乙肝病毒X蛋白与肝细胞肝癌

乙肝病毒（hepatitis B virus，rmv）慢性感染是肝细胞肝癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）的重要原因之一。HBV慢性携带者发生肿瘤的相对危险性明显增加。现有研究表明：HBV诱导HCC的机制主要涉及HBVDNA与肝细胞基因组的整合以及乙肝病毒X蛋白的致癌作用。X蛋白是乙肝病毒X基因的表达产物，具有反式激活功能，可通过从转录水平激活细胞生长调节基因、对细胞调亡的调节、抑制受损DNA的修复等机制导致HCC的发生，X蛋白的这些作用通过其与细胞内其他蛋白质的相互作用以及激活细胞内的信号传导通路来实现。另外，HBV基因序列内的突变也可能在肝癌的发生中起重要作用。本文就近年来该方面的研究进展作一综述。     

HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响

目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)%,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)%,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)%表达,P<0.01。转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。     

Transfection of HBV X gene into human liver cell line L02 and its effect on CⅡTAand HLA-DR expression

目的 探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响.方法 构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平.RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别.结果 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)％,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)％,P＜0.01.脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)％,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)％表达,P＜0.01.转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达.结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2 -EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达.     

pHGF对CBMC表面标志表达的影响

目的 :为了再次证明pHGF的免疫功能。方法 :应用免疫组织化学法测定pHGF对脐血单个核细胞表达CD4、CD8、HLA DR分子的影响。结果 :证明pHGF均能促进上述分子在脐血单个核细胞表面的表达。与pHGF诱导前相比较 ,CD4、CD8、HLA DR分子的表达增加了 3～ 4倍。结论 :提示pHGF能促进机体免疫功能的成熟     

乙型肝炎病毒诱导HLA-G的表达及其临床意义

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）诱导人类白细胞抗原-G（HLA-G）的表达及其临床意义。方法：采用实时RT-PCR的方法检测HBV感染患者外周血中HBV的载量,并采用ELISA法检测HBV感染患者外周血可溶性HLA-G（sHLA-G）的含量。HBV不同载量及多个时间点作用单核细胞（THP-1）,采用RT-PCR和Westernblot法检测HLA-G的诱导表达情况。结果：HBV感染患者外周血sHLA-G表达水平显著高于正常献血员（P＜0.01）。体外研究发现,HBV经1d即可诱导THP-1细胞HLA-GmRNA转录增强以及诱导HLA-G蛋白表达,且在第4天达到最大值。结论：HBV增强单核细胞HLA-G基因转录,诱导单核细胞表达HLA-G蛋白,从而使HLA-G参与调节HBV病毒免疫逃逸。     

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制

目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.     

辐射对淋巴瘤EL-4细胞p21基因转录及蛋白表达的影响

目的观察辐射对淋巴瘤EL-4细胞P21蛋白表达及基因转录的影响。方法应用RT-PCR方法检测经辐射诱导的淋巴瘤EL-4细胞中p21基因转录的时程和量效变化,采用流式细胞术检测P21蛋白表达的时程和量效变化。结果 4.0Gy X射线照射后p21基因转录水平立即增高,至照射后4 h达峰值,持续至照射后24 h。4.0 Gy X射线照射后8 h EL-4细胞p21蛋白表达开始增高,24 h达峰值,持续至照后72 h(<0.01)。0.5～6.0 Gy X射线照射后4 h,EL-4细胞p21基因转录水平均高于对照组,其中以4.0 Gy X射线照射后基因转录水平最高,1.0～6.0Gy X射线照射后,EL-4细胞p21蛋白表达均明显增高(<0.05)。结论辐射可诱导淋巴瘤EL-4细胞P21蛋白表达及基因转录,并呈时间和剂量依赖关系。     

乙型肝炎病毒对miR-10b表达的影响及其生物信息学分析

目的 应用生物信息数据库分析和分子生物学方法检测乙型肝炎病毒(HBV)对微小RNA(miR-10b)表达的影响,以及生物信息学方法探讨HBV影响的miR-10b异常表达在肝脏疾病中的作用.方法 以GEO2R分析miRNA表达芯片GSE19980中miR-10b的表达水平,荧光定量聚合酶链反应(PCR)验证分析结果.Targetscan、miRTarBase、miRDB和DIANA TOOLS分析miR-10b的靶基因并用韦恩图进行筛选.应用DAVID数据库对miR-10b靶基因数据集进行基因本体(GO)功能富集分析.采用STRING分析软件进行KEGG信号通路分析.GEO2R分析HBV诱导的肝细胞癌及其邻近正常组织的差异表达基因,并与miR-10b靶基因进行韦恩图筛选以获得交集靶基因,然后用STRING分析蛋白质的相互作用,得到miR-10b靶基因的核心蛋白基因.结果 miR-10b在稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞中表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05);miR-10b靶基因主要富集在转录调控、转录因子活性、参与转录因子复合体等相关蛋白基因;miR-10b的靶基因富集在蛋白多糖、miRNA、cAMP信号通路;miR-10b靶基因编码蛋白的相互关系分析获得CREB1、NCOA6、NCOR2、PIK3CA、GATA3、MAPRE1、TIAM1等核心蛋白,其功能涉及糖稳态调节、炎症、肿瘤发生和发展.结论 HBV上调miR-10b表达,高表达的miR-10b对其靶基因的沉默可能在HBV感染的肝脏疾病中发挥着重要作用.     

