3株人小细胞肺癌细胞系细胞线粒体DNA基因组突变研究

目的 通过碱基序列测定方法对比分析3株人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)细胞系细胞及其相应的获得性多药耐药细胞系细胞线粒体DNA (mtDNA)基因组突变情况并探讨其潜在的功能变化.方法 常规培养人SCLC细胞系细胞H446、H69、H1395及其相应的多药耐药细胞H446/CDDP、H69AR和H1395/CDDP.分别提取基因组DNA后,应用26对mtDNA特异引物PCR扩增mtDNA全长,然后采用PCR产物直接测序法,以修订的剑桥mtDNA序列(rCRS)为标准,分析上述细胞mtDNA基因组突变情况.结果 与rCRS序列相比对,H446和H446/CDDP属于mtDNA单倍型G,H1395和H1395/CDDP属于mtDNA单倍型C,而H69和H69/AR属于mtDNA单倍型N.此外,去除各种mtDNA单倍型特有的mtDNA遗传变异位点后发现,6种人SCLC细胞系细胞的mtDNA均存在特异性的碱基突变.这些突变不仅涉及mtDNA编码的tRNA、rRNA二级结构的改变,还涉及线粒体呼吸链相关蛋白的氨基酸种类的改变和氨基酸支链极性的改变,而这些改变可能影响到线粒体氧化(OXPHOS)、细胞凋亡等过程.但是,在各亲代细胞与其相应的多药耐药细胞之间没有发现特异的mtDNA突变.结论 人SCLC的发生、发展可能与mtDNA突变密切相关,但其获得性多药耐药性的产生与mtDNA突变无相关性.     

人外周血细胞线粒体DNA中存在特大片段缺失突变

了解线粒体ＤＮＡ大片段缺失突变及其意义。方法采用６种方法提取人外周血细胞ＤＮＡ,,其中１种方法先分离线粒体,再抽提线粒体ＤＮＡ。以得到的人外周血细胞ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,其产生经琼脂糖凝胶回收后与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接、转化、测序。结果６种方法抽提ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,产物电泳行为相同,发现人血细胞线粒体ＤＮＡ存在１３１６２ｂｐ特大片段缺失突变。结论此缺失首首发现的,经测序证明为人线粒体ＤＮ     

扩张型心肌病患者心肌病患者心肌线粒体DNA缺失突变及与？…

为探讨扩张型心肌病患者心肌线粒体ＤＮＡ缺失突变对心衰发病的意义，１０例ＣＣＭ患者心内膜活检心肌，用定量ＰＣＲ方法，以常发缺失型突变ｍｔ ＤＮＡ ４９７７ｂｐ（ｍｔＤＮＡ＾４９７７）和７４３６ｂｐ（ｍｔ ＤＮＡ＾７４３６）缺失率为损伤指标，观察心衰不同发展阶段ｍｔＤＮＡ所失程度与患者心肌线粒体呼吸酶活性改变及临床心功能受损不同关系。     

肥厚型心肌病患者心肌线粒体DNA的大片段缺失

目的：研究肥厚型心肌病与线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）缺失的关系。方法：应用ＬｏｎｇＰＣＲ技术扩增１例肥厚型心肌病（ＨＣＭ）患者心肌标本和血细胞ｍｔＤＮＡ。结果：在心肌ｍｔＤＮＡ中发现至少５ｋｂ缺失，而血细胞中未见缺失。结论：这支持ｍｔＤＮＡ缺失是心肌病的一个重要病因，且具有组织差异性。     

人多种组织中线粒体DNA存在13.1 kb片段缺失突变

目的:在人外周血细胞中筛选到新的线粒体DNA大片段缺失突变后,进一步探讨该缺失在稳定组织内的分布.方法:以人外周血细胞及人体多种组织DNA为模板,进行PCR扩增,筛选该突变.结果:在人外周血细胞及多种稳定组织中发现13.1 kb缺失突变的存在.结论:这种广泛分布于健康人多种组织中的线粒体DNA缺失突变可能与衰老有关.     

