JC病毒Agnoprotein在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的 构建JC病毒Agnoprotein基因的原核表达载体,表达纯化该蛋白.方法 PCR扩增患者脑脊液中JC病毒晚期调节蛋白Agnoprotein基因,测序正确后克隆入pET-32a(+)原核表达载体,诱导表达Agnoprotein蛋白并纯化.结果 pET-32a(+)-Agnoprotein表达出预期分子量大小的具有免疫活性的重组融合蛋白.结论 成功地表达纯化了Agnoprotein融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定了基础.     

轮状病毒外壳蛋白VP4在大肠埃希菌中的表达

目的 克隆表达轮状病毒融合素蛋白VP4.方法 以轮状病毒SA11株细胞培养物提取总RNA为模板,经RT-PCR获得VP4全长基因片段cDNA,将其重组于pET-30a(+)表达载体,转化大肠埃希菌BL21(plysS),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并用镍柱纯化.结果 重组载体所含目的基因片段的序列与文献公布序列相符,IPTG诱导表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在;SDS-PAGE检测表达产物与目的蛋白大小一致,为88 kD,Western blot检测发现目的蛋白所带组氨酸标签可与标签抗体反应;镍柱纯化获得RV SA11 VP4融合素蛋白,纯度达90%.结论 构建了表达载体pET-30a(+)-VP4,经诱导表达、纯化,获得了RV融合素蛋白VP4.     

一种肝脏持续表达丙型肝炎病毒核心蛋白的小动物模型

目的　建立肝脏持续表达丙型肝炎病毒核心 (HCVcore)蛋白的大鼠模型 ,为进一步研究HCV核心蛋白的功能和体内致病机制提供帮助。方法　应用聚合酶链反应法扩增出HCV Core区cDNA ,以重组腺伴随病毒载体介导的病毒重组技术制备含HCVCore的重组腺伴随病毒。重组病毒感染 2 0只雄性SD大鼠肝脏 ,感染后 1个月及 4个月行Southernblot印迹杂交法和Dotblot杂交法检测鼠肝内HCVCore区基因整合、mRNA形成情况。结果　测序证实成功克隆出HCVCorecDNA ,重组腺伴随病毒滴度为 2 .41× 10 11/ml。感染后 1个月及 4个月检测 ,实验大鼠肝脏Southernblot杂交结果均为阳性 ,HCVCore区基因非定点整合 ;肝细胞mRNA的Dotblot杂交结果均为阳性 ,提示正确表达HCVCoremRNA。结论　成功制备出一种肝脏持续表达HCVcore蛋白的大鼠模型。     

肝癌相关蛋白FAM172A2的克隆表达及多克隆抗体制备

目的 构建肝癌相关蛋白FAM172A2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗FAM172A2蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以HepG2细胞总RNA为模板,扩增FAM172A2目的基因片段1113bp,构建原核表达载体,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.诱导其大量表达后纯化、复性并制备多克隆抗体,Western blot及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性及其效价.结果 扩增获得FAM172A2基因片段,成功诱导FAM172A2融合蛋白表达并制备其多克隆抗体.ELISA检测证实其效价＞1∶160000,且特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21( DE3)能够成功表达FAM172A2蛋白,获得高特异性、高效价兔抗FAM172A2蛋白的多克隆抗体.     

结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10及rCFP10-ESAT6融合基因在大肠埃希菌中的表达及比较

目的 构建结核早期分泌抗原靶分子(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)及重组CFP10-ESAT6(rCFP10-ESAT6)融合蛋白的原核表达载体,获得纯化蛋白并比较三者表达特点.方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增ESAT-6、CFP-10基因片段,融合PCR技术扩增rCFP10-ESAT6片段,分别连接到pGEM-T载体,测序正确后插入原核表达载体pET-32a(+)或 pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化3种蛋白;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot分析验证目的蛋白的抗原特异性.结果 pET-32a(+)-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达,分子量为31 kD,目的蛋白约占菌体总蛋白的42%;pET-32a(+)-CFP10、pET-28a(+)-CFP10-ESAT6重组蛋白以可溶性形式表达,分子量分别为33 kD和28 kD,目的蛋白分别占菌体总蛋白的73%和48%;Western blot证实其均具有良好的抗原性.亲和层析法获得了纯度较高的重组蛋白.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)成功表达了具有良好抗原性的ESAT-6、CFP-10融合蛋白及rCFP10-ESAT6重组蛋白,为深入研究其免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白诱导人胆管上皮细胞转化及成瘤实验

