敲低miR221/222上调PUMA促进胶质母细胞瘤U251细胞凋亡的体内研究

目的 探讨敲低miR-221/222表达上调PUMA对U251人脑胶质母细胞瘤凋亡的影响及其机制. 方法 5周龄BALB/c裸鼠左侧鼷部皮下接种1 mm3移植胶质瘤瘤块建立裸鼠移植瘤模型,1周后接受治疗(转染无义序列组、反义miR-221/222共转染组分别瘤内注射无义对照序列、反义miR-221/222寡核苷酸,对照组注射等量溶剂,每组8只).治疗开始至28 d观察肿瘤的生长情况,观察期结束时取肿瘤组织HE染色检测病理学改变;荧光原位杂交(FISH)、实时定量PCR检测肿瘤组织miR-221、miR-222的表达;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡,免疫组化染色、Western blotting检测肿瘤组织凋亡相关蛋白PUMA、bax和bcl-2、p53的表达. 结果 治疗后6～28 d反义miR-221/222共转染组移植瘤的体积明显低于对照组和转染无义序列组,差异有统计学意义(P＜0.05);与转染无义序列组及对照组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织miR-221、miR-222 mRNA的表达水平下降;HE染色显示反义miR-221/222共转染组肿瘤组织异型性减低,新生血管数减少;与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织的凋亡指数较高,差异有统计学意义(P＜0.05);免疫组化染色检测显示与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组PUMA、bax表达阳性率较高,bcl-2表达阳性率较低,差异有统计学意义(P＜0.05); Western blotting检测显示与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织PUMA和bax蛋白表达升高,bcl-2表达下降,而p53表达无明显变化. 结论 反义miR-221/222治疗可通过上调PUMA蛋白表达来诱导U251胶质瘤细胞凋亡.     

局部热化疗诱导鼠C6胶质瘤细胞凋亡的研究

目的研究局部热化疗对大鼠胶质瘤细胞凋亡的作用,探讨其作为胶质瘤辅助治疗的可行性。方法将传代培养的C6细胞接种于大鼠背部皮下熏肿瘤生长至1.5～2cm直径时,分组进行局部热疗、化疗和热化疗。继续观察皮下肿瘤生长情况,测量瘤体体积和重量;用免疫组化s-p法检测bax、bcl-2蛋白表达;用HE染色法、电镜、TUNEL法观察细胞凋亡;电镜观察肿瘤血管的变化。结果肿瘤接种32d后,热疗、化疗及热化疗组肿瘤的重量分别为(1.95±0.34)g,(1.86±0.40)g,(1.09±0.21)g,明显较对照组(2.95±0.36)g轻(P<0.001);各治疗组肿瘤体积也明显小于对照组;各治疗组bax蛋白表达亦明显强于对照组(P<0.001),且热化疗组也强于单纯热疗和化疗组(P<0.001);bcl-2蛋白表达改变不明显(P>0.05);热疗、化疗及热化疗组细胞凋亡指数分别为18.96±2.54、20.05±3.64、36.62±8.96,明显大于对照组的4.68±1.68(P<0.001)。各治疗组肿瘤微血管外径变小,血管壁变厚,血管减少,血管内皮细胞紧密连接增多,细胞连接间隙减小,有的血管甚至只能发现完整的基膜而缺乏内皮细胞。结论①热疗、化疗能抑制肿瘤增殖,且阿霉素与热疗联合使用有协同作用。②热疗、化疗、热化疗能促进bax蛋白表达,使bcl-2/bax比值减小,诱导细胞凋亡。③热疗可直接损伤细胞和周围血管,     

