应用Aptamer分子提高实时定量PCR的特异性

目的探讨Aptamer应用于普通Taq酶扩增的实时定量（Real—time）PCR反应体系能否提高反应的特异性，减少引物二聚体的产生。方法在使用SYBR GreenⅠ作荧光染料，普通Taq酶扩增的Real—time PCR反应体系中添加一定量的Aptamer，与未加Aptamer的PCR反应体系和采用了热启动酶的反应体系同时在Reche Light—Cycle2．0中进行扩增。结果添加了Aptamer和采用热启动酶的反应体系，引物二聚体得到有效的控制，而未加Aptamer的反应体系，融解曲线中，在产物峰前面有明显的代表引物二聚体的“肩峰”出现。结论Aptamer分子可以有效的抑制引物二聚体的产生和非特异性产物的扩增。     

运用降落PCR同时快速检测NV、EV71和CoxA16病毒

目的运用降落聚合酶链反应(touchdown PCR,TD-PCR)技术快速从腹泻、手足口病人粪便标本中同时检测诺如病毒(Norovius,NV)、肠道病毒71型(Enterovirus 71 EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16),并评价该技术用于检测这3种病毒的效能和敏感性。结论根据touchdown PCR原理设计TD-PCR程序,试验选择最佳反应条件,与普通PCR扩增效果进行评价。用10倍稀释检验TD-PCR方法的灵敏度,并用轮状病毒、札幌病毒、星状病毒、伤寒杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、香港海鸥形菌检测该方法的特异性。结果 TD-PCR能在一个反应条件下同时检测NV、EV71和CoxA16,扩增片段条带清晰,检测效果明显优于普通PCR,测序证实了3组片段的特异性,3种病毒cDNA的最低检测浓度分别为4.775μg/ml、2.360μg/ml、43.273μg/ml。检测该方法特异性时,其他病原体未见特异性条带扩增。结论成功建立的TD-PCR方法可同时检测腹泻和手足口病人粪便中NV、EV71和CoxA163种病毒,为快速检测相关病原体、科学防治腹泻和手足口病疫情暴发提供了可靠手段。     

改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的：设计并验证一改良的降落PCR(MTD—PCR)程序。方法：自盐藻bardawi1中提取基因组DNA作为PCR模板，使用TaqDNA聚合酶及pfu DNA聚合酶，运用普通PCR和MTD—PCR程序，扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列，并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果：使用普通Taq酶进行PCR，普通PCR程序产生200bp，500bp和1272bp的3条带，而MTD—PCR程序仅克隆出1272bp的特异带；利用高保真的pfu DNA聚合酶作PCR，在MTD—PCR泳道中也仅有1272bpl条带，而普通PCR除了产生1272bp的特异带外，还出现1条500bp的非特异带。结论：无论使用普通Taq酶或高保真酶pfu，改良的MT—PCR程序均明显提高PCR的特异性，提示它可用于克隆普通PCR难以克隆的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

用热启动加两步改良PCR法探讨载脂蛋白E基因多态性与老年性骨质疏松的关系

目的 探索ApoE基因的优化扩增方法及APOE基因多态性与老年人骨质疏松之间的关系.方法 分别用常规PCR法和热启动加两步PCR法,对ApoE基因进行扩增,对比两种方法的扩增效果.收集60岁以上老年骨质疏松组和正常对照组患者血样各100份,采用热启动加两步PCR法对的ApoE扩增产物进行测序,将测序结果与GENBANK中ApoE目的 片段序列比对结果并分析APOE基因多态性对骨质疏松的影响.结果 采用热启动加两步循环法优化ApoE的扩增方法,可以有效提高ApoE的PCR扩增的产率并可减少非特异性扩增.骨质疏松组E4等位基因频率高于对照组(P <0.05).结论 热启动加两步循环法可以有效地优化ApoE的扩增效率和特异性, ApoE4等位基因与老年性骨质疏松的可能相关.     

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的：探讨多重半巢式聚合酶链反应（msnPCR)在研究巨细胞病毒（CMV）DNA多聚酶基因（UL-54）中的应用价值。方法：从8例心肺移植患者血标本中提取DNA,以CMV-UL54为模板,自行设计6条特异性引物,建立msnPCR扩增系统。扩增产物在DNA测序仪上自动测序。结果：msnPCR能扩增出427bp和1052bp两条目的片段,扩增产物测序表面存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论：msnPCR扩增结合测序,可检测CMV-UL54的7个功能区目片段中的碱基突变,msnPCR比普通PCR更加省时和经济。     

