基于rbcL序列鉴别十大功劳叶及其伪品

目的：利用叶绿体基因rbcL序列探讨十大功劳叶及其伪品枸骨叶的分子鉴定方法。方法：分别提取十大功劳叶的植物基因组DNA,经PCR扩增后测序,利用相关软件对序列进行分析。结果：所得各样品的rbcL序列长度为655bp,共存在碱基差异49bp,从构建的系统分枝树可知,各物种可明显分开。结论：rbcL序列可用于鉴定十大功劳叶及其伪品。     

陕西关中野生商陆资源的ITS2和psbA-trnH条形码序列研究

为探讨DNA条形码在陕西关中野生商陆资源中的鉴定作用,本研究采用通用引物ITS2和psbA-trnH对29份商陆样品DNA进行PCR扩增和测序,用Codon CodeA-ligner V3.0进行序列拼接和校对,随后进行BLAST比对鉴定分析;同时运用MEGA 6.0分析序列特征、K2P遗传距离及种内或种间变异,并构建系统进化树,评价两对引物对该区域商陆及其混伪品的鉴别能力。研究结果表明, ITS2和psbA-trnH序列的PCR扩增和测序成功率均为100%; NJ系统进化树显示ITS2和psbA-trnH序列均可明显将所有样本分别聚为商陆、垂序商陆并与其同属近源种鄂西商陆、日本商陆及两种混伪品各自聚为不同分支; ITS2序列在种间遗传距离上较psbA-trnH有一定优势。ITS2和psbA-trnH序列均可作为DNA条形码对商陆及其混伪品进行识别和鉴定,为商陆资源品种现状与分布研究及合理开发利用提供理论依据。     

蒙药材草乌叶DNA条形码研究北大核心CSCD

目的:建立草乌叶与其易混品的分子鉴定方法。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对草乌叶及9种混伪品的候选序列(ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH)进行扩增,比较各序列的扩增效率和测序成功率,并进行种内、种间遗传变异分析和barcoding gap分析。结果:ITS和ITS2序列GC含量较高,种间变异明显大于种内变异,根据barcoding gap图显示种内、种间遗传距离重叠较小,适合物种的区分,基于K2P距离进行聚类分析,ITS序列呈现较好的单系性。结论:ITS序列可应用于蒙药材草乌叶与其混伪品的鉴定,为民族药鉴定提供新方法。     

基于ITS序列鉴别特色民族药材土牛膝及其混伪品的研究

目的:利用DNA条形码对特色民族药材土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝)及其混伪品进行分子鉴定.方法:利用DNA条形码方法,分别对土牛膝及其混伪品的ITS和MatK基因片段进行扩增并双向测序,使用Codon?Code?Aligner软件对扩增序列进行拼接,用MEGA软件对数据比对分析,并基于K2P模型进行遗传距离分析...     

艾叶及其常见混伪品的分子鉴定

目的：对艾叶及其几种常见混伪品进行分子鉴定。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）法直接测序,对艾及其8种混伪品进行核糖体DNA内转录间隔区片段2（ITS2）扩增并双向测序,所得序列经CodonCodeAligner拼接后,用系统发育软件MEGA4．0进行相关数据分析,同时利用邻接（NJ）法构建系统聚类树。结果：艾叶基原植物艾ITS2序列长度为225bp,种内平均Kimura．双参数（K2P）遗传距离（0．000）小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离（0．022）;由所构建的系统聚类树图可以看出,艾具有单系性,同时又与其他混伪品明显分开。结论：ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别中药材艾叶及其混伪品,可为其质量评价及临床安全用药提供重要的分子鉴别依据。     