预防性协同给药抑制裸鼠脑胶质瘤的生长

目的观察预防性单独及协同给药对脑胶质瘤生长的影响。方法将浓度为107/ml、细胞成活率95%以上的U251MG脑胶质瘤细胞悬液,接种至6w龄雄性裸鼠脑白质内。接种次日给药,2次/w,分4大组,即消炎痛口服给药组(两个剂量组);榄香烯腹腔注射给药组(两个剂量组);消炎痛和榄香烯低剂量协同用药组;对照组(肿瘤对照和空白对照)。给药20和30d时,断颈处死裸鼠,脑标本做石蜡切片,3μm厚,行HE、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等染色。结果肿瘤对照组:裸鼠脑内肿瘤增生明显,瘤内幼稚血管形成,瘤细胞向白质内浸润,GFAP染色强阳性。单独给药组:瘤细胞较肿瘤对照组少,GFAP染色阳性。协同给药组:给药30d时大量瘤细胞发生凋亡,GFAP呈阴性表达。结论预防性的两药协同作用可更好地诱导裸鼠脑内人脑胶质瘤细胞发生凋亡。     

PTZ诱导孕鼠痫性发作对胎鼠海马中bax、bcl-2、capase-3表达的影响

目的探讨母鼠孕期痫性发作对胎鼠海马中bax、bcl-2、capase-3表达的影响。方法将雌性SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)、盐水组(NS组)和癫痫组(PTZ组),采用戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)致痫模型,PTZ组大鼠每天给予腹腔下注射PTZ 35 mg/kg,点燃成功后将雌性SD大鼠与雄性SD大鼠合笼;发现阴栓记为孕0d,孕鼠继续孕前处理至孕20d。NS组腹腔注射相应剂量的生理盐水,NC组不做任何处理。Western Blot方法测定胎鼠海马组织中bax、bcl-2及caspase-3蛋白表达变化。结果 PTZ组胎鼠海马caspase-3蛋白(2.57±0.08)较NC组(0.53±0.13)明显升高(P<0.05);PTZ组胎鼠海马bax蛋白(3.24±0.32)较NC组(1.55±0.11)明显升高(P<0.05);PTZ组子鼠海马bcl-2表达水平(1.42±0.074)较NC组(2.45±0.07)明显降低(P<0.05)。结论孕期痫性发作使胎鼠海马促凋亡蛋白bax表达增加,抑凋亡蛋白bcl-2表达降低,凋亡执行蛋白caspase-3表达增加,推测孕期痫性发作可能使胚胎海马神经元凋亡增加。     

胶质瘤抗血管生成治疗的实验研究

目的 研究VEGF反义寡脱氧核苷酸(AODN)对大鼠C6胶质瘤生长的影响,探讨抗血管生成作为胶质瘤辅助治疗新途径的可能性。方法 制备大鼠皮下C6胶质瘤模型,在接种细胞后不同时间点局部给予VEGF-AODN和其他处理因素,观察皮下肿瘤形成情况,测量肿瘤体积及重量,TUNEL法和电镜技术检测瘤细胞凋亡。结果 接种72h后开始局部注射反义寡核苷酸,使大鼠皮下C6胶质瘤的成瘤潜伏期延长,为(25.13±3.00)d,肿瘤重量减轻,为(1.13±0.17)g;皮下局部肿瘤形成后连续注射AODN,使肿瘤体积缩小,瘤细胞凋亡增加,瘤内坏死区扩大,但对细胞增殖无明显影响;电镜观察到AODN治疗组微血管基膜增厚,管径变小。结论 抗血管生成治疗可望成为胶质瘤治疗的一种辅助手段,具有临床应用前景。     

普罗布考对血管性痴呆大鼠行为学及海马区bcl-2和bax蛋白表达的影响

目的观察普罗布考对血管性痴呆大鼠认知功能及海马区bcl-2、bax蛋白表达的影响。方法选取健康雄性SD大鼠,采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立血管性痴呆大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、普罗布考组,每组12只。给药8 w后,采用Morris水迷宫实验,对各组大鼠进行行为学测试。用western blot方法和免疫组织化学方法测定海马区bcl-2和bax蛋白的表达变化。结果与假手术组相比,模型组大鼠逃避潜伏期时间延长,穿越平台次数减少,海马区bcl-2蛋白表达明显下降,bax蛋白表达明显上升;给予普罗布考后,与模型组相比,普罗布考组大鼠逃避潜伏期时间缩短,穿越平台次数增多,海马区bcl-2蛋白表达明显上升,bax蛋白表达明显下降。结论普罗布考可以改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力,其机制可能与上调bcl-2蛋白表达,下调bax蛋白表达有关。     

