFP ,观察其介导EGFP在肿瘤细胞内的定向表达能力 ,并与CMV启动子控制的腺病毒AdCMV EGFP作对照。结果　hTERT启动子在正常细胞内几乎没有活性 ,而在肿瘤细胞内的活性与SV 40启动子相近。腺病毒AdTPE EGFP能介导EGFP在肿瘤细胞内定向而稳定表达 ,在正常细胞内不表达 ,而对照腺病毒AdCMV EGFP在肿瘤和正常细胞内均表达EGFP。结论　靶向端粒酶阳性肿瘤的腺病毒载体 pSG TPE ,不但提高了对基因表达调控的特异性 ,而且降低了对正常细胞毒性作用。绝缘子的应用隔断了外源基因表达盒和病毒基因表达调控序列之间的互相干扰 ,进一步提高目的基因的表达效率。该载体对肿瘤的靶向基因治疗具有重要的应用价值。     

hGM-CSF基因的克隆及重组腺病毒的构建

目的采用RT-PCR技术、基因重组技术及脂质体转染技术等克隆得到hGM-CSF基因并获得高滴度重组腺病毒.最终目的是为GM-CSF造血干细胞肿瘤基因治疗提供基础研究准备.方法应用RT-PCR技术从人脐带血淋巴细胞中克隆出hGM-CSF基因,再应用基因重组技术构建含hGM-CSF基因的重组腺病毒载体,进而通过反复转染293包装细胞得到高滴度重组腺病毒.结果克隆出hGM-CSF基因,经测序证实结果正确;得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA证实含目的基因.结论用LoxP/Cre体外重组法成功构建了hGM-CSF的复制缺陷型重组腺病毒.     

腹腔内注射IL-2重组腺病毒、IL-3重组腺病毒增强化疗药物抗白血病作用的研究

对实验性白血病小鼠模型大剂量化疗后,直接腹腔注射IL-2重组腺病毒(Ad-IL-2)和/或IL-3重组腺病毒(Ad-IL-3),发现腹腔注射对照腺病毒载体小鼠虽经大剂量化疗,仍有大量白血病细胞浸润至骨髓、血管、肝脏及脾脏。而腹腔注射Ad-IL-2或Ad-IL-3组小鼠肿瘤生长缓慢,注射Ad-IL-2组小鼠脾NK、CTL活性显著提高,注射Ad-IL-3组小鼠腹腔巨噬细胞数量及杀伤活性明显提高,联合应用Ad-IL-2,Ad-IL-3组小鼠抗白血病作用最为明显,骨髓中虽然仍见白血病细胞,但可见较多正常造血细胞,且肝、脾中未见白血病细胞浸润。表明腹腔内注射Ad-IL-2和Ad-IL-3可显著增强大剂量化疗对白血病的治疗效果。     

hTNF-α重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性及体内抗肿瘤研究

目的：研究携带hTNF-α基因的第二代重组腺病毒对人肺腺癌细胞系Ani973的体外生物学特性的影响，探讨重组腺病毒在体内抗肿瘤作用。方法：将携带有hTNF-α基因的重组腺病毒（rAd－hTNF-α）感染人肺腺癌细胞系，通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞TNF-α的分泌量；通过肿瘤局部注射rAd-LacZ，rAd－hTNF-α的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果：rAd－hTNF-α经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU/ml，在30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。24h细胞培养上清TNF-α的分泌量为20pg/ml细胞。体内实验表明注射rAd-LacZ，rAd－hTNF-α的小鼠肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组（P＜0．05），生存期显著延长。结论：腺病毒介导的细胞因子基因hTNF-α转染的Anip973肿瘤细胞未见明显变化，而体内实验则有明显的抗肿瘤作用。     

肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达

目的：克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法：采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。Western Blot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应（CPE）观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果：AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论：采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。     

重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定

目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度.方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列.将测序正确的片段用Bgl II和Pme I双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中.通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒.结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究.     

人IL-2基因克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的克隆人白细胞介素2基因（hIL-2），构建其重组穿梭载体pAdBM5-GFP—hIL-2。方法：应用PHA体外刺激培养的Jurkat细胞以促进hIL-2基因表达．设计特异性引物，应用RT—PCR法扩增hIL-2基因。将测序正确的片段用PmeⅠ和BglⅡ双酶切定向插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，酶切鉴定。结果：RT—PCR方法，成功克隆了hIL-2基因，并构建出pAdBM5-GFP-hIL-2真核表达载体．克隆的hIL-2序列全长528bp，含462个碱基开放读框．结论；构建含人白细胞介素2基因片段的重组腺病毒表达载体（pAdBM5-GFP—hIL-2），为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础．     

Modulation of human renal cell carcinoma 786-0 MMP-2 and MMP-9 activity by inhibitors and inducers in vitro

