小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞,制成饲养层,用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好,增殖快,易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好,当培养4~5 d时,其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后,各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

目的：建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳分离培养及丝裂霉素C(MMC)处理的方法,用于培养胚胎干细胞。方法：取不同胎龄的胎鼠分离原代成纤维细胞,观察不同胎龄和培养、分离条件对细胞增殖的影响;观察不同浓度和不同作用时间下MMC对细胞增殖的抑制作用。用MTT法测定细胞增殖的数量。取妊娠3．5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果：制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄是12．5～14．5d：室温条件下,0．25％胰蛋白酶消化时间最好在3～5min之内：原代细胞培养2～4d后即可传代,MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是20μg/ml,2～4h,成纤维细胞饲养层可以维持10d。囊胚在饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。结论：从12．5～14．5d胎龄小鼠胚胎分离培养的胚胎成纤维细胞质量最佳,经20μg／ml MMC处理2～4h后,可以作为饲养层用于胚胎干细胞的分离克隆。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

利用细胞饲养层分离培养大鼠胚胎干细胞

目的 从大鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞.方法收集大鼠的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,5～6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态、分化过程及细胞核型的检测.结果细胞集落性生长,符合胚胎干细胞的特征.结论大鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

人胚胎干细胞饲养层培养体系的建立

目的建立人胚胎干细胞饲养层培养体系。方法以胎鼠和人胎儿为材料,以DMEM加15％FBS加0．1mM2ME为基础培养液,分别制备胎鼠和胎儿成纤维细胞饲养层。结果分别获得了传16代的胎鼠成纤维细胞和传7代的人胎儿成纤维细胞,建立了人胚胎干细胞饲养层的培养体系。结论胎鼠成纤维细胞和人胎儿成纤维细胞相比较,后者生长速度慢,且较易老化;胎鼠成纤维细胞饲养层更有利于人胚胎干细胞的生长;8～14d龄胎鼠最适宜制备人胚胎干细胞饲养层;在宣温条件下,以0．2％胰酶加0．04％EDTA为消化液处理原代胎鼠组织块时间以15～20min为宜。     

鸡胚胎干细胞饲养层培养体系的建立

采用孵化 8～ 1 2 d鸡胚 ,用胰酶消化 ,以含 1 0 % NBS的 DMEM溶液为培养液 ,分离获得鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,建立了培养鸡 ES细胞的饲养层细胞。经过 CEF酶活力法筛选 ,建立了 ES细胞的条件培养基 ,其组成配方为 1 0 % NBS、5 % FBS、 2 .5 %的鸡胚提取物 ,1× 1 0 6/ L m L IF,1 0μg/ L人 b FGF,40μg/ L伴白蛋白 ,0 .1 4mmolβ-ME的高糖DMEM。鸡类 ES细胞 (AKP阳性细胞 ,因未经遗传学和免疫组织化学鉴定 ,故称类 ES细胞 )在经丝裂霉素 -C处理的饲养层细胞上和条件培养基中可传至 9代仍保持良好的增殖能力和未分化状态。     

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

 目的 为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hESc)体外培养系统,本实验欲用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts, hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法 利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞,纯化增殖细胞,采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc（HS181细胞株）接种在该饲养层上,连续传代至20代,倒置显微镜观察其形态学变化,测定其细胞碱性磷酸酶活性,类胚体形成实验及干细胞转录因子表达,严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice, SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。 结果 hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛,连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖,24h内能较好地保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代任能较好地保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子;悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体（Embryoid bodies, EB）结构, 可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达,证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞,说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示：将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论 hPFF可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制

目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系，用于分离和克隆胚胎干细胞研究。方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞，观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响，以及丝裂霉素C对细胞增殖的抑制作用；细胞增殖的数量用MTT法测定。结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12．5—14．5d；20℃-25℃时，用0．25％胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min；可在培养3—6d后进行传代。细胞冻存于-80℃3-4个月，复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg/10^5细胞，作用2-4h，可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d内不增殖也不死亡。结论 在合适条件下，小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养，并能多次传代和冻存；经丝裂霉素C处理后增殖受抑制，可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。     

小鼠胚胎干细胞分泌因子对前列腺癌细胞作用的体外研究

目的 研究小鼠胚胎干细胞(ESC)分泌因子对前列腺癌细胞RM-1生物学特性的影响,并探讨其作用机制。方法 采用Transwell小室在体外建立ESC联合小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与RM-1细胞的非接触式共培养体系作为实验干预(实验组),同时建立MEF与RM-1细胞的共培养体系作为阴性对照(对照组)。共培养72 h后,检测实验组与对照组RM-1细胞的增殖水平,比较两组细胞的形态学、细胞周期、凋亡水平、迁移与侵袭能力的差异。结果 与对照组比较,实验组RM-1细胞的形态表现为排布稀疏,分裂减少,死亡增多,部分细胞呈现凋亡迹象;实验组RM-1细胞增殖减慢(P<0.01),细胞周期存在G₁→S期阻滞且凋亡增加,以晚期凋亡为主(P均<0.01);实验组RM-1细胞的迁移和侵袭能力减弱(P均<0.05)。结论 ESC分泌因子可通过阻滞RM-1细胞周期、促进其凋亡使RM-1细胞的增殖减慢,同时减弱其迁移与侵袭能力而发挥抗肿瘤作用。     

