大鼠角膜碱烧伤后视网膜细胞凋亡的研究

目的研究严重眼前段碱烧伤后视网膜组织内的细胞凋亡情况,以及Fas抗原(Fas)和Fas配体(Fas ligand,FasL)表达与细胞凋亡的关系。方法制作大鼠角膜严重碱烧伤模型。在烧伤的不同阶段,应用TUNEL法检测凋亡细胞、免疫组织化学法检测Fas、FasL在视网膜组织中的表达和变化,并与正常大鼠相对照。结果正常视网膜中基本未见TUNEL阳性细胞,碱烧伤3d后在视网膜神经节细胞、内核层细胞和内层血管内皮细胞中均可见不同程度的TUNEL阳性细胞。正常视网膜未见Fas表达,实验各组中均可见不同程度的Fas表达;正常视网膜FasL弱表达,实验各组FasL表达显著增强,与正常对照组比较差异有显著性(P<0.01)。Fas和FasL表达与凋亡之间具有较好的相关性,相关系数分别为0.899(P<0.01)和0.504(P<0.01)。结论严重眼前段碱烧伤后视网膜组织细胞存在异常凋亡,凋亡可能与Fas/FasL系统有关。     

内毒素诱导葡萄膜炎中炎症细胞凋亡与TRAIL表达的研究

目的:在内毒素诱导的葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)模型中,观察葡萄膜炎病变中炎症细胞凋亡的发生,研究大鼠虹膜组织中炎症细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的表达与炎症细胞凋亡的关系,探讨TRAIL凋亡途径可能参与炎症细胞的凋亡。方法:以1mg/kg内毒素注射于大鼠后足垫建立EIU模型,分别于注射后不同时间点观察大鼠眼内的炎症反应。吸取房水观察细胞数。摘取眼球,行HE(hematoxylin eosin)染色观察大鼠虹膜组织的病理改变;TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling)法检测炎症细胞凋亡情况;同时运用SABC法检测在内毒素诱导后的不同时间TRAIL在炎症细胞上的表达,并行图像分析。结果:内毒素注射6h开始出现炎症,以后炎症加重,于18～24h达到炎症高峰,48h炎症明显消退。房水中的细胞数也在24h组达到最多。HE染色显示:内毒素注射后6h,即出现炎症细胞,细胞数目在24h组最多,多数为多形核中性粒细胞,少数为单核细胞和淋巴细胞,48h组炎症细胞几乎消失。TUNEL染色显示:在内毒素注射后6h组即有炎症细胞出现阳性着色,24h组凋亡数达到最多。免疫组化显示:TRAIL蛋白在大鼠的虹膜色素上皮层呈弱阳性着色;TRAIL在炎症细胞上呈阳性着色,24h组在炎症细胞中的着色数量及着色强度达到最高。结论:以1mg/kg的内毒素注射于SD大鼠后足垫可诱导出葡萄膜炎反应,炎症反应在24h组最为强烈。炎症细胞凋亡可能是EIU炎症迅速消退的原因之一。TRAIL可能参与了炎症细胞的凋亡。     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中Fas/FasL mRNA表达的影响