IFN-γ、IL-10对人类视网膜色素上皮细胞表面HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1表达的影响

目的　研究γ干扰素(IFN γ)、白细胞介素10 (IL 10 )对体外培养人类视网膜色素上皮(HRPE)细胞免疫活性的影响。　方法　采用流式细胞术检测IFN γ、IL 10对HRPE表面人白细胞抗原(HLA) ABC、HLA DR和胞间黏附分子 1(ICAM 1)表达的影响。　结果　HRPE基础性表达HLA ABC ,低表达HLA DR。IFN γ可增强HRPEHLA ABC、HLA DR和ICAM 1的表达(P <0 .0 0 1) ;IL 10对HRPE基础性HLA ABC、HLA DR和ICAM 1的表达无影响(P >0 .0 5 ) ;IL 10可明显下调IFN γ诱导HRPEHLA DR的表达(P <0 .0 0 1)。　结论　IFN γ可增强HRPEHLA ABC、HLA DR和ICAM 1的表达,参与HRPE移植后的免疫排斥和炎症反应;IL 10可降低HRPEHLA ABC、HLA DR和ICAM 1的表达,抑制抗原呈递,诱导HRPE移植时免疫耐受或免疫赦免。     

HBV X蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的:初步探讨HBV X蛋白表达对转染X基因HepG2细胞的影响。方法:磷酸钙沉淀法转染真核表达质粒pCDNA3.1(+)/x到人肝癌细胞株HepG2;72 h后,Western-blot检测X蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;MTT法测定细胞活力。结果:磷酸钙沉淀法能有效的导入X基因且Western-blot能检测到X蛋白表达;MTT法、流式细胞术结果显示X蛋白表达组细胞活力受抑制(P<0.01),凋亡率增加(P<0.01)。结论:HBV感染及其相关慢性肝病中,X蛋白的表达可能与肝细胞凋亡,炎症活性相关。     

乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的重组慢病毒载体pRRLsincPPT-hPGK-X-IRES-eGFP-WPRE(pRRL-X),并感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,以验证其在体外的感染效率.方法 采用PCR技术扩增出HBV X基因的DNA片段,用IN-Fusion技术构建表达载体pRRL-X并鉴定,j...     

EFFECTS OF HBV preS AS A HUMORAL ENHANCER ON THE ABILITIES OF HCV E2 PROTEIN TO INDUCE IMMUNE RESPONSESIN THE DNA-IMMUNIZED MICE

Objective. To study whether the abilities of hepatitis C virus (HCV) E2 gene immunization to induce humoral and cellular immune responses to E2 protein were affected by hepatitis B virus (HBV) preS gene when they were fused in DNA-immunized mice.Methods. Mice were immunized with E2, preS-E2(preS gene was upstream of E2 gene), and E2 - preS (preS gene was downstream of E2 gene)gene by their eukaryotic expression vectors, respectively. The anti - E2 or anti - preS antibodies were detected using the E2 and preS antigens. The cellular immune response to E2 protein in immunized mice was presented by its survival time after injecting SP2/O myeloma cells expressing HCV E2 protein into the abdominal cavity.Results. Chimeric E2 and preS gene immunization can induce mice to develop anti-preS and anti-E2 antibodies. The number of the mice developing anti-E2 antibody and the antibody titers in preS-E2 gene-injected group were higher than those in E2-preS gene-immunized group. However, the mice injected with E2 gene     

乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病状态的关系

目的通过定量分析HLA-A*2402限制性的乙型肝炎病毒(HBV)特异性的细胞毒性T细胞(CTL)来研究急性自限性和慢性持续性乙型肝炎患者体内免疫反应的差异。方法从急性和慢性乙型肝炎感染患者外周血中提取外周血单个核淋巴细胞(PBMC),用HLA-A*2402-HBV肽链四聚体复合体染色后,用流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞。同时使用酶联免疫斑点法来检测部分患者的CTL细胞分泌干扰素(IFN)-1的水平。结果在7例急性乙型肝炎的急性期,可以检测到高水平的HBV特异性的CTL细胞,而在急性乙型肝炎的恢复期,HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降。在13例慢性乙型肝炎患者中,除了1例慢性肝炎急性暴发患者之外,均不能检测到HBcAg特异性CTL细胞。IFN-γ的分泌与这些结果相一致。结论HBcAg特异性CTL细胞在急性肝炎患者清除乙型肝炎病毒的过程中可能起到至关重要的作用。     

HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究

目的通过HBV体外感染22周龄原代培养人胎肝细胞,比较常用检测指标的敏感性和特异性.方法利用HBV阳性血清感染体外培养的原代人胎肝细胞.应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中cccDNA.结果胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2天出现阳性,培养上清和细胞中HBVDNA定量自第4天起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6天出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9天出现阳性.结论HBV在原代培养人22周龄的胎肝细胞中能够稳定复制和表达,各种检测指标的灵敏性和特异性不一,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg敏感性好,特异性可.     

乙型肝炎病毒X基因克隆及其表达

目的：构建乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,并诱导其表达。方法：从乙肝病人血清中提取HBV DNA;以带有EcoRI和Hind〖KG-*3〗Ⅲ酶切位点的引物,用PCR方法扩增X基因;而后定向克隆到原核表达载体pMAL-C2X上,经酶切鉴定和序列分析;以IPTG诱导X融合蛋白的表达。结果：PCR扩增显示有类似HBV X基因片断大小的条带;构建的原核表达重组体PMAL-C2X-HBV-X经酶切有相应大小的的基因插入片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因;这一重组体在IPTG诱导下有相应大小的X融合蛋白表达。结论：成功构建了HBV X基因原核表达重组体pMAL-C2X-HBV X;在IPTG的诱导下,该重组体在大肠杆菌中可表达X融合蛋白,为进一步纯化HBV X蛋白和研究其生物学作用奠定了基础。     

HDV/HBV体外感染原代培养人胎肝细胞的实验研究

目的：建立ＨＤＶ／ＨＢＶ感染人胎肝细胞体外培养系统。方法：利用ＨＤＶ／ＨＢＶ阳性血清同时感染体外２的人胎肝细胞;应用ＥＬＩＳＡ、免疫组化法、原位杂交法和斑点法检测上清液和细胞中ＨＢｓＡｇ、ＨＤＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ和ＨＤＶｃＤＮＡ。结果：上清液和细胞中ＨＢｓＡｇ、ＨＤＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ和ＨＤＶｃＤＮＡ在感染后第２天至第１６天均可测出,其中上清液中ＨＢｓＡｇ、ＨＤＡｇ以感染后第４天至第１２天达高峰,结论     

肝细胞内HBV DNA、基因产物表达及其与肝细胞坏死灶的关系

应用原位分子杂交方法分析慢性乙肝患者肝细胞内乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)。发现肝内HBV DNA复制部位往往与HBsAg或HBcAg表达部位相同;HBsAg与HBcAg同时在肝内表达时,数量多不均衡,提示编码HBsAg与HBcAg基因数量或复制活性不同;且观察到含HBV DNA的肝细胞数明显超过表达HBsAg、HBcAg的肝细胞数,提示胞浆HBV DNA一部分可能处于复制期,另一部分为非复制期:肝内HBV DNA复制与HBsAg、HBcAg表达对应的部位常紧紧毗邻肝细胞坏死灶,两者频率相似。     

HBV S-ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞功能的影响

目的探讨HBVS—ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞（DC）功能的影响。方法分离健康成人外周血单个核细胞,GM—CSF、IL-4诱导培养树突状细胞,培养第5天,以脂质体介导转染,分为pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组、pcD—NA3．1-S转染组、pcDNA3．1转染组及PBS对照组。转染48h收集DC及上清,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA—DR表达水平;CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-12的分泌水平。结果与对照组比较,pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组DC表达CD80、CD86、HLA—DR水平增加,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强,分泌IL-12水平增高。结论HBVS—ecdCD40L融合基因修饰能促进DC活化。增强DC功能,将CD40L胞外段基因与HBV抗原基因融合可能是增强乙肝疫苗免疫效果的有效方法。     

HBV-HCC中HBx与免疫微环境的交互作用

乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）是乙型肝炎病毒X基因（HBX）将自身DNA整合至人基因组,进而合成的多功能蛋白。HBX基因的表达受肝细胞免疫、微环境和机体免疫的监视和调控,其表达的蛋白也可通过激活肝星状细胞、参与机体免疫调节、调控炎性细胞因子和诱导细胞外基质重塑等参与肝细胞癌（HCC）抑制性免疫微环境的形成。HBx与免疫微环境的相互作用是影响乙肝病毒相关肝细胞癌（HBV-HCC）发生、发展的主要因素之一。深入研究HBx与免疫微环境相互作用机制,探索促进HBV-HCC抑制性免疫微环境形成的机制,有助于开发新型抗HCC药物,改善患者预后。本文就HBx与HBV-HCC免疫微环境的研究进展进行综述