用Red系统敲除大肠杆菌O157∶H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157∶H7的突变体。方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除。结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7突变菌株。结论:为进一步研究EHEC O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7Ⅲ型分泌系统的缺陷突变株对HeLa细胞黏附能力的影响

目的：构建O157∶H7 EDL933菌株Ⅲ型分泌系统（ T3SS）缺陷突变株ΔescR,感染HeLa细胞后检测其黏附能力。方法通过重叠延伸PCR扩增出中间为卡那霉素抗性基因,两侧为escR基因上下游同源序列的重组线性DNA片段,电击转入含pKD46的EDL933感受态细胞中,escR基因被kan基因替换而缺失。绘制野生株与ΔescR生长曲线,并利用免疫荧光观察两株细菌对HeLa细胞的黏附能力。结果获得缺陷突变株ΔescR,相较于野生株,该突变株在DMEM（10％FBS）培养基中生长速度以及对HeLa细胞的黏附能力明显下降。结论 T3SS结构蛋白escR基因的缺失破坏了EDL933 T3SS的形成,影响了该菌株黏附能力,其构建为后续研究T3SS奠定了基础。     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139

目的:建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性。方法:选择EHEC O157∶H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(u idA);霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(glycosotransferaseLPSgt)基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰。在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针。随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果:PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论:所研制的同时定性检测EHEC O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。     

O_157∶H_7的研究概况

Ｏ１５７∶Ｈ７的研究概况陈晓旭⒇伊纯德宋绍勇张守峰郝莉萍关键词Ｏ１５７∶Ｈ７中图法分类号Ｒ５９５．７自１９９６年５月份以来，由Ｏ１５７∶Ｈ７引起的食物中毒，在日本国内不同地区相继发生了不同程度的暴发流行，从而，引起了世界各国的高度重视。日本已将Ｏ１５...     

大肠杆菌O157∶H7新蛋白Ecs4563的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7新预测分子伴侣蛋白Ecs4563,以进一步开展其结构与功能的研究.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出分子伴侣基因ecs4563,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现诱导表达,采用Western印迹法进行鉴定,通过Ni2 螯合柱纯化获得目的蛋白.结果:构建了pET-24a-ecs4563重组质粒,实现了目的蛋白的融合表达,Ni2 金属螯合法纯化了目的蛋白,通过Western印迹法验证了融合蛋白的特异性.结论:得到了新预测分子伴侣Ecs4563,为下一步研究蛋白功能,进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

用Red系统敲除大肠杆菌O157:H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157:H7的突变体.方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5'端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除.结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157:H7突变菌株.结论:为进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139

目的：建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性.方法：选择EHEC O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uidA）;霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位（ctxA）、毒力协调菌毛A亚单位（tcpA）、糖基转移酶（glycosotransferase LPSgt）基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰.在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针.随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本.结果：PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏.结论：所研制的同时定性检测EHEC O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法.     

用Red系统快速敲除痢疾杆菌asd基因

目的 :用Red系统快速敲除痢疾杆菌asd基因。方法 :本研究首先合成一对引物 (每一条的 5′端与asd基因同源 ,3′端与氯霉素抗性基因同源 ) ,并用来获得氯霉素抗性基因的PCR产物 ,然后电击转化至大肠杆菌DH5α和痢疾杆菌福氏 2a 2 4 5 7T中 ,在λRed重组系统的帮助下 ,通过氯霉素抗性基因两侧的asd基因序列在体内与asd基因发生同源重组 ,置换了DH5α和 2 4 5 7T基因组中的asd基因 ,最后又利用氯霉素抗性基因两端的FRT位点 ,通过FTP位点专一性重组将氯霉素抗性基因剔除。结果与结论 :获得了asd基因被完全敲除且不带氯霉素抗性基因的大肠杆菌和痢疾杆菌 ,使Red系统在大肠杆菌以外微生物中的应用获得成功。     

新预测的Ⅲ型分泌系统毒力蛋白Z3672的基因克隆、表达及纯化

目的：克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7新预测毒力蛋白Z3672,以进一步开展其结构与功能的研究。方法：利用PCR方法从EHECO157：H7基因组中扩增出基因z3672,构建重组表达质粒,经测序证实后,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现诱导表达,采用质谱分析法和Western印迹试验进行鉴定,通过洗涤包涵体纯化目的蛋白。结果：构建了pET-24a-z3672重组质粒,经酶切及测序鉴定与预期序列一致,实现了目的蛋白的融合表达,并且对蛋白条带的质谱分析证实了表达蛋白即为Z3672蛋白。纯化后目的蛋白的纯度〉90％。结论：得到了新预测的毒力蛋白Z3672,为下一步研究蛋白功能,并进一步研究EHECO157：H7的致病机制奠定了基础。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对人肺鳞癌H157细胞增殖的影响

目的：观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺鳞癌H157细胞增殖的影响。方法：将H157细胞分为对照组和AMOs处理组，AMOs处理组采用AMOs抑制H157细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[^3H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果：与对照组相比，AMOs显著减少H157细胞[^3H]-TdR掺入量（P〈0．01），随着浓度从10nmol／L逐渐增加至于100nmol／L，H157细胞[^3H]-TdR掺入量亦随之减少（P〈0．01）；AMOs显著抑制H157细胞的增殖（P〈0.01），使G0／G1细胞比例显著增加，G2／M期细胞比例显著减少（P〈0．01）。结论：AMOs通过抑制H157细胞内高水平表达miR-155的活性，显著抑制H157细胞的增殖。     