目的：通过检测不同压力及时间纯化培养的大鼠视网膜神经节细胞（retinal gangal ,Cells,RGCs)中Fas/FasL mRNA的表达，探讨Fas/FasL在RGCs凋亡中的作用，方法：用SD系大鼠脑源性星型胶质细胞同化培养液双界面法培养羊抗鼠Thy1.1单克隆抗体纯化的SD系大鼠RGCs，分别在0mmHg(对照组）和20，40，60and 80mmHg(1kPa=7.5mmHg)的压力下培养24h及48h后,用免疫组化和原位杂交对RGCs中Fas/FasL及其mRNA的变化进行定性及半定量观察，TUNEL法检测各组织细胞的凋亡，结果：纯化的RGCs培养24h用羊抗鼠FITC－Thy-1.1单克隆抗体进行鉴定阳性，纯度为97％，免疫组化和原位杂交检测Fas/FasL及其mRNA，结果培养24h对照组无表达，20mmHg组有较弱的表达信号，40，60及80mmHg组表达逐渐增强，与对照组比较差异均有显著性（P＜0．05），培养48h对照组弱表达，压力≥20mmHg各组较相同压力培养24h各组表达增强，差异有显著性（P＜0．05），TUNEL法检测细胞凋亡，培养24h对照组未见细胞凋亡。20mmHg见少量细胞凋亡，随着压力的增高细胞凋亡数增多，凋亡指数增高，与对照组相比均有显著性差异，培养48h组压力≥20mmHg各组较相同压力培养24h组凋亡指数增高，差异有显著性（P＜0．05），结论：压力可激活视网膜神经节细胞Fas/FasL mRNA表达，Fas/FasL系统活化参与了青光眼高眼压下视网膜神经节细胞的凋亡。     

Fas/FasL在视网膜缺血再灌注损伤中的表达与细胞凋亡的关系及碱性成纤维细胞生长因子的治疗作用

目的 探讨Fas/FasL在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达与细胞凋亡的关系及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor bFGF）的治疗作用。 方法 前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，28只大鼠随机分为正常组和手术组，其中手术组大鼠左眼为缺血再灌注组，右眼为治疗组（玻璃体腔内注射bFGF），手术组又按照再灌注后不同时间段分为1、6、12、24、48、72 h组。应用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotinnick-end，TUNEL）法检测视网膜神经细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)，免疫组织化学法检测视网膜组织中Fas、FasL的表达。 结果 视网膜神经细胞的凋亡出现于再灌注后6 h，并逐渐递增，24 h达到高峰，48 h开始下降，72 h组不明显。Fas、FasL 表达改变与凋亡的神经细胞改变基本一致。bFGF治疗组各观察指标表达变化规律与缺血组基本一致，但AI值在12、24、48 h组明显低于缺血组（P＜0.05）；Fas表达在6、12、24 h组较缺血组显著下降（P＜0.05）；FasL表达在12、24、48 h组较缺血组明显下降（P＜0.05）。 结论 Fas/FasL死亡诱导系统参与视网膜缺血再灌注损伤，导致神经节细胞的凋亡；bFGF可抑制Fas 、FasL的表达，减少神经节细胞凋亡，对视网膜缺血再灌注损伤有治疗作用。 （中华眼底病杂志，2003，19：160-163）     

骨髓间充质干细胞移植对缺血-再灌注损伤视网膜中Fas／FasL及caspases-3表达的影响

背景视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）严重影响视力,其损伤机制是视网膜细胞的凋亡,治疗效果不佳。研究证实骨髓间充质干细胞（BMSCs）视网膜下移植后可显著减轻RIRI,而BMSCs视网膜移植所产生的神经保护机制是否与其抑制凋亡作用有关目前尚不清楚。目的观察BMSCs视网膜下移植对RIRI大鼠视网膜中凋亡相关因子Fas／FasL和caspases-3蛋白表达的影响,探讨BMSCs移植治疗RIRI的神经保护机制。方法无菌条件下分离SD大鼠的股骨和胫骨骨髓,离心收集细胞后用DMEM低糖培养液制成骨髓细胞悬液,体外培养大鼠BMSCs,并以1×10^6～2×10^6个／ml的细胞密度和1：2进行传代。64只清洁级健康成年SD大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、BMSCs移植组及PBS对照组,每组16只。用视神经线栓法制备大鼠视网膜RIRI模型,BMSCs移植组大鼠于造模后24h视网膜下注入5×10^4个活BMSCs,PBS对照组以同样的方式注入PBS。用颈椎脱臼法处死大鼠,制备16μm厚视网膜切片。采用免疫组织化学法动态观察BMSCs移植后6、24、48、72h各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3蛋白表达的变化。结果BMSCs视网膜下移植后72h,荧光显微镜观察可见视网膜下Hoechst33324阳性细胞。BMSCs视网膜下移植后6、24、48、72h,正常对照组大鼠视网膜仅见微量Fas、FasL和caspase3的阳性表达;BMSCs视网膜下移植后各时间点,模型对照组与BMSCs移植组大鼠视网膜均可见Fas、FasL、caspase-3阳性表达细胞,免疫组织化学染色强度和细胞数量值均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。随着BMSCs移植时间的延长,各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3阳性细胞数均逐渐下降,各时间点BMSCs移植组大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3的阳性表达值均明显低于模型对照组和PBS对照组大鼠,差异均有统计学意义（P〈0．05）,但各时间点模型对照组与PBS对照组间大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3阳性细胞数变化的差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论视网膜下移植BMSCs可下调RIRI大鼠视网膜中凋亡相关蛋白Fas、FasL及caspase-3的表达,从而减轻RIRI大鼠视网膜神经节细胞的凋亡。     

