AAV-hVEGF165及AAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞的实验研究

目的探讨应用hVEGF165与TGFβ1基因逆转椎间盘退变的可行性。方法用分子克隆技术，从pcDNA3（＋）-AAV-hVEGF165获得AAV-hVEGF165cDNA，并克隆至AAV包装质粒pSNAV上，构建成pSNAV-hVEGF165的AAV重组质粒。经酶切及测序鉴定后，用脂质体介导pSNAV-hVEG165转染HEK293细胞和血管内皮细胞。荧光免疫组化方法检测hVEGF165蛋白，并用MTT法测定hVEGF165对血管内皮细胞增殖的影响。由本元正阳公司对pSNAV-hVEGF165进行AAV-hVEGF165包装。AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1联合转染退变的椎间盘纤维环细胞，Western blot检测hVEGF165与TGFβ1的表达以及纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量的变化。结果经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-hVEGF165构建完成，荧光免疫组化显示hVEGF165蛋白表达，MTT法显示hVEGF165蛋白对血管内皮细胞增殖有促进作用。本元正阳公司包装出具有生物学功能的AAV-hVEGF165与AAV-hVEGF165构建成功。Western blot显示hVEGF165与TGFβ1在纤维环细胞中表达，AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1双基因联合转染的纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量较hVEGF165与TGFβ1基因各自单独转染的细胞Ⅰ型胶原表达量明显增多。结论hVEGF165在体外能够协同TGFβ1促进退变纤维环细胞Ⅰ型胶原表达增加。     

腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子对体外转染恒河猴和人腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原影响的比较

目的比较腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）对体外培养的恒河猴和人腰椎间盘细胞转染后蛋白多糖含量和Ⅱ型胶原的影响。方法将恒河猴及成人腰椎间盘髓核细胞进行体外培养,应用rAAV2-CTGF体外转染细胞,分别通过^35S标记蛋白多糖的方法和Ⅱ型胶原的SP-ABC免疫组化法检测腺相关病毒载体介导生长因子对椎间盘细胞蛋白多糖合成和Ⅱ型胶原的影响。结果恒河猴椎间盘细胞能进行体外培养并传代,其形态学特性与培养的成人椎间盘细胞相似,rAAV2-CTGF与对照组相比可促进恒河猴和人椎间盘髓核细胞的蛋白多糖生物合成（P〈0．01）,恒河猴和成人相比生长因子对于蛋白多糖的促进作用无明显差异（P〉0．05）。结论成功培养恒河猴及成人椎间盘细胞,腺相关病毒载体介导CTGF能显著促进髓核细胞蛋白多糖的合成,生长因子对恒河猴和人椎间盘细胞蛋白多糖含量的影响具有很大的相似性。     

兔退变椎间盘体内转染hTGF-β1、β3的生物学效应

目的 应用重组腺相关病毒2(recombinant adeno-associated virus,rAAV2)介导人转化生长因子β1(human transforming growth factor-β1,hTGF-β1)和β3(hTGF-β3)单基因或双基因联合体内转染退变兔髓核细胞,观察基因产物的表达及其对基质成分...     

AAV2-hVEGF165与AAV2-hTGFβ1对退变兔椎间盘纤维环细胞的生物学效应

目的采用基因治疗方法,把AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1共转染兔纤维环细胞,观察其生物学活性,并进一步评价人血管内皮生长因子165（hVEGF165）和人转化生长因子β1（hTGFβ1）逆转椎间盘退变的可行性。方法分离并培养兔椎间盘纤维环细胞,以腺相关病毒（AAV2）为载体,分别携带hVEGF165和hTGFβ1eDNA,转染兔纤维环细胞。用Westernblotting检测hVEGF165和hTGFβ1的表达,并用同样的方法检测纤维环细胞中Ⅰ型胶原的表达。结果AAV2能够感染兔椎间盘细胞。用Westernblotting可以检测到AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1在退变椎间盘细胞中的表达,并且,两种因子联合转染纤维环细胞时Ⅰ型胶原的表达要比分别转染是显著增高。结论hVEGF165和hTGFβ1共同转染培养的兔退变纤维环细胞,Ⅰ型胶原的表达显著增高。     