DNA条形码鉴定洋金花及其伪品

为建立有毒中药洋金花及其伪品DNA条形码鉴定方法,采用国际通用的条形码序列ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL对洋金花原植物白花曼陀罗及其伪品毛曼陀罗、曼陀罗和木本曼陀罗4个种共计20份材料进行了比较研究。PCR及测序成功率分别为ITS2(100%)、matK(100%)、psbA-trnH(90%)、rbcL(85%)。采用CodonCode Aligner进行序列拼接,采用MEGA 4.1计算白花曼陀罗及其伪品的种内、种间的K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树。结果显示ITS2序列共有30个单核苷酸多态性(SNPs)位点、psbA-trnH序列有33个单碱基的插入和缺失I。TS2和psbA-trnH序列种间遗传距离大于种内,matK和rbcL种内和种间没有明显Barcoding Gap。4个条形码序列及其组合获得的分子系统树(ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL、matK+rbcL)均分成了两大支,木本曼陀罗单聚为一支,该分子证据支持将Brugmansia提升为属水平。实验结果表明ITS2及psbA-trnH序列可以作为洋金花及其伪品鉴定用的条形码序列。     

基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品

建立了基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品(全叶青兰和夏枯草)的方法.对维吾尔药材薰衣草及其混伪品的ITS2 序列进行PCR扩增和双向测序,使用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行序列拼接,用MEGA 6.0 软件对拼接后的序列进行多重比对.并计算种内、种间遗传距离,构建NJ 系统聚类树,预测...     

25份燕窝样品的线粒体细胞色素氧化酶I基因序列分析

目的 对多种燕窝进行DNA条形码鉴别，为确定燕窝的基原提供分子依据。方法 对25份燕窝样品的细胞色素氧化酶I（mitochondria cytochrome oxidase subunit I gene，COI）条形码序列进行PCR扩增和测序，分析燕窝正品来源的种内变异，与混伪品的种间变异，以及序列相似性和进化树研究，用Taxon DNA软件评估"Barcoding Gap"。结果 金丝燕种内COI序列变异小，种间存在较多的变异位点，种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出，燕窝不同来源个体均聚在一起，能够与其混伪品区分开。结论 基于COI序列的DNA条形码技术可以用于鉴定燕窝的正品来源及其混伪品。     

羌活药材ITS/ITS2条形码鉴定及其稳定性与准确性研究

为验证DNA条形码鉴定的稳定性与准确性,本文选用羌活药材作为研究对象,对31份样本提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列并进行双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,采用MEGA5.0软件与其混伪品进行序列比对,计算种内和种间距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ Tree)。ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型(hidden Markov model,HMMer)的注释方法获得。结果表明,羌活药材ITS序列长度为603～604 bp,ITS2序列长度均为228 bp,羌活药材ITS/ITS2序列单倍型与其基原植物叶片序列一致。两种基原植物ITS/ITS2序列种内平均kimura 2-parameter(K2P)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;NJ树结果显示羌活、宽叶羌活与其混伪品均可明显区分,表现出良好单系性。因此ITS/ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别羌活药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。     

巴戟天饮片及其混伪品的鉴别研究

目的:基于DNA条形码技术、传统经验鉴别和理化鉴别技术区分巴戟天饮片及其混伪品。方法:通过聚合酶链式反应(PCR),对巴戟天的内部转录间隔区2(ITS2)序列进行扩增;通过与GenBank数据库进行BLAST比对,以及利用构建NJ树的方法推断巴戟天饮片及其混伪品的基原;比较巴戟天饮片及其混伪品的种内、种间差异;比较巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为差异。结果:巴戟天饮片及其混伪品经NJ树聚类分析和与GenBank进行BLAST比对,结果显示巴戟天饮片与其混伪品分支明显,11批巴戟天混伪品被鉴定到7个种,分别为印度羊角藤(羊角藤)、蔓虎刺、硃砂根、木通、黑老虎、合蕊五味子(铁箍散)、南五味子;种内、种间变异分析结果显示,5批巴戟天饮片的种内遗传距离为0.000,巴戟天饮片与其他7个混伪品的最小种间遗传距离为0.037;巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为存在差异。结论:基于DNA条形码技术可有效区分巴戟天饮片及其混伪品,为巴戟天饮片正伪品的鉴别以及标准提升工作提供了一定的依据。     

ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前

目的：建立以ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前及其同属近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。方法：搜集徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品,采用改良的CTAB法提取DNA,通过实验分别获得ITS2和psbA-trnH序列,将同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到43条ITS2+psbA-trnH复合序列,从GenBank数据库中下载来源于同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到14条ITS2+psbA-trnH 网上复合序列,用MEGA 6.05软件分析徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品的复合序列变异位点,计算种内、种间的K2P距离,并构建NJ系统聚类树。结果：徐长卿、白薇和白前药材ITS2+psbA-trnH复合序列比对后产生17个变异位点;徐长卿、白薇和白前基源物种种内最大K2P距离均小于其与混伪品的种间最小K2P距离;系统NJ树能准确将徐长卿白薇和白前及其近缘混伪品。结论：该研究建立了应用ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇、白前及其近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。     

基于Cytb基因对药用昆虫地鳖虫炮制品的分子鉴别研究

目的:建立基于线粒体DNA细胞色素氧化酶b(Cytb)基因的分子标记技术对地鳖虫(地鳖、冀地鳖)及其混伪品炮制药材进行分子鉴定的方法。方法:采用改良的饱和氯化钠法对地鳖虫及其混伪品炮制药材的总DNA进行提取。通过通用引物REVCB2H、REVCBJ对所有样品的Cytb基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增;用MEGA 5.1软件对所有样品的Cytb基因序列采用邻接(NJ)法构建系统发育树;并利用DNAMAN软件对得到的所有样品的Cytb基因序列进行比对,分析正品、混淆品间序列差异,在差异较大区域设计特异性引物Esin-F和Esin-R进行分子鉴定。结果:以提取的DNA为模板均能成功扩增出相应的Cytb基因片段;构建的系统发育树与其亲缘关系一致;设计的特异性引物Esin-F和Esin-R在同样的条件下,只有地鳖虫得到了扩增条带。结论:建立了地鳖虫及其混伪品药材炮制品的DNA提取方法;设计的特异性引物对地鳖虫有高度的特异性,能够有效鉴别地鳖虫及其混伪品。     

北沙参及易混品的ITS2分子鉴定

目的北沙参(Glehniae Radix)药材性状与桔梗科(Campanulaceae)的南沙参(Adenophora tetraphylla(Thunb.)Fisch.)、轮叶党参(Codonopsis lanceolata(Sieb et Zucc)Benth.et Hook.)等类似,易产生混淆。作者通过对不同产地北沙参及其混淆品的ITS2(Internal Transcribed Spacer2)分子鉴定,探讨ITS2条形码序列对北沙参药材鉴定可行性。方法对样品进行DNA提取,并运用PCR扩增方法进行ITS2序列扩增,采用双向测序的方法对PCR产物进行测序。测序结果运用DNAMAN软件对测序结果进行拼接,用MEGA5.1软件对序列结果进行分析并建立K2P模型的NJ树,并预测ITS2的二级结构。结果与结论不同产地北沙参的ITS2序列一致,并且从NJ树可明显区分北沙参及其混淆品。     

基于Cyt b基因的PCR技术对牛鞭药材的鉴定方法研究

目的:建立对牛鞭药材的聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法,从分子水平上对牛鞭药材的真伪进行鉴定。方法:提取牛鞭及其伪品(驴鞭、猪鞭、羊鞭)的基因组DNA,并对其完整性、纯度和浓度进行检测。利用GenBank相关信息,以牛鞭的线粒体细胞色素b基因(Cyt b)为靶基因,应用Primer-BLAST在线软件设计特异性引物,并对不同物种鞭类样品进行PCR扩增,对产物进行电泳分析;对获得的牛鞭样本PCR产物进行克隆和DNA测序验证。对所建立的PCR鉴定方法进行特异性和重复性考察验证。结果:提取所得的牛鞭及其伪品DNA的纯度较高,无蛋白质或RNA污染;1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示,牛鞭样本在200～300 bp之间均出现明显的目的基因条带,而其他伪品未见相应条带出现。DNA测序结果证实,所获牛鞭样本基因片段的核苷酸序列与GeneBank中牛鞭物种相似性均为100%。方法学验证结果显示所建方法特异性、重复性均良好。结论:本研究所建基于Cyt b基因的PCR鉴定方法简单、快速,准确性、特异性、重复性均良好,可满足牛鞭及其伪品的分析鉴定需求。     