诱导性多潜能干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的制备小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs）滋养层,用于诱导性多潜能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的体外培养。方法取13.5～15.5天胎龄的胎鼠,采用组织消化法分离原代培养成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线进行观察。采用10μg/ml丝裂霉素C预处理P2～P3代MEFs 2～3h制备出细胞滋养层,在该滋养层上进行iPSCs培养,观察iPSCs的集落生成情况,并行碱性磷酸酶细胞染色。结果 MEFs经丝裂霉素C预处理后细胞既不增殖,也不会死亡,仍保持分泌多种生长因子的能力。iPSCs在MEFs滋养层上生长良好,类似于胚胎干细胞一样能形成＂鸟巢＂状集落,并可维持iPSCs正常形态,抑制其分化而不影响活力,碱性磷酸酶染色阳性。结论利用诱导性多潜能干细胞滋养层方法制备的细胞滋养层,能有效支持iPSCs的生长,为进一步开展iPSCs的研究提供了理论依据和实验基础。     

胚胎干细胞诱导的内皮细胞对自身向成骨细胞分化的影响

目的探讨由胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）诱导的内皮细胞（endothelial cells,Ec）与自体胚胎干细胞联合培养时对ESCs成骨作用的影响。方法提取小鼠的胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞,诱导胚胎干细胞生成Ec,培养细胞分为四组。A组：胚胎干细胞诱导组;B组：胚胎干细胞诱导组;C组：胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞（Ec）诱导组;D组：ESCs和诱导的EC联合培养诱导组。通过干细胞形态的观察、免疫荧光、细胞的增值、碱性磷酸酶以及骨钙素含量的测定从酶学、组织学及生化学等不同方面观测骨髓基质细胞对胚胎干细胞向成骨细胞诱导转化的影响。结果通过细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。D组ESCs和诱导的Ec联合培养组MTT检测结果各组细胞生长差异没有显著意义（p〉0.05）,骨钙素和碱性磷酸酶测定D组有明显差异高于其他3组（p〈0.05）。结论以胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞对胚胎干细胞的成骨有明显的促进作用。     

早、晚代MEF用于人胚胎干细胞培养的能力差异及分泌机制

目的比较早、晚代小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF)维持人胚胎干细胞(Humanembryonic stem cells,h ESCs)正常生长的能力差异,并从分泌因子角度探讨其机制,为开发基于晚代MEF的h ESCs培养体系奠定基础。方法以P3或P9代MEF为饲养层培养h ESCs;通过添加碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblastgrowth factor,b FGF)调节MEF分泌因子表达;用β-半乳糖苷酶活性染色检测细胞衰老;用定量RT-PCR检测基因的m RNA表达水平;用ELISA检测TNF-a的分泌量。结果 P3代MEF增殖较快,能维持h ESCs正常增殖,而P9代MEF呈现衰老表型,不能维持h ESCs正常增殖。P9代MEF表达多种分泌因子(Grem1、Tgfb1、Inhba、Bmp4和Tgfb2)及衰老相关分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)因子(Il-1a和Tnfa)的水平均明显高于P3代MEF。加入b FGF后,P3和P9代MEF的Grem1、Tgfb1和Inhba的表达均明显升高,而Bmp4和Tgfb2表达均下降。结论 P9代MEF保留对b FGF的反应性,但有明显衰老表型及SASP,SASP的出现可能是P9代MEF不能维持h ESCs正常生长的重要原因。     

胚胎神经干细胞的分离和培养

目的：分离培养胚胎神经干细胞,探讨神经干细胞的取材方法。方珐：在解剖显微镜下,从孕11d(E11d)大鼠胚胎剥离神经管,剪成组织块进行培养,同时取部分神经管经胰酶消化后,获取细胞悬液进行单细胞培养;于培养后不同时间观察细胞的生长状况。结果：在组织块培养和单细胞培养中,接种细胞均生长良好;体外培养5d时,从组织块边缘放射状生长、迁移出细胞,并伸出突起;单细胞培养中,细胞增殖成团并长出突起连成网状。结论：组织块和单细胞培养法均可以从胚胎神经管分离、培养神经干细胞。     

胚胎干细胞来源的内皮细胞构建内皮化血管支架

目的探索胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞,并用于构建内皮化血管支架,为临床心血管疾病治疗提供实验基础。方法采用改良后单层分化体系,血管内皮生长因子（VEGF）作为独立诱导因子定向诱导胚胎干细胞分化为血管内皮细胞,用RT-PCR法检测分化时程各时间点内皮特异性标志的表达,用免疫荧光法检测分化体系中的内皮细胞蛋白标志。将分化成熟的内皮细胞种植于支架表面,构建内皮化血管支架。结果胚胎干细胞全能性分子标志Oct3／4,早期内皮标志Flk-1,Tie-2,PECAM-1,以及成熟内皮标志VE-cadherin在胚胎干细胞分化体系中呈现一定的转录时序性;免疫荧光结果显示分化细胞Flk-1,VE-cadheiin阳性,血管支架被表达VE-cadherin的内皮细胞覆盖。结论我们改良了胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的方法,并用于探索内皮化血管支架的构建。     

人类胚胎干细胞体外分化形成包含多种细胞的类胚体

目的:研究人类胚胎干细胞的体外多向分化能力.方法:胚胎干细胞在无饲养细胞、无碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、悬浮条件下培养形成类胚体.采用RT-PCR方法检测不同培养时间类胚体中某些功能细胞的特征分子标志.结果:在无饲养细胞、无bFGF、悬浮条件下培养,胚胎干细胞自动聚集形成细胞团,逐渐长大并分化为囊实性类胚体.RT-PCR显示,类胚体表达多种细胞前体及功能细胞的分子标志,如神经前体细胞、胰岛前体细胞以及成熟神经细胞、表达胰岛素的β细胞、表达胰高血糖素的α细胞和肝细胞等等.不同细胞标志在类胚体中出现的时间段有差异,先出现分化程度低的前体细胞分子标志,然后出现成熟细胞的分子标志.结论:人类胚胎干细胞体外可自然分化为表达多种细胞标志的类胚体,是进行深入体外诱导分化研究的基础.