Bcl—2和Bax蛋白在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的 探讨人脑胶质瘤细胞中bcl-2和bax蛋白的表达。方法 采用S－P免疫组化法,对63例人脑胶质瘤标本进行分析。结果 63例脑胶质瘤中,bcl-2阳性表达率53．97％,其表达率并随肿瘤恶性程度增加而增加。bax阳性表达率49．21％。5例正常脑组织两表达均阴性,在bcl-2阳性表达的肿瘤中,bax阳性表达率高于bcl-2阴性表达的肿瘤（P＜0．05）。8例复发性脑胶质瘤中,bcl-2阳性率87．50％,bax阳性率37．50％,bcl-2/bax比值增大。结论 bcl-2和bax均参与肿瘤凋亡调控,bcl-2表达与脑胶质瘤恶性程度呈正相关;bax表达可随bcl-2表达增加而增加;bcl-2强表达,bax弱表达,bcl-2/bax值增大可能是肿瘤复发的预示性指标。     

缓释BCNU对GL261胶质瘤细胞凋亡作用机制的研究

目的 研究BCNU-PLGA 对GL261 胶质瘤细胞凋亡的作用机制.方法 利用溶剂挥发萃取法制备BCNU-PLGA 缓释微球.将24 只C57BL/6 小鼠随机等分为治疗组与非治疗组,借助动物立体定向仪,将体外培养小鼠GL261 胶质瘤细胞接种于小鼠颅内,行MR 检查掌握颅内成瘤情况.治疗组于术后第2 周立体定位植入BCNU-PLGA 缓释片剂,观察小鼠生存期,MRI 了解瘤体变化.获取标本行HE 染色,并行GFAP、Bax、Bcl-2 免疫组化检查检测其表达情况,相关数据采用统计学方法 进行分析.结果 治疗组与对照组生存期有明显差异(P ＜0.05),治疗组与对照组凋亡相关基因Bcl-2 免疫组化检查提示明显差异性(P ＜ 0.05),Bax 基本无改变,Bax/Bcl-2 比值明显增加.GFAP 表达为阳性.结论 BCNU-PLGA 局部缓释制剂通过下调Bcl-2 蛋白表达,上调Bax/Bcl-2 的比值,从而使胶质瘤细胞发生凋亡.     

氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型的病理学研究

目的 探讨氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型的病理改变. 方法 种植9L胶质瘤细胞于30只Fischer344大鼠鼠背建立9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型,并按随机数字表法分为空白对照组(自然生长,不进行任何处理)和氩氦冷冻组(给予氩氦冷冻治疗).接种后30d取出肿瘤组织进行病理学观察,应用HE染色、电镜下观察冷冻消融的肿瘤组织形态,应用免疫组织化学染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白表达. 结果 (1)光镜下空白对照组肿瘤细胞巢状排列紧密,肿瘤无包膜,瘤周小血管扩张,可见肿瘤细胞沿小血管浸润生长;瘤内新生血管丰富,瘤内常见出血、凝固性坏死灶.高倍镜下肿瘤细胞形态多样,核大深染、多核,异型性高.肿瘤细胞GFAP、S-100染色阴性,肿瘤细胞间胶质网可见阳性染色.(2)氩氦冷冻组HE染色显示冷冻中央区呈均匀性凝固性坏死,边缘区的炎性反应带主要为一些细胞碎片及大量的红、白细胞浸润:微血管内也发现大量的红细胞、血小板集合和血栓形成,并可见灶性出血.电镜显示冷冻区中央、边缘区组织细胞全部坏死或凋亡. 结论 氩氦刀可能是治疗胶质瘤有效的方法.     