转化生长因子β对椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因表达的调节作用

目的 探讨转化生长因子β（ＴＧＦ－β）对椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因表达的调节作用。方法 应用原位杂交技术检测ＴＧＦ－β１对人胚椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞、髓核细胞中Ⅱ型胶原ｍＲＮＡ的调节作用,其中ＴＧＦ－β１浓度分别为０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ和１０ｎｇ／ｍｌ;采用ＶＩＤＡＳ软件计算杂交涂片中细胞的平均光密度值,进行胶原ｍＲＮＡ相对定量。结果 （１）原代培养的椎间盘纤维环细胞,ＴＧＦ－β１浓     

转化生长因子β对椎间细胞Ⅰ,Ⅲ型胶原基因表达的调节作用

探讨转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ,ＴＧＦ－β）对椎间盘Ⅰ,Ⅲ型胶原基因表达的调节作用。方法应用斑点杂交和原位杂交技术检测了ＴＧＦ－β１对椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞,髓核细胞中Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ的调节作用,采用ＶＩＤＡＳ软件计算杂交膜斑点及发校涂片中细胞的平均光密度值,进行胶原ｍＲＮＡ相对定量。结果（１）对于原代培养的椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原ｍＲＮＡdisp     

腺相关病毒载体介导的TIMP1对人退变腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖的影响

目的:探讨腺相关病毒(Adeno-associated virus;AAV)载体介导的基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1;TIMP1)对人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学效应.方法:单层培养并鉴定人退变腰椎间盘髓核细胞.采用绿色荧光蛋白标记的腺相关病毒(rAAV2-EGFP)检测其对髓核细胞的转染效率.应用构建的rAAV2-TIMP1转染髓核细胞;通过细胞形态学观察、35S标记氨基酸整合法检测rAAV2-TIMP1对人退变腰椎问盘髓核细胞基质合成的影响.在35S检测中;以未转染的退变髓核细胞做为正常对照组.结果:光镜下观察所培养的细胞类型以成纤维样细胞为主;Ⅱ型胶原免疫组化和番红O染色鉴定培养细胞为髓核细胞.AAV转染人退变腰椎间盘髓核细胞的转染效率为12%.35S标记整合法检测rAAV2-TIMP1转染组每分钟计数值为341.43±42.85;正常对照组为224.20±29.26;两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:TIMP1能够促进退变椎间盘髓核细胞蛋白多糖的合成.     

转化生长因子β与椎间盘细胞Ⅰ型胶原基因调控的关系

目的：探讨ＴＧＦ－β在椎间盘Ⅰ型胶原代谢中的作用及作用机制。方法：应用斑点杂交和原位杂交技术检测了ＴＧＦ－β对椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞、髓核细胞中Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ,ＴＧＦ－β１浓度为１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｍ／ｍｌ,其作用分别是０ｎｇ／ｍｌ组的１．１８倍及１．３７倍;对于传代培养４ 纤维环细胞,其调节作用分别是０ｎｇ／ｍｌ组的１．４８倍及２．０３倍。结论：ＴＧＦ－β可以按照剂量依赖方式正向     