A hallmark of renal cell carcinoma (RCC) invasion is its ability to degrade ECM by local production of gelatinase enzymes. Although many studies on RCC have demonstrated the importance of MMPs, very little information is currently known regarding the effect of inducers and inhibitors. We therefore investigated the effect of inducers and inhibitors on RCC 786-0 in vitro. Human RCC 786-0 (ATCC) was grown in RPMI medium supplemented with 10% FBS, penicillin, and streptomycin in 24-well tissue plates. At near confuence, the cells were washed with PBS; the serum-free medium was incubated with various inducers: phorbol ester (PMA), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 1-beta (IL-β) and lipopolysaccharides (LPS). Cells were also incubated with inhibitors: EGCG, doxycycline, and a nutrient mixture with and without PMA; retinoic acid, dexamethasone, H-7; actinomcin D, or cyclohexamide. After 24 h, the medium was removed and analyzed for MMP-2 and MMP-9 by gelatinase zymography. RCC 786-0 secreted two bands, a major band corresponding to MMP-2 and a faint band corresponding to MMP-9. PMA and TNF-α, with increased concentration, increased MMP-9 secretion, while IL-1β and LPS did not significantly modify MMP-9 activity. MMP-2 secretion was not affected by any of the inducers. All the inhibitors tested without and with PMA showed a dose-dependent decrease in both MMP-2 and-9 expression. Further studies are in progress to confirm the role of MMP-9 on Matrigel invasion using PMA, cytokines, and LPS.     

肿瘤和间质细胞相互作用对肺癌MMP-2和MMP-9表达的影响

 目的 研究三维立体培养中肺癌H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞相互作用对MMP-2、MMP-9 表达的影响。 方法 活性胶原三维立体培养分为：H460细胞和胚肺成纤维细胞共同培养组;H460细胞和单核细胞共同培养组;胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养组;H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养组4组。明胶酶谱法测定各组培养基中MMP-2、MMP-9活性。 结果 H460细胞和胚肺成纤维细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养时MMP-2酶原和活化酶活性和表达均增强,H460细胞和单核细胞共同培养时MMP-2酶原和MMP-9活性和表达增强,H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养MMP-2活化酶和MMP-9活性和表达明显增强。 结论 肺癌H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞相互作用能通过上调MMP-2、MMP-9的表达促进肺癌的侵袭和转移。     

MMP-2、MMP-9和Ⅳ型胶原在乳腺癌中的表达及其意义

目的：检测基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）与乳腺癌的淋巴结转移、病理分级、患者年龄及肿瘤大小之间的可能关系，初步估计患者预后。方法：58例乳腺癌蜡块，采用免疫组化SP法染色，以细胞浆中有棕色颗粒计数分为：阴性；弱阳性；中度阳性及强阳性。结果：MMP-2和MMP-9的表达与乳腺癌患者的年龄及肿瘤大小无关；MMP-2与淋巴结转移有关，有淋巴结转移者，MMP-2表达较高，无淋巴结转移者，MMP-2表达较低；而MMP-9的表达与淋巴结转移情况则无关；MMP-2和MMP-9的表达与病理分级有关，病理分级越高，MMP-2及MMP-9表达越高，所有乳腺癌患者中Ⅳ型胶原的表达均为阴性。结论：MMP-2和MMP-9的表达与乳腺癌病理学分级有关；MMP-2与淋巴结转移有关，而MMP-9与淋巴结转移无关。     

MMP-2、MMP-9在乳腺癌中的表达及其意义

目的 检测基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)与乳腺癌的淋巴结转移、病理分级、患者年龄及肿瘤大小之间的可能关系,及对术后的影响.方法 65例乳腺癌蜡块,采用免疫组化S-P法染色,以细胞浆中有棕色颗粒计数分为:阴性;弱阳性;中度阳性及强阳性.结合随访材料进行统计分析.结果 MMP-2和 MMP-9的表达与乳腺癌患者的年龄及肿瘤大小无关;MMP-2与淋巴结转移有关,无淋巴结转移者,MMP-2表达较低;有淋巴结转移者,MMP-2表达较高.MMP-9的表达与淋巴结转移情况则无关.MMP-2和MMP-9的表达与病理分级相关.二者均影响预后,MMP-2低表达组术后10年生存率为100%,MMP-2高表达组术后1、3、5及10年生存率分别为100%、86.11%、75.0%、66.67%,两组间有显著性差异(P《0.01);MMP-9低表达组术后10年生存率为100%,MMP-9高表达组术后1、3、5及10年生存率分别为100%、86.49%、72.97%、64.86%,两组间有显著性差异(P《0.01).结论 MMP-2和MMP-9的表达与乳腺癌病理学分级有关;MMP-2与淋巴结转移有关,而MMP-9与淋巴结转移无关.二者高表达生存率均降低,影响预后.     