瘤内注射树突状细胞对C6胶质瘤抑制作用的实验研究

目的通过构建SD大鼠脑胶质瘤模型,成瘤后瘤内注射树突状细胞,探讨树突状细胞对C6胶质瘤的抑制和诱导凋亡作用。方法 30只SD大鼠脑内注射C6细胞,成瘤后随机分3组。A组:沿原注射部位瘤内注入10μL培养液。B组:同法注入10μL含106个未成熟DC的培养液。C组:同法注入10μL含106个成熟DC的培养液。分析3组大鼠的生存时间;取不同组大鼠的脑内肿瘤,制作冰冻病理切片,染色后镜下观察;肿瘤组织制成细胞悬液后细胞爬片,免疫组化检测Fas在C6胶质瘤细胞中的表达,计算积分光密度值。结果 (1)生存时间:C组载瘤大鼠生存时间长于A、B 2组,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)肿瘤病理结果:C组肿瘤组织大片坏死区,B组小片坏死区,A组无明显坏死区。(3)免疫组化:Fas表达,细胞积分光密度值(IOD),C组明显高于A、B组。结论成熟DC可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,途径之一可能是增强抗原提呈,提高细胞Fas的表达。     

白细胞介素24对大鼠脑胶质瘤细胞Survivin表达的影响

目的探讨白细胞介素24(IL-24)基因对荷瘤大鼠脑胶质瘤细胞Survivin表达的影响。方法 48只SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组24只,分别接种IL-24/C6细胞(转染IL-24基因的C6鼠脑胶质瘤细胞)和C6鼠脑胶质瘤细胞。接种21 d后,采用RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测两组大鼠脑肿瘤组织中Survivin mRNA和蛋白的表达,采用流式细胞学检测肿瘤细胞凋亡率。结果 RT-PCR检测显示:实验组大鼠脑肿瘤组织中Survivin mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.01)。Western blot及免疫组化法检测显示:实验组大鼠脑肿瘤组织中Survivin的蛋白水平明显低于对照组(P<0.01)。流式细胞学结果显示:实验组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。结论 IL-24可抑制大鼠胶质瘤中Survivin mRNA和蛋白的表达,促进细胞凋亡,抑制肿瘤生长。     

大鼠树突状细胞疫苗治疗脑胶质瘤的实验研究

目的研究树突状细胞疫苗对C6荷瘤大鼠的免疫治疗效应,并比较免疫治疗策略的异同。方法将成年健康SD大鼠40只平均分为4组,分别经RN A致敏和C6冻融抗原致敏的DC免疫以及对照组经未致敏D C和R PM I1640免疫,采用LD H试剂盒检测CTL的体外杀伤活性。建立大鼠C6脑胶质瘤颅内肿瘤模型,观察其生存期,并进行病理学检查。结果肿瘤RN A致敏的D C疫苗活性最强,与C6冻融抗原致敏的DC疫苗相比,CTL杀伤活性差异不显著(P>0.05),但与对照组相比,差异非常显著(P<0.01)。治疗组荷瘤大鼠生存时间与对照组相比,差异非常显著(P<0.01);两治疗组之间差异不显著(P>0.05)。治疗组肿瘤生长明显抑制。结论C6冻融抗原和肿瘤细胞R NA致敏的树突状细胞疫苗均是有效的免疫治疗方法。     

p53基因联合伽玛刀放射外科治疗鼠C6胶质瘤的体内研究

目的探讨腺病毒介导的p53基因联合伽玛刀放射外科治疗胶质瘤的体内疗效。方法选用雄性SD大鼠58只,建立大鼠C6脑胶质瘤模型。6d后进行MRI检查,确定成瘤后随机分为对照组14只、伽玛刀治疗组14只,p53基因治疗组16只（随机选择2只行WesternBlot检测）、p53加伽玛刀联合治疗组14只。在动物模型建立后的第6、8天进行腺病毒介导的p53基因治疗,第10天行伽玛刀照射（15Gv）。伽玛刀治疗后48h,每组处死6只大鼠,检测增殖细胞核抗原（PCNA）及凋亡情况,其余8只在伽玛刀治疗后1、2、4及8周进行MRI检查。结果MRI显示p53加伽玛刀联合治疗组较单一治疗组动物肿瘤生长缓慢,且肿瘤细胞PCNA阳性率下降．凋亡率增加。结论p53联合伽玛刀可以明显控制C6胶质瘤大鼠肿瘤的生长。     