退变腰椎间盘细胞经体外转基因培养生物学活性的实验研究

目的构建转化生长因子（transforming growth factor,TGF-β3的真核表达载体pEGFP-TGF-β3转染椎间盘髓核细胞,研究转基因TGF-β3对退变髓核细胞生物学特性的影响。方法通过手术方法制作椎间盘突变模型,从而获取原代退变椎间盘髓核细胞,通过脂质体将真核载体pEGFP-TGF-β3导入髓核细胞,然后对细胞的形态和增殖活性（MTT法）进行观察,应用Westen Blot检测TGF-β3在髓核细胞的表达含量,应用免疫细胞化学方法检测转染后髓核细胞的Ⅱ型胶原的表达。结果髓核细胞转染后,细胞活性增强,TGF-β3表达增加,并随着时间的延长而增加。Ⅱ型胶原表达增加。结论TGF-β3转染退变髓核细胞可起到维持髓核细胞表型,并在细胞传代后仍发挥调节作用。TGF-β3确实具有促进髓核细胞增殖和Ⅱ型胶原合成的能力,从而有可能延缓甚至逆转椎间盘退变。     

TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达

目的：对TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Collagen Ⅰ、ⅡmRNA及碱性磷酸酶(ALP)的表达进行研究。方法：BALB／c小鼠110只随机分2组，每组55只。rhBMP-2／TGF-β为实验组，rhBMP-2为对照组，于术后3～21d 8个时间点取材，用原位杂交方法对新生骨组织中的Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA进行检测；对ALP活性进行定量分析，观察2组在诱导成骨中CollageⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达情况。结果：(1)Ⅱ型胶原mRNA的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随的；(2)做为成骨细胞成熟标志物的I型胶原mRNA、ALP在软骨形成期即有表达，随着成骨细胞的出现，骨组织的形成Ⅰ型胶原mRNA仍表现为高表达，而ALP的表达则呈下降趋势；(3)实验组CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达早于对照组。结论：TGF-β增强了rhBMP-2诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达。     

腺病毒介导人胰岛素样生长因子1基因转染退变椎间盘的实验研究

退变性椎间盘病是下腰痛最为常见的病因，其发生与椎间盘退变密切相关。椎间盘退变时活细胞数量减少，蛋白多糖和水的含量减低，胶原的排列和类型发生改变，Ⅱ型胶原减少而Ⅰ型胶原增多。如果能调节椎间盘细胞的生物学特性，促进退变椎间盘的细胞分裂增殖，再生蛋白多糖和胶原，恢复水分含量，就有可能阻止退变发展。     

腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白-2体内转染兔退变椎间盘的实验研究

目的 观察腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白-2(AAV-BMP-2)基因对兔退变腰椎间盘的治疗作用.方法 将36只新西兰大白兔L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎间盘针刺制造退变模型后随机分为3组,其中12只注射AAV-BMP-2作为实验组,12只注射AAV作为实验对照组,12只注射生理盐水作为空白对照组.注射后的2、4、8周各组随机抽取4只兔行腰椎MRI扫描,扫描后将其处死,取L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎问盘髓核组织,用间苯三酚分光光度法检测髓核组织中的蛋白多糖含量.结果 在MRI影像学Thompson分级评估中,实验组各时间点椎间盘MRI信号比较,差异无统计学意义.实验对照组和空白对照组各时间点MRI信号比较,差异有统计学意义.实验组和实验对照组、实验组和空白对照组各时间点MRI髓核信号比较,差异有统计学意义;实验对照组和空白对照组比较,差异无统计学意义.在蛋白多糖含量测定中,实验组蛋白多糖含量在各时间点均高于实验对照组和空白对照组,实验对照组和空白对照组蛋白多糖均随时间的变化逐渐减少,各时间点两组比较无明显区别.结论 AAV-BMP-2对兔退变的腰椎间盘有治疗作用.     