MMP-2、MMP-14在乳腺癌中的表达及临床意义

目的 探讨基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-14（MMP-14）在乳腺良性病变、乳腺癌中的表达及其与肿瘤大小、分化程度、腋窝淋巴结转移的关系.方法 应用免疫组织化学PV二步法检测68例乳腺癌组织和24例乳腺良性病变组织中MMP-2和MMP-14蛋白表达情况,并分析其与临床病理参数的关系.结果 MMP-2和MMP-14在乳腺癌中阳性表达率分别为55.9%（38/68）、58.8%（40/68）,在乳腺良性病变中的阳性表达率分别为25.0%（6/24）、16.7%（4/24）,差异均有统计学意义（P＜0.05）;MMP-2和MMP-14的表达与肿瘤大小和腋窝淋巴结转移呈正相关.结论 MMP-2 和MMP-14的表达与肿瘤大小、乳腺癌淋巴结转移有关,可作为评估乳腺癌浸润和转移的生物学指标.     

TACE对肝癌组织中MMP-2和MMP-9表达及其预后的影响

目的 探讨TACE对肝癌MMP-2、MMP-9的表达及预后的影响.方法 选取肝癌患者80例,随机分为两组,分别为术前TACE组、直接手术组.采用酶联免疫吸附法检测两组患者术前静脉血中MMP-2、MMP-9的水平;采用免疫组织化学法检测两组患者术中所取肝癌及癌旁组织中MMP-2、MMP-9的表达;比较两组患者术后1、2、3年的生存情况,并分析其影响因素.结果 直接手术组患者血液中MMP-2、MMP-9水平明显高于术前TACE组患者,差异有统计学意义(P<0.05);两组肝癌组织中MMP-2、MMP-9表达阳性率均较癌旁组织高,且直接手术组肝癌组织中MMP-2、MMP-9的阳性率明显高于术前TACE组,差异有统计学意义(P<0.05);术前TACE组1、2、3年生存率及中位生存期明显优于直接手术组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);Child-Pugh分级、MMP-2、MMP-9表达、门静脉癌栓、行TACE术均是影响患者生存期的因素(P<0.05);与患者性别、年龄、AFP、肿瘤大小、肿瘤数目无关(P>0.05).结论 TACE术能够降低肝癌患者血液及组织中MMP-2、MMP-9的表达,延长患者术后生存期,且患者生存期的长短受Child-Pugh分级、MMP-2、MMP-9的表达、出现门静脉癌栓以及行TACE术的影响,MMP-2、MMP-9可能成为评价肝癌治疗效果及预后的新的指标.     

侵袭性垂体腺瘤中Fascin蛋白、MMP-2和MMP-9的表达与研究

目的：垂体腺瘤侵袭性生长的机制还不清楚。本研究旨在检测肌动蛋白结合蛋白（Fascin）及基质金属蛋白酶-2（matrixmetallopmteinasesMMP-2）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinasesMMP-9）在侵袭性垂体腺瘤中的表达水平,分析其与垂体腺瘤的生长侵袭性之间的可能关系。方法：免疫组织化学SP法检测三者在72例垂体腺瘤（侵袭性27例,非侵袭性45例）中的表达水平,统计学分析三者在垂体腺瘤中表达差异性．及与不同临床特征的表达相关性。结果：Fascin蛋白、MMP-2及MMP-9在侵袭性垂体腺瘤的表达水平高于非侵袭性垂体腺瘤（t=3．03,t=3．33,t=2．02,P〈0．05）。三者在垂体腺瘤中表达水平与患者性别无明显相关．与肿瘤有无分泌功能无明显相关,但与肿瘤大小有关铲值分别为8．53,11-31,12．46,P〈0．05）。结论：Fascin蛋白、MMP-2及MMP-9在侵袭性垂体腺瘤中高表达,提示三者可能与垂体腺瘤侵袭性生长密切相关．     

结肠癌组织MMP-2和MMP-9及VEGF表达临床意义的研究

目的:探讨结肠癌组织中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达及其与肿瘤进展的关系。方法:采用免疫组化SP法检测60例结肠癌组织中MMP-2、MMP-9和VEGF表达情况,并以25例正常结肠组织作为对照。结果:结肠癌组织中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达率分别为81.6%、78.3%和90.0%,高于正常结肠组织中的表达,两组比较差异有统计学意义,P<0.05。结肠癌组织中MMP-2、MMP-9和VEGF阳性表达与TNM分期和淋巴结转移相关,差异有统计学意义,P<0.05。结论:MMP-2、MMP-9和VEGF在结肠癌的发生发展和浸润转移中起到了重要的作用,可作为反映结肠癌进展的生物学指标。