实时荧光定量PCR检测外周血TREC的方法研究

目的建立及优化检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的方法及实验影响条件，为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建机制提供方法学基础。方法在ABI7000 PCR仪上实时扩增检测构建的TREC质粒标准品，摸索最佳扩增条件及建立标准曲线，然后用优化的FQ-PCR方法检测临床样本。结果T3、T4引物和R3、R4引物的扩增效率分别优于T1、T2引物和R1、R2引物。TaqMan-MGB探针比普通的TaqMan探针扩增效率高。金牌热启动Taq酶，比较普通Taq酶而言。提高了PCR的特异性和敏感性。FQ-PCR的反应条件设定：95℃10min后95℃5s，53℃30s，40循环结束。结论通过摸索与优化实验条件，建立了实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中TREC的方法。     

降钙素基因相关肽真核表达载体pcDNA3．1／CGRP的构建

目的构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因（rCGRP）的重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）／rCGRP。方法应用Trizol试剂从SD大鼠脑组织提取总RNA，RT—PCR扩增rCGRPeDNA（PCR引物上加上双酶切位点），产物通过Hindm和BamHI酶切、纯化、连接，将目的基因插入真核表达质粒载体peDNA3．1（＋），再将重组质粒转化感受态细菌，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，再经PCR、酶切和测序鉴定所得克隆。结果（1）RT-PCR产物电泳分析扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPcDNA大小相吻合；（2）重组克隆鉴定①PCR鉴定。PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPeDNA大小相吻合；②酶切鉴定，抽提质粒经双酶切，酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带，分别和pcDNA3．1（＋）和rCGRPcD-NA大小相吻合；③DNA测序，测序结果经BLAST分析，与rCGRP基因编码区全长序列完全一致。结论（1）大鼠脑组织中有rCGRP的表达；（2）通过RT—PCR及基因重组技术成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）／rCGRP。     

PCR-RFLP方法检测PARL基因Leu262Val多态性的实验研究

目的探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测PARL基因Leu262Val多态性的最适实验条件.方法在PCR实验中,运用降落PCR（touchdown PCR,TD-PCR）方法优化PCR条件;对引物终浓度设定0.8μmol/L、0.6μmol/L、0.4μmol/L和0.32μmol/L四个浓度梯度进行扩增;通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.在RFLP实验中,在内切酶量10 U不变的情况下,PCR产物量分别设定为5μL、10μL、15μL;酶切时间分别设定为12 h、8 h、4 h、2 h、1 h酶切,反应完毕后通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.结果 （1）降落PCR方法能有效降低或避免非特异性扩增;（2）引物浓度为0.4μmol/L时,PCR产物量高且引物二聚体较少;（3）10μL的PCR产物进行酶切,电泳结果清晰;（4）在37℃条件下酶切4 h能完全消化一个酶切体系中的PCR产物.结论 PCR实验中,TD-PCR优化了PCR条件,为扩增目的条带提供了快速、特异、可靠的方法,最适引物浓度为0.4μm/L;RFLP实验中,最有效酶切方案为20μL的体系中加10μL产物和10 U内切酶,37℃消化4 h.     

pRluc-KOR真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建与海肾萤光素酶（Rluc）融合的κ型阿片受体（KOR）真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法（BRET）检测apelin受体和KOR之间的相互作用．方法：以质粒pcDNA3．1-KOR为模板,PCR方法扩增KOR．扩增的KOR用NotI和XhoI双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒pRluc．将这两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10．挑取菌落培养,提取质粒,行酶切鉴定及测序．将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（HEK293）细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察．结果：扩增出了1条1145bp的片段,与预期的KOR大小相符,质粒酶切结果显示pRluc-KOR被切成2条片段,其中一条为pRluc载体大小,另一条为目的片段大小．经测序鉴定,序列与GenBank（NM_000912）中的序列高度同源．共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上．结论：构建成功了pRluc—KOR重组表达载体,此表达载体可用于检测KOR与apelin受体或与其他受体之间的相互作用．     

EV71入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞机制的初步研究

目的:初步研究肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的机制。方法:将临床EV71分离株接种于人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞,扩增和纯化病毒;MTT法检测不同病毒胞吞途径阻断剂对SKN-SH细胞生长抑制作用;用特异性的化学阻断剂预处理靶细胞后,Taq Man real-time PCR验证其对EV71 m RNA表达的影响。结果:RD细胞能够成功扩增出EV71病毒,病毒滴度为1×105 TCID50。随着药物浓度梯度的增加,SK-N-SH细胞的生长增殖受到抑制。Taq Man荧光定量RT-PCR结果显示氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)能够抑制EV71 m RNA的表达(Ρ<0.05),制霉菌素(nystatin,NT)对其影响不大(Ρ>0.05)。结论:初步推测EV71入侵SK-N-SH细胞是通过网格蛋白依赖性的内吞作用入胞。