扩张型心肌病与线粒体DNA缺失片段的研究

通过对线粒体ＤＮＡ的分析试图从分子水平说明扩张型心肌病可能存在的发病机制。应用ＰＣＲ方法对１０例ＤＣＭ患者心肌组织ｍｔＤＮＡ进行检测，其中４例存在在７．４ｋｂ的；缺失；对照组中１例肥 厚型心肌病及２例心肌梗塞患者心肌组织中亦检验ｍｔＤＮＡ的异质性。     

宣威地区非小细胞肺癌患者线粒体DNA突变与多态性研究

【目的】寻找宣威地区肺癌患者肺组织中线粒体DNA突变和多态性情况,为进一步研究宣威地区女性肺癌高发机制提供参考。【方法】征集28例宣威籍肺癌患者,收集癌组织和相应癌旁正常肺组织,提取线粒体DNA ,实时荧光定量PCR和直接测序方法检测线粒体DNA突变和多态性改变。【结果】28例肺癌组织样本同对应癌旁组织比较,有21例（75．0％）发生mtDNA突变,15例有多种突变,突变发生在DLOOP 区,以及呼吸链编码区等区域。突变与患者年龄、性别,及组织学类型无明显联系。28例肺癌组织、相应癌旁组织同M t-DNA剑桥序列比较,有3例有mtDNA多态性改变。【结论】宣威肺癌患者线粒体DNA存在特异性的突变位点,以及多态性位点,可能和当地特殊的燃煤污染暴露及遗传易感性有关。     

线粒体脑肌病中线粒体DNA的部分缺失

在2例Kearns－Sayre综合征（KSS）和2例慢性进行性眼外肌麻痹（CPEO）患者的骨骼肌线粒体DNA（mtDNA）中发现存在单一的大片段缺失突变。缺失的长度2．5～5．5kb，突变只发生在部分线粒体DNA中，突变型mtDNA占全部mtDNA的60．5％～84．6％。在10例其它的线粒体脑肌病患者骨骼肌标本和外周血标本及数例正常骨骼肌和胎肝标本的mtDNA中均未发现缺失突变。上述发现支持mtDNA的缺失突变为KSS和CPEO主要病因的观点。     

线粒体DNA缺失细胞系的建立

目的 线粒体DNA缺失细胞系的建立和鉴定。方法 利用EB可以插入无核蛋白保护的线粒体DNA分子层状排列的碱基对之间抑制mtDNA复制的特点,将Lweis肺癌细胞在含有低剂量的EB、丙酮酸钠、尿嘧啶的培养液长期培养。结果 经EB诱导,可培育出具有嘧啶依赖性的mtDNA缺失细胞系。结论 线粒体DNA缺火细胞系的建立,为进一步研究线粒体DNA分子的基因及功能提供了条件。     

Study on 4977-bp deletion mutation of mitochondrial DNA in lung cancer

Objective： To study the 4977-bp deletion of mitochondiral DNA in lung cancer, adjacent normal tissue and health lung and its significance in the development of cancer. Methods： Thirty-seven matched lung cancer/adjacent histologically normal and 20 ＂true＂ normal lung tissue samples from patients without lung cancer were analyzed by long PCR technique. Results： Mitochondrial DNA 4977-bp deletion was detected in 54.1% （20/37） of lung cancers, 59.5% （22/37） of adjacent normal and 30.0% （6/30） of ＂true＂ normal lung tissues. The correlation of 4977-bp deletion with age and smoking factors was present in our data. Conclusion.. Mitochondrial DNA 4977 bp deletion is not specific to lung cancer and unlikely to play an important role in carcinogenesis, and may only reflect the environmental and genetic influences during tumor progression.     