目的　探讨丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCV -C)对人胆管上皮细胞 (BEC)的转化及致癌作用。方法　通过脂质体介导将含有HCV- C基因重组真核表达载体pcDNAHCV- C导入BEC细胞,G418筛选表达目的基因的细胞;聚合酶链反应 (PCR)及免疫组织化学SABC法检测细胞中HCV -C基因及蛋白的表达;细胞计数、锚着非依赖性生长实验、成瘤性检测等鉴定其生物学行为变化,免疫组织化学SABC法检测所致肿瘤组织中HCV- C蛋白表达。结果　HCV -C转染的BEC细胞中HCV- C蛋白表达于胞质,质粒pcDNAHCV C转染细胞的倍增时间较pcDNA3转染细胞和未转染BEC细胞明显缩短(分别为 14h, 28h, 30h)。pcDNAHCV C和pcDNA3转染细胞及未转染BEC在软琼脂中的克隆形成率分别为 36. 0%、2 .5%和 1 5% (P<0. 01)。3种细胞接种裸鼠后,pcDNAHCV C转染细胞注射组出现肿瘤,病理学检查证实为胆管细胞癌,肿瘤组织有HCV- C蛋白的表达。而pcDNA3转染细胞及未转染BEC细胞注射组在注射 36d后仍未见肿瘤发生。结论　HCV- C蛋白具有促胆管细胞转化和促进肿瘤发生的作用。     

人瘦素蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的构建人瘦素因子（Leptin）的原核表达质粒pGEX-4T-3-LEP，并诱导该基因在原核细胞中大量表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和DNA重组技术，从人皮肤成纤维细胞内将编码人Leptin的cDNA序列克隆至原核表达载体pGEX-4T-3上，选取阳性克隆扩增后，提取DNA进行酶切鉴定和测序。同时应用SDS-PAGE和蛋白质印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定。结果克隆出的Leptin基因的cDNA由469bp组成，包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分，含有Letinp基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3在DH5a细菌体内能够表达，并且随着诱导时间的延长，Leptin基因的表达量增加，重组Leptin蛋白主要存在于包涵体中。结论Leptin基因可以在原核细胞中获得表达，为深入研究该蛋白在创伤愈合中的具体作用奠定了基础。     

小鼠透明带结合蛋白sp38在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的　表达及纯化小鼠透明带结合蛋白sp3 8。方法　从BALB/C小鼠睾丸组织提取总RNA ,利用RT PCR技术扩增sp3 8基因编码区序列 ,并将其重组到含麦芽糖结合蛋白 (MBP)的融合蛋白原核表达载体 pMAL c2x中 ,在大肠杆菌中进行表达。结果　序列测定表明克隆获得的sp3 8全长与基因库所登录的序列一致。经IPTG诱导表达出的MBP sp3 8融合蛋白分子量约 88kD ,经Westernblot分析证实。经直链淀粉琼脂糖凝胶 (amyloseresin)亲和层析和SephadexG 10 0分子筛层析纯化后 ,MBP sp3 8纯度达 90 %。 结论　成功地获得sp3 8蛋白 ,为进一步研究其生物学性能和用于免疫避孕的可能性打下了基础     

丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21Waf1在丙型肝炎中的表达及相互关系

目的调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白、P21cl-2的表达以及相互间关系,探讨HCV核心蛋白是否抑制P21和促进Bcl-2表达.方法收集23例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P21、Bcl-2表达,并用统计学方法分析三者间的表达关系.结果HCV核心蛋白和突变P21的阳性表达主要位于细胞核中,Bcl-2的阳性表达主要位于细胞质;HCV核心蛋白表达阳性组织中,P21阳性表达率仅13%,Bcl-2阳性表达率则达95.7%,三组间比较差异有显著性(P=0.012).HCV核心蛋白和Bcl-2二组间比较差异无显著性(P=0.561);HCV核心蛋白与Bcl-2、p21阳性强度两者间P值分别为0.012和0.2.结论三种蛋白的表达有相关性,HCV核心蛋白可能促进Bcl-2蛋白的表达,抑制P21蛋白表达.     

丙型肝炎病毒核心蛋白在胆管癌组织上皮间叶样表型转化中的作用

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白（HCVc蛋白）在胆管癌组织浸润和转移中的作用。方法 随机选取2001年1月至2006年11月间有完整随访资料的34例行根治性切除术的胆管癌患者。采用免疫组织化学方法检测胆管癌组织标本中HCVc蛋白、上皮性标志物及间叶性标志物的表达情况,并与临床病理学指标进行比较分析。结果 34例胆管癌组织中HCVc蛋白的阳性表达率是47．1％,上皮性标志物的缺失率分别为上皮性钙黏附素（E-cadherin）55．9％、α连环蛋白（α-catenin）70．6％、β连环蛋白（β-catenin）55．9％,间叶性标志物的阳性表达率分别为神经性钙黏附素（N-cadherin）50％、波形蛋白（Vimentin）44．1％、纤维连接蛋白（Fibronectin）55．9％,HCVc蛋白的阳性表达与E-cadhefin、α-catenin的缺失以及N-cadherin、Vimentin、Fibronectin的阳性表达相关（r=4．480、4．163、4．250、7．438、12．260,P值均〈0．05）,并与胆管癌组织的淋巴结转移及其他脏器转移相关（χ2=5．708、4．163,P值均〈0．05）。结论 HCVc蛋白可能通过诱导胆管癌组织上皮-间叶样表型转化的发生来促进胆管癌的浸润和转移。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备其多克隆抗体.方法 利用原核表达载体PGEX-6P-1/改良型TAT-VP3在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,经GST标签纯化树脂纯化蛋白,并用PreScission Protease酶切除标签,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,获得改良型TAT-VP3融合蛋白的多克隆抗体.用ELISA进行效价检测,Western blotting鉴定其特异性.结果 诱导表达并纯化了改良型TAT-VP3融合蛋白,纯度大于90%,蛋白浓度为1.2 mg/ml.制备了该蛋白的多克隆抗体,ELISA表明多克隆抗体效价为1∶32 000,Western blotting证明多克隆抗体的特异性良好.结论 成功纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备出高效价、高特异性的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础.     