基于ITS序列分析技术鉴定川牛膝与常见伪品麻牛膝

目的:比较川牛膝与其常见伪品麻牛膝之间的ITS序列差异及规律。为川牛膝与麻牛膝的DNA条形码鉴别提供适合的分子标记。方法:收集川牛膝及麻牛膝成品药材并提取纯化其基因组DNA,经PCR扩增得到ITS序列(包括ITS1、5.8S nrDNA、ITS2)并进行T-A克隆后测序,分析两者序列差异。结果:PCR扩增获得两者ITS序列,经多序列对比分析得出川牛膝与伪品麻牛膝的ITS序列存在明显差异。结论:ITS序列分析可以用作鉴定川牛膝与麻牛膝药材。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

基于ITS2序列的三棱及其混伪品的分子鉴定

摘 要 目的：通过分析三棱及其混伪品的ITS2条形码序列,探索鉴定三棱及其混伪品的新方法。方法: 采集三棱及其混伪品共5个物种8个样本,并从Genbank网上下载三棱及其混伪品共6个物种23条ITS2序列,用MEGA5.0软件计算上述ITS2序列的种间、种内遗传距离,并构建系统发育树。结果: 三棱种内最大K2P距离为0.038,与混伪品种间最小K2P距离为0.697。由所构建的系统发育树可以看出,正品三棱的不同样品聚在一支,并能很好地与混伪品区分开。结论:ITS2条形码序列能够成功鉴定三棱与其混伪品,为三棱及其混伪品的鉴别提供了新的方法。     

重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究

为评价DNA条形码候选序列对重楼属药用植物的鉴定作用, 探讨重楼属药用植物鉴定新方法, 本研究对重楼属11个物种17份样品的psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK和核ITS2序列进行PCR扩增和测序, 比较各序列扩增和测序效率、种内和种间变异, 进行barcoding gap分析, 采用BLAST1和Nearest Distance方法评价不同序列的鉴定能力。结果显示, ITS2序列在所研究的重楼属药用植物中的扩增和测序效率均为100%, 其种内种间变异、barcoding gap与其他DNA条形码候选序列相比具有明显的优势, ITS2序列在重楼属中的鉴定成功率达到100%, 而生物条形码协会 (CBOL) 植物工作组推荐的matK和rbcL序列的鉴定成功率分别为52.9% 和5.9%, 二者联合鉴定能力没有提高, 对于ITS2序列扩大至29个物种67份样品依然具有100%的鉴定成功率。实验结果表明, ITS2序列能够准确鉴定重楼属药用植物, 可以作为潜在的药用植物通用条形码序列。     

中药材龟甲的分子鉴定研究

用PCR产物直接测序法对中药材龟甲(板)进行鉴别。从乌龟 Chinemys revesii 和其他20种产地为中国或东南亚国家的龟类的组织材料中提取DNA,扩增约110bp的线粒体12SrRNA,基因片段并进行序列分析,构建了21种龟类的12SrRNA基因片段序列数据库。序列比较的结果表明乌龟与其它20种龟类的这段序列均有差别,序列差异在3.7～15.7%之间。从江苏省药品检验所提供的19块龟甲检品上各取样0.1～0.5g提取 DNA,扩增与上述相同的基因片段,与构建的数据库进行比较,结果表明19块龟甲中只有3块的原动物为乌龟,其余的龟甲均为混淆品。本文的结果为药材龟甲的鉴定找到了有效、可靠的分子遗传标记方法。     

5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性中的可行性研究

目的探讨5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性研究中的可行性。方法提取不同产地穿心莲总DNA后,PCR特异扩增5SrRNA基因间隔区,采用荧光标记末端终止子双脱氧末端终止法测序,对测序结果进行多序列联配分析。结果成功得到321bp的5SrRNA基因间隔区碱基序列,经过多序列联配分析发现,不同产地穿心莲的此段5SrRNA基因间隔区DNA序列之间没有差异。结论5SrRNA基因间隔区DNA序列不适合用于研究穿心莲药材的道地性。