果糖二磷酸镁对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨果糖二磷酸镁(magnesium fructose diphosphata,FDPMg)时实验性大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响及其作用机制.方法 通过升高眼压的方法,制作大鼠实验性视网膜缺血再灌注损伤的模型.将66只SD大鼠随机分为正常组、缺血再灌注模型组、FDPMg干预组.后两组各分为6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5个时间段.采用DNA原位末端标记法检测凋亡的视网膜细胞;免疫组织化学法检测视网膜组织中Fas/FasL蛋白的表达变化.结果 正常组大鼠视网膜未见凋亡细胞.缺血再灌注模型组再灌注6 h可观察到凋亡细胞;12 h凋亡细胞逐渐增加;24 h细胞凋亡达高峰;48 h凋亡细胞减少;72 h视网膜仍可见凋亡细胞.各组Fas/FasL表达情况与视网膜细胞凋亡情况基本一致.FDPMg干预组各时段各观察指标表达均较缺血再灌注模型组明显下降,两组间比较差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01).结论 FDPMg明显抑制Fas/FasL蛋白在视网膜缺血再灌注损伤中的表达,进而抑制细胞凋亡来实现其对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用.     

红芪多糖干预内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎的机制

目的　探讨红芪多糖（hedysarum polybotrys saccharide,HPS）在内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎发病中的作用及对Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR-4）信号转导通路中关键分子肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）及TIR功能区接头蛋白诱导的干扰素β（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)表达的影响。方法　选用SPF级健康成年Wistar大鼠40只，随机分为内毒素诱导的葡萄膜炎（endotoxin induced uveitis,EIU）模型组、HPS组、HPS+内毒素组、正常对照组（normal control，NC）组，每组10只。EIU模型组大鼠采用皮下注射1 mg·kg^-1内毒素的方法建立大鼠急性前葡萄膜炎动物模型。HPS+内毒素组在内毒素注射前1 h给予腹腔注射HPS 400 mg·kg^-1。HPS组大鼠只注射HPS 400 mg·kg^-1。每2 h用裂隙灯观察大鼠眼前节炎症反应，注射后的0 h、6 h、12 h、18 h、24 h对各组眼部临床炎症反应进行评分。注射后24 h组织病理学检查炎症反应水平。RT-PCR检测核因子-κB、TRAF6及TRIF mRNA的表达。结果　NC组大鼠24 h内眼前节未见炎症反应。注射后24 h,EIU模型组可见虹膜血管扩张明显，瞳孔区大量白色渗出,HPS组仅可见虹膜血管扩张，未见其他眼部炎症反应,HPS+内毒素组大鼠可见虹膜血管扩张和瞳孔缘少量渗出。比较不同组间的大鼠眼部临床炎症反应评分可见，NC组与EIU模型组、HPS+内毒素组、HPS组比较，差异均有统计学意义(均为P＜0.001）；EIU模型组与HPS+内毒素组、HPS组比较，差异均有统计学意义（均为P<0.05）;HPS+内毒素组与HPS组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。RT-PCR结果显示，HPS可降低核因子-κB mRNA和TRAF6 mRNA的表达（P＜0.001），HPS对TRIF的表达无明显影响（P=0.236）。结论　HPS可能通过抑制TRAF6核酸的表达缓解EIU的炎症反应,HPS对TRIF的表达无明显影响。     