胃癌细胞系和胃癌组织中线粒体DNA4 977 bp缺失及其生物学意义

目的 明确线粒体DNA 4977bp大片段缺失在胃癌细胞系、胃癌组织及胃癌患者血清中的频率,为胃癌的早期临床诊断寻找简便准确的分子标记。方法 运用Primer-shift PCR和直接测序的方法对13个胃癌细胞系、52对胃癌组织及对应的癌旁正常组织（年龄从28-78岁）、40例胃癌患者血清及40名正常人血清进行筛查。取10例胃癌组织的石蜡切片,采用显微切割技术在同一患者的切片上同时分离3种组织（包括胃粘膜正常腺体、肠化上皮及胃癌组织）对mtDNA 4977bp缺失进行了分析比较。结果 在13个胃癌细胞系中12个有mtDNA4977bp缺失（缺失率为92.3%),52例胃癌组织中38例有缺失（缺失率为73.1%),52例癌旁正常组织中27例有缺失（缺失率为52%）,40名胃癌患者血清中17例有缺失（缺失率为42.5%),40名正常人血清中8例有缺失（缺失率为20%）。胃癌组织和癌旁正常组织mtDNA 4977bp缺失差异有显著意义,癌组织mtDNA 4977bp缺失率与胃癌的分型和患者的性别没有关联。胃癌患者血清与正常人血清mtDNA4977bp缺失差异也有显著意义。10例显微切割组织中2例肠化上皮及胃癌组织中有缺失,而胃粘膜正常腺体未见缺失。结论 线粒体DNA 4977bp大片段缺失可能在胃癌发生和胃粘膜病变演化及细胞癌变的过程中起重要作用,血清中可以检测到线粒体DNA 4977bp大片段缺失,而且在胃癌患者血清中检出率远高于正常人血清。检测胃癌患者血清中mtDNA 4977bp大片段缺失有望成为一种简便易行的胃癌生物学行为的分子标记物。     

电离辐射致线粒体DNA 4977bp缺失与肿瘤细胞放射敏感性关系的初步研究

目的探讨肿瘤细胞经X线照射后线粒体DNA 4 977bp缺失率与存活分数的潜在关系。方法选用人宫颈癌细胞系(Hela细胞)、人肝癌细胞系(HepG2细胞)、人食管癌细胞系(EC-9706细胞)和人前列腺癌细胞系(PC-3细胞)4种肿瘤细胞系,经0Gy到8Gy X线照射后,采用克隆形成法测得存活分数,巢式PCR法检测线粒体DNA 4 977bp缺失率。结果肿瘤细胞放射敏感性由高到低依次是Hela细胞、HepG2细胞、EC-9706细胞和PC-3细胞。Hela细胞经1Gy X线照射后,HepG2细胞、EC-9706细胞和PC-3细胞经2Gy X线照射后均检测到线粒体DNA 4 977bp缺失。1Gy X线照射后,4种细胞线粒体DNA 4977bp缺失率比较,差异无统计学意义(P>0.05);2Gy X线照射后,Hela细胞线粒体DNA 4 977bp缺失率高于其余3种细胞(P<0.01);4Gy和8Gy X线照射后,Hela细胞线粒体DNA 4 977bp缺失率高于其余3种细胞(P<0.05),HepG2细胞和EC-9706细胞线粒体DNA 4 977bp缺失率高于PC-3细胞(P<0.01)。Hela细胞、HepG2细胞和EC-9706细胞的存活分数和缺失率之间呈负相关(r=―0.951,P<0.05;r=―0.976,P<0.01;r=―0.986,P<0.01)。结论线粒体DNA 4 977bp缺失可能是一个反映肿瘤细胞放射敏感性的生物标记。     

Detection of mitochondrial DNA deletion by a modified PCR method

Objective: To develop a simple and efficient method for detecting small populations of mitochondrial DNA deletion. Methods: Peripheral blood cell DNA was obtained from a victim who was aecidently exposed to a ^60Co radiation source 11 years ago. Using the DNA as template, PCR was performed to generate multiple products including true deletions and artifacts. The full length product was recovered and used as template of secondary PCR. The suspicious deletion product of mtDNA could be confirmed if it was only yielded by first PCR. Using either original primers or their nested primem, the suspicious deletion product was amplified and authenticated as true deletion product. The template was recovered and determined to be a deletion by sequencing directly. Results: A new mtDNA deletion, spanning 889 bp from nt11688 to nt12576, was detected in the peripheral blood cells of the victim. Conclusion: The new PCR-based method is more efficient in detecting small populations of mtDNA deletion than other routine methods. MtDNA deletion is found in the victim, suggesting there is relationship between the deletion and phenotypes of the disease.     