BMSCs作为HSV-tk载体联合CX43增强旁效应治疗胶质瘤的实验研究

目的 以骨髓间充质干细胞(BMSCs)为自杀基因HSV-tk载体,联合连接蛋白CX43介导的旁效应,对以BMSCs肿瘤追踪特性为基础的胶质瘤进行治疗研究.方法 以CX43质粒转染C6胶质瘤细胞,以腺病毒介导HSV-tk转染BMSCs;建立C6胶质瘤模型,实验动物分为4组:C6对照组、CX43-C6组、tk-BMSCs/C6/GCV治疗组和tk-BMSCs/CX43-C6/GCV治疗组.观察动物生存期,MRI监测肿瘤体积;脑切片行PCNA、原位凋亡检测肿瘤中央与边缘部位细胞增殖与凋亡情况.结果 CX43组、tk/GCV组生存期长于对照组,二者联合治疗组生存期最长,MRI示部分肿瘤消失;肿瘤内部与边缘细胞增殖活性下降,凋亡明显.结论 tk-BMSCs/GCV体系可有效杀伤侵袭瘤细胞在内的胶质瘤灶,连接蛋白CX43可增强此治疗效果.     

C6/IL-24对鼠脑胶质瘤血管生成的影响

目的探讨IL-24基因对荷瘤大鼠脑胶质瘤组织血管生成的影响。方法将24只SD大鼠随机分为C6/IL-24细胞组和C6细胞组,每组12只,分别于颅内尾状核部位接种转染IL-24基因的C6细胞(C6/IL-24)和鼠胶质瘤C6细胞。接种后21d取大鼠脑肿瘤组织,采用RT-PCR法检测大鼠脑肿瘤组织中VEGFmRNA的表达,免疫组化法检测VEGF和CD34的表达,并根据免疫组化结果计算两组肿瘤组织中的微血管密度(MVD)。结果RT-PCR结果显示:C6/IL-24细胞组VEGFmRNA表达水平明显低于C6细胞组(P0.01)。免疫组化法结果显示:C6/IL-24细胞组大鼠VEGF表达水平及CD34阳性MVD计数明显低于C6细胞组(P0.01)。结论IL-24基因转染后可抑制大鼠脑肿瘤组织中VEGF基因的表达,降低MVD,抑制肿瘤组织中新生血管的生长。     

转染外源性p16基因对恶性胶质瘤生长抑制作用的动物体内实验研究

目的 :探讨p16基因在体内对恶性胶质瘤的生长抑制作用。方法 :将外源性p16基因导入C6 细胞内 ,应用立体定向技术将C6细胞种植于SD大鼠尾状核头部 ,用核磁共振 (MR)扫描技术 ,动态观察颅内肿瘤生长情况。并通过免疫组化、原位杂交和细胞凋亡检测肿瘤细胞的增殖活性。结果 :转染组和治疗组大鼠生存期较对照组明显延长。治疗组肿瘤随时间的延长逐渐缩小。免疫组化显示转染组和治疗组P16蛋白表达明显增强。原位杂交和细胞凋亡检测表明 ,转染组和治疗组大鼠肿瘤细胞增殖活性降低。结论 :p16基因在体内有抑制恶性胶质瘤生长的作用 ;瘤体内注入p16cDNA质粒 脂质体复合物 ,可使肿瘤生长受到明显抑制 ,并使多数肿瘤消失     