α-硫辛酸治疗大鼠视网膜缺血再灌注损伤Fas/FasL的表达与细胞凋亡的关系

目的:探讨Fas/FasL在大鼠视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia reperfusion injury,RIRI)中的表达与细胞凋亡的关系及α-硫辛酸(α-LA)的治疗作用。方法:采用升高眼内压的方法建立RIRI模型,将54只SD大鼠随机分为正常组、缺血再灌注(IR)组和α-LA干预组,IR组及α-LA干预组在12,24,48,72h光镜观察视网膜内层厚度及神经节细胞丢失,TUNEL法检测视网膜神经细胞凋亡,免疫组织化学法检测视网膜组织Fas/FasL蛋白的表达。结果:IR组视网膜内层变薄,神经节细胞数目减少。细胞凋亡出现于再灌注后12h,并逐渐递增,24h达到高峰,48h开始下降。Fas/FasL表达与凋亡的神经细胞改变基本一致。α-LA干预组视网膜内层厚度和神经节细胞数目有一定恢复。凋亡细胞在12,24,48h组明显低于IR组(P<0.05);Fas表达在12,24h组较IR组显著下降(P<0.05);FasL表达在12,24,48h组较IR组明显下降(P<0.05)。结论:Fas/FasL系统参与RIRI,导致神经节细胞凋亡;α-LA可下调Fas/FasL表达,减少神经节细胞凋亡。     

大鼠眼内组织对内毒素特异敏感的原因

内毒素诱导的葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)是革兰氏阴性菌感染相关的人类内源性葡萄膜炎的常用模型。然而在全身注射内毒素诱导的大鼠EIU中,尽管眼内组织表现出明显炎症,但在其它器官组织观察不到明显的病理组织学变化。大鼠眼内组织选择性被内毒素感染的现象提示,其眼内组织对内毒素可能具有某种未知的特殊敏感性。本文就大鼠眼内组织对内毒素特异敏感的可能原因进行综述分析,以期能为临床治疗葡萄膜炎提供新思路。     

TLR4-MyD88在大鼠急性前葡萄膜炎虹膜中的表达

目的观察内毒素诱导的大鼠急性前葡萄膜炎（EIU）虹膜组织内Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）及核因子-κBp65（NF-κB p65）的表达。方法Wistar大鼠50只,随机分为5组,0、12、24、48、72h,每组10只。0h组为正常对照组,其余4组均足垫部注射霍乱弧菌内毒素脂多糖（LPS）200μg,建立EIU动物模型,每隔2h用裂隙灯观察大鼠眼前节炎症反应。通过铺片免疫组织化学染色,检测虹膜睫状体组织内TLR4、MyD88和NF—κB p65的表达,并对虹膜内TLR4^＋和MyD88^＋及NF—κB p65^＋细胞进行计数。结果注射后24～48h大鼠眼前段的炎症反应达到高峰,72h炎症反应逐渐缓解。组织病理学检查表明,虹膜睫状体组织的炎性细胞浸润在24～48h达到高峰,与临床反应结果相符。TLR4在模型鼠虹膜睫状体炎复合体中表达的免疫组织化学检测结果表明,0h组虹膜铺片内无阳性细胞,12h后可见细胞形态大多为类圆形的阳性细胞,48h达高峰,72h阳性细胞数开始减少,各组阳性细胞数总体差异有统计学意义（F=46．79,P〈0．05）。MyD88和NF—κB p65的表达与TLR4的改变趋势相一致（F=54．37,P〈0．05;F=85．32,P〈0．05）。结论内毒素诱导的EIU虹膜内,TLR4及其下游信号传导分子的表达量发生改变,提示TLR4-MyD88依赖传导途径可能参与了EIU的发病.     