转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1对体外培养人退变髓核细胞生物学活性的影响

目的：观察在体外培养条件下转化生长因子β1（TGF-β1）和胰岛素样生长因子1（IGF—1）对人退变髓核细胞生物学活性的影响。方法：体外培养人退变髓核细胞，台盼蓝染色法测定活细胞率。将每份髓核细胞样本分为对照组、TGF-β1组和TGF-β1＋IGF—1组。采用考马斯亮蓝法测定TGF—β1和IGF—1干预后第0、2、4、6天细胞内总蛋白含量。采用免疫组织化学和免疫荧光化学染色方法测定细胞在TGF-β1和IGF-1干预后0～6d合成Ⅱ型胶原的情况。结果：体外培养人退变髓核细胞的活细胞率为90％～95％。干预后第4、6天TGF-β1组和TGF-β1＋IGF—1组与对照组比较、TGF-β1＋IGF—1组与TGF-β1组比较细胞内总蛋白含量均显著增加（P〈0.05），TGF—β1＋IGF—1组Ⅱ型胶原的合成较对照组显著增加（P〈0．05）；干预后第6天TGF—β1组和TGF-β1＋IGF—1组与对照组比较、TGF-β1＋IGF—1组与TGF-β1组比较Ⅱ型胶原均显著增加（P〈0.05）。结论：一定浓度的TGF-β1能够促进人退变髓核细胞合成Ⅱ型胶原，改善其生物学活性，合用TGF-β1和IGF—1上述作用更加明显。     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔腰椎间盘髓核细胞对蛋白多糖含量的影响

目的观察构建腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(humantransforminggrowthfac-tor,hTGF-β1)基因(Ad/CMV-hTGF-β1)转染到兔椎间盘髓核细胞后,髓核组织中蛋白多糖含量的变化。方法(1)纯种成年新西兰大白兔35只,其中25只对腰椎间盘髓核组织注射Ad/CMV-hTGF-β1,每只注射2个椎间盘作为实验组,注射量为每个腰椎间盘20μl(6×106pfu);同时每只取2个未做注射的腰椎间盘作为自身空白对照组。其余10只兔每只注射2个腰椎间盘各20μl磷酸盐缓冲液(PBS)作为实验对照组。全组共120个椎间盘。(2)手术后1～12周的不同时间段分别取出各组椎间盘组织,采用间苯三酚分光光度法测定髓核组织中蛋白多糖的含量,所得数据经SPSS10.0统计学软件进行统计学处理。结果(1)术后1周,实验组与自身空白对照组蛋白多糖测定值经配对t检验,t=3.968,P<0.05。(2)术后2周,三组结果经方差分析显示,F=17.871,P<0.01;各组间再行两两q检验,实验组与自身空白对照组间q=7.686,P<0.01;实验组与实验对照组间q=6.894,P<0.01;实验对照组与自身空白对照组间q=0.792, P>0.05。实验组与自身空白对照组间配对t检验,t=5.276,P<0.01。(3)术后4周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,t=8.352,P<0.01。(4)术后8周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,t=7.086,     

腺相关病毒介导hBMP-2体内转染对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的:了解腺相关病毒介导骨形态发生蛋白-2(adeo-associated virus mediated human bone morpho-genetic protein-2,AAV-hBMP-2)基因体内转染兔退变椎间盘后对髓核细胞Fas与Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法:36只普通级新西兰大白兔,采用针刺兔椎间盘的方法制作L2/3、L3/4、L4/5椎间盘退变模型。造模4周后,在MRI影像学中,髄核的信号比正常减弱,证明造模成功,再随机分为注射20μlAAV-hBMP-2组(6×106pfu,A组)、AAV组(6×106pfu,B组)和生理盐水组(C组),分别于注射2周、4周及8周后对椎间盘进行MRI检查,然后取材,石蜡包埋,组织切片应用SP免疫组织化学法和TUNEL法分别观察Fas与Caspase-3蛋白表达及髓核细胞凋亡情况,IPP6.0图像分析系统测定各指标的平均光密度。结果:注射后2周、4周及8周时A组MRI髓核信号结果与B组、C组比较有统计学意义(P0.05)。各组Fas,Caspase-3及TUNEL染色结果随着时间推移逐渐增强,A组Fas、Caspase-3及TUNEL的平均光密度明显低于B组和C组(P0.01),B组与C组间比较无显著性差异(P0.05)。结论:体内转染AAV-hBMP-2能抑制兔腰椎间盘髓核细胞凋亡。     