PTEN-反义AKT2联合基因治疗胶质瘤的体内外实验研究

目的研究PTEN-反义AKT2的联合基因治疗在动物体内、体外抑制脑胶质瘤生长的效果。方法将大鼠C6胶质瘤细胞进行PTEN-反义AKT2的共转染,进行了原位杂交等体外实验研究,并进行了大鼠的体内实验研究。结果PTEN与反义AKT2共转染在体外可以产生比较明显的协同作用,在体内实验中,对照组和空载组大鼠均于3周内死亡;转染组8只大鼠和治疗组7只大鼠观察60d内无自然死亡。结论PTEN-反义AKT2联合基因治疗可以产生明显的协同作用,与单一治疗效果相比抑瘤作用明显增强,可以作为联合基因治疗的候选基因组合。     

外胚间充质干细胞向小胶质细胞分化的研究

目的观察外胚间充质干细胞（EMSCs）在大鼠胶质瘤模型中枢神经系统（CNS）内的分化方向。方法将大鼠c6胶质瘤细胞系微量注射入12只SD大鼠（4～6周龄）右侧纹状体内,建立大鼠胶质瘤模型;C6细胞移植后2d,Hoechst33342标记EMSCs移植到SD大鼠双侧纹状体内。EMSCs移植后7d行全脑组织冰冻切片,免疫荧光染色观察细胞表面标记OX-42（CD11b/CD11a）的表达,荧光显微镜下观察标记效果。结果SD大鼠全脑组织切片观察证实12只大鼠脑胶质瘤模型建立成功;Hoechst33342标记EMSCs阳性率达95％以上;荧光显微镜镜下观察显示注射人大鼠体内的EMSCs经过7d后大部分细胞都保持存活状态。同时有V6细胞和EMSCs存在的时候,C6细胞周围存在大量OX-42阳性细胞;而只有c6细胞或只有EMSCs时,OX-42阳性的细胞数量非常少。另外,远离c6细胞的EMSCs具有向c6细胞迁移的特性。结论在SD大鼠胶质瘤模型纹状体内中,EMSCs大多数被C6细胞诱导成为具有吞噬和抗原提呈功能的小胶质细胞。     

反义AKT2 cDNA治疗C6胶质瘤的体内外实验研究

目的研究反义AKT2(antisense AKT2，AS—AKT2)cDNA对鼠脑胶质瘤细胞系C6的生长抑制作用。方法将AS—AKT2 cDNA构建体转染鼠脑胶质瘤细胞系C6，原位杂交和蛋白印迹鉴定后，应用PCNA阳性率和MTT法检测细胞增殖能力，TUNEL法计算凋亡指数。应用立体定向技术将C6细胞和转染反义AKT2 cDNA的C6细胞种植到SD大鼠的右侧尾状核作为对照组和转染组；并对颅内已经形成C6胶质瘤的大鼠进行脂质体包裹的AS—AKT2 cDNA和空载体治疗；MRI动态监测大鼠颅内肿瘤生长情况，并检测标本AKT2和PCNA表达以及细胞的凋亡情况。结果转染AS—AKT2 cDNA后C6细胞AKT2表达显著抑制，增殖减慢，凋亡指数增加。反义治疗组和转染组大鼠生存时间明显延长；转染组和治疗组肿瘤标本AKT2表达下降或消失，PCNA阳性率降低，可见大量凋亡细胞，而对照组和空载组标本几乎没有凋亡细胞。结论体内外实验证明AS—AKT2 cDNA可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的重要优选靶的。     

三种鼠脑胶质瘤模型的建立与比较

目的 ;建立GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠、C6胶质瘤细胞SD大鼠及BALB/c小鼠皮下动物模型,比较其肿瘤生长特点。方法借助动物立体定向仪,将体外培养小鼠GL261、大鼠C6胶质瘤细胞分别接种于C57BL/6小鼠及SD大鼠右侧尾状核区,C6胶质瘤细胞接种于BALB/c小鼠左前肢皮下。接种后观察不同种实验鼠的生存状态及肿瘤的生长特性,颅内模型于接种后7d、14d、21d、28d进行MRI检查,皮下模型测量体积,并绘制生长曲线。解剖标本,做组织病理学和胶质纤维酸性蛋(GFAP)免疫组化检查。结果 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型较之后两种模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤,而且颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性好。结论 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型,其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型。