视网膜抗原免疫联合内毒素诱导的新的EAU小鼠模型

背景 葡萄膜炎的发病机制和治疗仍是目前的研究热点,但多年来该领域的基础研究仍是沿用传统的造模方法制备相关的动物模型,与人类的葡萄膜炎自然病程有较大偏差. 目的 本研究用大肠杆菌内毒素,即脂多糖（LPS）替代百日咳毒素（PTX）作为主要诱发因素,建立更符合人类自然发病环境的新型实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）的动物模型,并与传统的造模方法进行比较,为研究该病的发病机制和有效的治疗方案提供实验依据.方法 6～8周龄的无特定病原体级雌性C57BL/6（H-2b）小鼠20只,按随机数字表法分为正常对照组、单纯内毒素注射组（EIU组）、多肽＋完全弗氏佐剂（CFA）注射组（EAU组）、多肽＋CFA＋LPS组（LPS-EAU组）.LPS-EAU组先用人类光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP 1-20）＋CFA免疫小鼠,免疫后第7天小鼠足底注射LPS,诱发小鼠EAU模型.采用组织病理学损害、眼球组织病理学评分、迟发型过敏反应、特异性淋巴细胞增生反应等评价指标对动物模型进行鉴定,并与LPS诱导的EIU及IRBP 1-20＋ CFA免疫诱导的EAU进行比较.结果 正常对照组小鼠虹膜睫状体及视网膜组织结构未见异常;EIU组小鼠虹膜睫状体可见轻微血管扩张、蛋白及纤维素渗出,但玻璃体和视网膜组织内未见血管异常及炎症反应;EAU组小鼠虹膜睫状体未见血管扩张及炎性渗出,但可见视网膜轻微血管周围炎及神经纤维层肿胀;LPS-EAU组小鼠视网膜结构紊乱,可见较多的炎性细胞浸润、光感受器细胞损伤及视网膜全层破坏.正常对照组小鼠和EIU组小鼠病理评分均为0分,EAU组病理评分为0.5分,而LPS-EAU组小鼠病理评分为3.0分,显著高于EAU组,差异有统计学意义（U=16.246,P=0.001）.LPS-EAU组小鼠耳廓增厚值为（35.60±0.55） tm,显著高于EIU组小鼠的（12.60±0.55）μm,差异均有统计学意义（q=23.003,P＜0.01）;但与EAU组小鼠的（34.80±0.84）μm比较,差异无统计学意义（q=0.820,P＞0.05）.LPS-EAU组小鼠的脾细胞体外培养的克隆数显著增加,其3 HTdR掺入值（CPM）为（8 540.00±54.77）/min,而EAU组的cpm为（8 484.00±47.75）/min,差异无统计学意义（q=56.634,P=0.069）,但与EIU组的cpm（2 050.00±50.00）/min比较,LPS-EAU组明显升高,差异有统计学意义（q=195.683,P=0.000）. 结论 LPS可以成功诱发小鼠的EAU,该动物模型在模拟病因方面更符合人类自然发病环境,为研究人类EAU的病因和发病机制提供了一个可能更好的动物模型.     

FasL抑制剂对大鼠角膜移植术后角膜细胞凋亡及Treg的影响

目的：探索大鼠角膜移植术后玻璃体腔内注射FasL抑制剂对角膜细胞凋亡，角膜Fas、FasL表达，全血和颈部淋巴结中Treg数量及排斥反应指数的影响。

方法：将24只SD大鼠24眼行穿透性角膜移植术，术后随机分为玻璃体腔内注射PBS组(12只12眼)、FasL抑制剂组(12只12眼)，每周记录角膜排斥反应指数，术后1、3、5wk取全血、颈部淋巴结检测Treg数量，取角膜组织测Fas、FasL表达及凋亡细胞数量。