沉默调节蛋白6-谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的克隆表达

目的 构建含有人沉默调节蛋白6(hSIRT6)基因的重组原核表达载体,获得高效表达hSIRT6蛋白的基因工程菌,以及较高产量的SIRT6蛋白.方法 取205 ng HEK293细胞总RNA逆转录后合成的cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hSIRT6的编码序列,并克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组的质粒pGEX-4T-3/SIRT6;将重组质粒pGEX-4T-3/SIRT6转化感受态细菌BL21( DE3),在含100 mg/L氨苄西林的LB平板37℃培养过夜,以pGEX-4T-3空载体作为对照,在相同条件下转化并异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白.产物经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定.结果 PCR产物大小及双酶切鉴定证明所克隆的基因是hSIRT6,DNA测序进一步证实与GeneBank序列完全一致.获得高表达及纯化的SIRT6-GST融合蛋白,该可溶蛋白的相对分子质量为72×103,经Western blot鉴定证实为目的蛋白.结论 成功构建了基因重组体pGEX-4T-3/hSIRT6,并制备出可溶性SIRT6-GST融合蛋白.     

HCV核心基因转染的胆管癌细胞中p53的表达及意义

目的：探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理。方法：通过分子克隆技术构建HCV－C基因重组质粒（PBK－HCVc)，经酶切鉴定后，将其转染到胆管癌细胞（QBC939）中，经G418选择培养，免疫细胞学，Western blotting鉴定其表达，透射电镜观察细胞形态学改变。并用免疫细胞学检测p53的表达。结果：构建的PBK－HCVc质粒在QBC939细胞中有稳定表达，透射电镜见胞质空泡内球型病毒颗粒，病毒颗粒直径50－80nm，有外膜结构。HCV核心基因转染后QBC939细胞的p53表达比转染前明显增多（P＜0．01）。结论：本实验为进一步探讨丙肝病毒感染与肝门部胆管癌中的致癌机理提供了理想的细胞株模型，HCV核心基因可诱发p53突变，可能与丙肝病毒感染的胆管细胞癌变有关。     

Influence of continuous infusion of interleukin-1 alpha on the core protein and the core protein fragments of the small proteoglycan decorin in cartilage.

Decorin, a collagen-binding small proteoglycan, is considered to have a specific function in the organization or stability of the collagen network. Therefore, alteration of its molecular properties may be of pathophysiological relevance during the development of cartilage damage. It is shown here that normal cartilage from rabbit knee-joint contains glycosaminoglycan chain-bearing core protein fragments of 39, 23, and 18 kDa, each one amounting to approximately 5-6% of the intact decorin core protein. Continuous infusion of human recombinant interleukin-1 alpha for 14 days (200 ng/day) into a knee-joint led in condylar cartilage to a reduction in the amount of intact core protein from 2 micrograms/mg wet tissue to about 1.1 micrograms/mg. The increase in its quantity found after infusion of heat-inactivated interleukin-1 was not statistically significant. The concentration of all three core protein fragments became reduced to a similar extent as the intact core protein under the influence of the cytokine, and additional fragments were not found. Surprisingly, there was a much smaller response to interleukin-1-treatment in patellar cartilage.     

HCV核心蛋白通过LXRα核受体介导HepG2细胞甘油三酯合成增加

目的：观察丙型肝炎病毒（HCV）的核心蛋白（core）对肝细胞甘油三酯（TG）合成的影响。方法将HCV 1b基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core1b和HCV 3a基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core3a分别转染至HepG2细胞,利用定量测定法检测细胞内TG含量,用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法（real time qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）方法观察脂质合成相关基因肝X受体α（LXRα）、甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）和脂肪酸合酶（FASN）的mRNA和蛋白的表达变化,并进行比较分析。结果 HepG2细胞转染两个基因型HCV core表达载体之后均能显著增加细胞内的TG含量（P＜0.05）,尤以基因型core3a组为差异更显著（P＜0.001）。Real-time PCR结果显示,两个基因型core均上调LXRα的mRNA水平（P＜0.05）,基因型core3a组差异更为显著（P＜0.01）;FASN的mRNA水平只在仅在基因型core3a组上调（P＜0.05）,而基因型core1b组差异无统计学意义。Western blot结果显示,HCV core表达可以明显上调表达可以显著上调SREBP1c的蛋白水平,尤其基因型core3a组更为显著。对FASN蛋白水平,基因型core3a上调其表达,但基因型core1b组无明显变化。结论 HCV可能通过LXRα介导肝细胞内的脂质合成诱导肝脂肪变,有待进一步研究。