用大肠杆菌制备O157多糖-菌毛蛋白结合物的研究

目的以大肠杆菌O157型多糖与菌毛蛋白PilE为模型,在大肠杆菌中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统,为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗技术提供基础。方法用Red重组技术敲除大肠杆菌W3110的O抗原连接酶基因waaL,构建CLM24菌株。在该菌株中共表达脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白基因pilE、寡糖转移酶基因pglL,构建O-糖基化修饰系统。分别转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL与大肠杆菌O157型多糖表达载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,再利用Western印迹检测菌毛蛋白PilE的修饰情况。结果利用抗His-tag单抗进行Western印迹检测,16℃IPTG诱导条件下,转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL与其他对照菌相比,不仅在相对分子质量为19×103处有特异性条带,而且在相对分子质量（40～60）×103处也出现了特异的梯状条带;转化大肠杆菌O157的O多糖基因簇克隆载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EHpilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157用抗O157多抗和抗His-tag单抗进行Western印迹检测,在相对分子质量（40～60）×103处均产生特异的梯状条带。结论在大肠杆菌中重建的O-糖基化修饰系统可以利用自身的O16型O多糖或异源的O157型O多糖修饰菌毛蛋白PilE,获得多糖-蛋白结合物。本研究为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗提供了技术基础。     

A new method for proton detection of H217O with potential applications for functional MRI

A method is presented for the sensitive detection of minute amounts of H₂¹⁷O. The method is based on the increase of the T₂ of the water protons following an irradiation of the ₁₇O resonance frequency, due to the partial or full decoupling of the ¹H-¹⁷O spin-spin interaction. It is demonstrated that when ¹⁷O concentrations are low, full decoupling is achieved, and at short echo times the increase in the amplitude of the proton echo signal is proportional to the ¹⁷O content of the sample. The potential of the method for indirect ¹⁷O imaging is substantiated by a simple one dimensional projection of cylindrical phantoms containing various ¹⁷O concentrations. Using interleaved sequences with and without ¹⁷O decoupling, errors due to time dependent effects are minimized.     

H7 N9流感病毒血凝素HA在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析

目的：利用毕赤酵母表达制备H7N9流感病毒血凝素[HA 1～525个氨基酸（aa）],并对其免疫原性进行研究。方法经全基因合成获得H7N9流感病毒[A／Hangzhou／1／2013（H7N9）]全长HA,以其为模板,PCR得到片段HA1－525,通过NspⅤ和NotⅠ双酶切连入pPICZαA载体,转入毕赤酵母X33,ELISA筛选阳性克隆。发酵培养后,表达上清经PEG20000沉淀获取HA1－525,并用糖苷内切酶H（ endo H）酶切分析其N-糖链。将制备的HA1－525免疫BALB／c小鼠,经ELISA检测特异性HA7抗体滴度,红细胞凝集抑制实验分析血抑活性。结果培养上清用抗HA7抗体经ELISA检测,重组菌成功表达HA7,且Western印迹检测发现有特异性弥散条带,经endo H 酶切后, HA1－525为均一条带,相对分子质量约58×103,与理论大小相当,表明HA1－525存在甘露糖基化结构。 HA1－525两次免疫小鼠后可产生1∶36000的抗体滴度。以H7N9裂解苗为抗原,检测其血抑活性为1∶700。结论利用毕赤酵母表达的H7N9流感病毒HA1－525可以诱导小鼠产生针对HA7的中和抗体。     

基于荧光碳点的免疫荧光探针构建及其对大肠杆菌的特异性识别

目的：将碳点（ CDs）应用在免疫荧光探针成为取代传统荧光染料的新型标记物。方法通过微波加热方法制备高强荧光碳点,并通过EDC偶联法与大肠杆菌抗体结合形成复合免疫荧光探针,以大肠杆菌O157∶H7为检测模型进行特异性识别实验。结果碳点成功应用在免疫标记大肠杆菌O157∶H7,并可见多色荧光。结论免疫荧光探针成功地识别大肠杆菌O157∶H7,表明碳点可作为免疫荧光探针的荧光标记物,有望制成具有自主知识产权的新型低毒生物传感器。     

Hematocrit and oxygenation dependence of blood 1H2O T1 at 7 tesla

Knowledge of blood ¹H₂O T₁ is critical for perfusion‐based quantification experiments such as arterial spin labeling and cerebral blood volume‐weighted MRI using vascular space occupancy. The dependence of blood ¹H₂O T₁ on hematocrit fraction (Hct) and oxygen saturation fraction (Y) was determined at 7 T using in vitro bovine blood in a circulating system under physiological conditions. Blood ¹H₂O R₁ values for different conditions could be readily fitted using a two‐compartment (erythrocyte and plasma) model, which are described by a monoexponential longitudinal relaxation rate constant dependence. It was found that T₁ = 2171 ± 39 ms for Y = 1 (arterial blood) and 2010 ± 41 ms for Y = 0.6 (venous blood), for a typical Hct of 0.42. The blood ¹H₂O T₁ values in the normal physiological range (Hct from 0.35 to 0.45, and Y from 0.6 to 1.0) were determined to range from 1900 to 2300 ms. The influence of oxygen partial pressure (pO₂) and the effect of plasma osmolality for different anticoagulants were also investigated. It is discussed why blood ¹H₂O T₁ values measured in vivo for human blood may be about 10–20% larger than found in vitro for bovine blood at the same field strength. Magn Reson Med, 70:1153–1159, 2013. © 2012 Wiley Periodicals, Inc.