结果：FasL抑制剂组角膜Fas、FasL表达较PBS组明显下降(均P<0.05)； FasL抑制剂组角膜细胞凋亡较PBS组明显减少，FasL抑制剂组术后5wk凋亡最少； 术后3wk开始FasL抑制剂组Treg数量较PBS组明显升高(均P<0.05)，FasL 抑制剂组角膜移植排斥反应评分明显低于PBS组(均P<0.05)。

结论：大鼠角膜移植术后玻璃体腔内注射FasL抑制剂可减少角膜各层细胞凋亡，增加全血、颈部淋巴结中Treg的数量，减轻排斥反应。     

Endotoxin-induced uveitis in the rat. The significance of intraocular interleukin-6.

The potential role of interleukin-6 (IL-6) was studied as an inflammatory mediator of endotoxin (or lipopolysaccharide [LPS])-induced uveitis (EIU) in the rat. In young Lewis rats, levels of intraocular IL-6, but not serum IL-6, correlated with the severity of uveitis and with aqueous humor protein levels in response to foot pad injections of LPS (P less than 0.001). Adult Lewis rats did not develop uveitis and had no intraocular IL-6, although IL-6 was released systemically. Resistance to EIU and absence of IL-6 levels in the aqueous humor, despite the ability to release serum IL-6, also were observed in brown Norway rats, irrespective of age and weight. Intravitreal injection of as little as 1 ng of human recombinant IL-6 induced uveitis in young Lewis rats. In adult Lewis rats, and in young animals made tolerant to LPS, intravitreal IL-6 still caused substantial leakage of plasma proteins into the anterior chamber but no influx of inflammatory cells. As early as 2 hr after intravitreal injection of IL-6, immunohistochemical analysis showed invasion of the iris, corneal stroma, and anterior chamber by polymorphonuclear leukocytes (PMN) and expression of major histocompatibility complex (MHC) class II antigen in the retina by large cells that were macrophage-marker ED2 negative. This was followed by massive PMN infiltration of the retinal layers and vitreous. The MHC class II antigen expression of ciliary and iris epithelium occurred at a later stage (greater than 8 hr).(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

Effect of human cationic antimicrobial protein 18 Peptide on endotoxin-induced uveitis in rats

PURPOSE. Human cationic antimicrobial protein 18 (hCAP18, 18 kDa) was originally identified in leukocytes on the basis of its antimicrobial activity. The peptide composed of the 27 C-terminal amino acids of hCAP18 (hCAP18(109-135)) binds lipopolysaccharide (LPS). The purpose of the present study was to investigate the effects of hCAP18 peptide on endotoxin-induced uveitis (EIU) in rats. METHODS. EIU was induced by footpad injection of LPS. Each rat was injected intravenously with 1, 10, or 100 micro g hCAP18 peptide in 0.1 mL of PBS immediately after LPS injection in male Lewis rats. At 24 hours after LPS injection, enzyme-linked immunosorbent assay was performed to evaluate concentrations of protein, nitric oxide (NO), tumor necrosis factor (TNF)-alpha, prostaglandin (PG)-E2, interleukin (IL)-6, monocyte chemoattractant protein (MCP)-1 and macrophage inflammatory protein (MIP)-2 in aqueous humor. Also, EIU was evaluated by counting inflammatory cells in aqueous humor. RESULTS. hCAP18 peptide at 10 and 100 micro g significantly suppressed an LPS-induced increase in the number of inflammatory cells and the levels of protein, NO, TNF-alpha, PGE2, MCP-1, and MIP-2. The anti-inflammatory effect of 10 micro g hCAP18 peptide was as strong as that of 100 micro g hCAP18 peptide. Treatment with 1 micro g hCAP18 peptide did not suppress EIU, compared with the LPS group. CONCLUSIONS. The present results indicate that hCAP18 peptide suppresses development of EIU. A possible mechanism for the ocular anti-inflammatory effect of hCAP18 peptide is that it suppresses onset of LPS-triggered inflammatory reactions by binding directly to LPS.