线粒体DNA缺失对人肺癌细胞生长和侵袭能力的影响

目的探讨线粒体DNA损伤对人肺癌细胞生长和侵袭能力的影响.方法采用溴化乙锭处理获得线粒体DNA缺失细胞;软琼脂集落形成实验检测细胞集落形成能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;MTT方法测定细胞生长状态.结果线粒体DNA缺失细胞较之于其母本细胞系,具有更强的集落形成和侵袭能力,以及更明显的生长优势.结论线粒体损伤可能参与了肺癌细胞恶性表型的形成.     

肺癌患者外周血白细胞线粒体DNA突变研究

目的分析mtDNA tRNAThr、tRNAPRO基因及非编码HVRⅠ区序列在肺癌患者及健康成人外周血中的突变情况并探讨其意义.方法一步法制备外周血白细胞mtDNA,结合PCR产物直接测序,对比分析mtDNA tRNAThr、tRNAPRO基因及非编码HVRⅠ区序列在17例肺癌患者和14例健康成人外周血白细胞中的突变情况.结果肺癌组和健康成人组中,仅1例健康成人mtDNA编码区tRNAThr基因中出现了1个碱基变异,碱基平均变异率为0.023 7%,而非编码HVRⅠ区共发现136个变异,碱基平均变异率为1.282 8%.肺癌组和健康成人组碱基平均变异率分别为1.238 4%和1.336 7%.肺癌组中腺癌、鳞癌、小细胞癌的碱基平均变异率分别为0.994 2%、1.202 1%和1.7544%.结论肺癌患者外周血白细胞mtDNA编码区序列趋于高度保守,主要碱基变异发生在非编码HVRⅠ区,与健康成人相应区域变异率总体上趋于一致,但肺癌组人均碱基变异随年龄增长有增高趋势,且小细胞肺癌外周血白细胞mtDNA非编码HVRⅠ区碱基平均变异率有增高趋势.     

线粒体DNA 4977 bp缺失与冠状动脉病变严重程度及稳定性的关系

目的:探讨人外周血线粒体DNA 4977 bp(mtDNA 4977)缺失与冠状动脉病变严重程度和稳定性的关系.方法:选择90例经冠状动脉造影(CAG)证实的无亲属关系的冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)患者,包括心绞痛(AP)66例,急性心肌梗死(AMI)24例;冠脉病变支数单支病变32例,双支病变28例,3支病变30例;0＜Gensini积分＜20分22侧,20≤Gensini积分＜40分26例,Gensini积分≥40分42侧.另外选择60侧年龄和病例组相匹配的健康受试者作为对照组.所有受试者均采用巢式PCR法测定外周血mtDNA 4977缺失相对数量,检测超敏C反应蛋白(hsCRP)、白细胞(WBC)计教、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPG)水平以及收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、体质指数(BMI)等相关指标,同时询问吸烟史、高血压病史及糖尿病史.结果:CAD组吸烟者、高血压病者、糖尿病者、SBP、DBP、TG、FPG、2hPG、WBC及hsCRP显著高于对照组,HDL-C显著低于对照组(P＜0.05或0.01).CAD患者外周血mtDNA 4977缺失发生率和相对数量显著高于正常对照组(P＜0.01);mtDNA 4977缺失发生率和相对数量在AP和AMI患者间无显著差别;mtDNA 4977缺失发生率和相对数量随冠状动脉病变支数和Gensini积分的增加而升高;CAD组中mtDNA 4977缺失相对数量与病变支数和Gensini积分呈明显正相关(P＜0.01),与WBC计数、hsCRP无相关性.结论:外周血mtDNA 4977缺失能反映冠状动脉粥样硬化病变的严重程度,与冠状动脉病变的稳定性无关.     

肺鳞癌mtDNA D-环序列微卫星不稳的研究

目的 分析肺鳞癌患者癌组织线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)非编码D-环区序列的微卫星不稳(mitochondrial microsatellite instability, mtMSI)现象并探讨其意义.方法 应用改良一步法制备15例肺鳞癌患者癌组织mtDNA, PCR产物直接测序,对比分析D-环区序列mtMSI情况.结果 15例肺鳞癌患者癌组织mtDNA D-环区中,全部出现了mtMSI(100%),在3个不同位点上共发现30个mtMSI.结论 肺鳞癌患者mtMSI发生率高, D环区碱基序列的mtMSI可能与肿瘤的发生发展有关.