Ad-hBMP-2转染体外培养人退变腰椎间盘细胞的研究

[目的]研究人骨形态发牛蛋白-2腺病毒表达载体（Ad—hBMP-2）转染体外培养人退变腰椎问盘细胞，分析其对腰椎间盘细胞影响.[方法]成人退变腰椎间盘细胞体外培养，通过免疫组化和染色体分析鉴定椎间盘细胞。利用免疫荧光和蛋白印迹法检测不同转染剂量对细胞BMP-2表达的影响。[结果]体外培养成人退变腰椎间盘细胞第2代鉴定具有其结构功能。转染后通过免疫荧光和蛋白印迹法可见随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。[结论]Ad—hBMP-2可高效转染体外培养人退变椎间盘细胞，同时随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。     

腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.     

hTGFβ_1基因转染对NIH3T3成纤维细胞增殖的影响

目的　探讨在体外培养条件下转化生长基因 β1(hTGFβ1)转染对成纤维细胞生物学功能的影响。　方法　用脂质体介导共转染法将hTGFβ1质粒DNA转染至NIH 3T3成纤维细胞中 ,并设NIH 3T3转染空载体组和NIH 3T3对照组 ,用细胞生长计数、四唑氮蓝流式细胞法 (MTT)和软琼脂集落形成试验分别进行检测。　结果　 (1)转染hTGFβ1后 ,成纤维细胞的生长速度下降 ,以 4～ 6d尤为显著。DNA合成下降 ,G1比例增高 (从 39.9%升至 6 6 .2 % ,P <0 .0 5 ) ;(2 )转染空载体组与对照组的各细胞周期未见明显的变化 ;(3)MTT法与细胞计数法间有良好的相关性 (相关系数达 0 .992 ) ;(4 )转染hTGFβ1后 ,成纤维细胞的软琼脂克隆形成率明显下降 (从 1.18%降至 0 .5 5 % ,P <0 .0 5 )。　结论　hTGFβ1基因转染可抑制成纤维细胞的增殖。原因可能是TGFβ1阻碍了成纤维细胞的DNA合成 ,即G1期与S期之间发生了阻碍     

转化生长因子-β诱导活化蛋白-1活化及促进NIH3T3细胞α2Ⅰ型胶原表达的研究

目的 研究活化蛋白-1(AP-1)在转化生长因子-β(TGF-β)促进Ⅰ型胶原基因表达中的作用，探讨病理性瘢痕的形成机制。方法 用5μg/LTGF—β刺激鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞,分别采用凝胶迁移变动分析(EMSA)和逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)技术研究TGF—β对AP-1的活化及其对α2Ⅰ型胶原mRNA水平的影响。结果 5μg／LTGF—β刺激NIH3T3细胞，0．5h即可检测到AP-1被活化，随时间推移AP-1的活性逐渐增强，6h达到峰值，而后活性逐渐减弱，24h仍然可检测到AP-1的活性。用TGF-8刺激NIH3T3细胞，24h后提取总RNA，经RT—PCR分析。与对照组相比α2Ⅰ型胶原mRNA水平明显增高。结论 TGF—β刺激NIH3T3细胞，可激活AP-1并可以上调α2Ⅰ型胶原的表达。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子 -βⅠ、Ⅱ型受体的表达及调控

目的：了解瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)－βⅠ、Ⅱ型受体的表达及TGF－β1,β3对其的影响。方法；体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFB）和正常皮肤成纤维细胞（NFB），利用免疫组化及计算机图像分析系统测定TGF-βⅠ、Ⅱ型受体含量。结果：KFB胞浆内阳性信号明显强于NFB（P＜0．05）；经TGF－β1,β3处理组胞浆内阳性信号差别均不明显（P＞0．05）。结论：KFB存在高表达的TGF－βⅠ、Ⅱ型受体；TGF－β1,β3均能促进KFB TGF－βⅠ、Ⅱ型受体的表达。