RNA干扰技术抑制smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨用RNA干扰技术下调smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法：用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA（shorthairpinRNA，shRNA）序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中，构建smad4shRNA表达载体pGenesil—smad4一shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa，经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果：成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil—smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con，三种shRNA重组质粒中pGenesil—smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA及smad4蛋白表达，筛选出的HeLa／shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论：应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad4基因表达及功能的shRNA，smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。     

smad4 shRNA 真核表达质粒的构建及鉴定

 目的 针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法 用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果 3个smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westernblotting均证实：3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论 成功构建了smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

RNA干扰对MDA-MB-231乳腺癌细胞株骨保护素基因表达的抑制作用

目的 构建针对骨保护素（OPG）基因的一个载体编码三条短发夹RNA（shRNA）的真核表达质粒,观察其对MDA—MB-231乳腺癌细胞株OPG表达的抑制作用。方法选择3个针对OPG基因的RNA干扰（RNAi）位点,分别设计合成3对编码相应shRNA的DNA单链,每对单链连接形成双链后分别与线性化载体pGenesil-1．1、pGenesil-1．2、pGenesil-1．3连接形成pGenesil-1．1-shRNAl、pGenesil-1．2-shRNA2、pGenesil-1．3-shRNA3,对以上重组载体反复酶切连接,构建成重组质pGenesil—1．1—1．2-1．3-shRNA1-shRNA2-shRNA3,酶切鉴定和测序无误后,将该质粒转染MDA—MB一231细胞,以G418加压筛选,对转染细胞行单克隆化,稳定转染细胞行RT—PCR和Westernblot检测,确定其对OPG基因表达抑制作用。统计分析采用单因素方差分析和SLD分析法。结果成功构建了pGenesil-1．1—1．2-1．3-shRNA1-shRNA2-shRNA3重组质粒;以该质粒稳定转染MDA—MB-231细胞后其OPGmRNA和蛋白表达均较对照差异有统计学意义（P〈0．05）,RNAi对OPGmRNA和蛋白的表达抑制率分别为91％和73％。结论本研究构建了针对OPG的一个载体编码3条shRNA的真核表达质粒,通过RNAi抑制了MDA—MB-231细胞OPG基因表达,为进一步深入探讨肿瘤细胞自身OPG表达在乳腺癌骨转移发生发展中的作用提供了相关实验基础。     

Livin异构体特异性shRNA对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的：应用构建成功的Livin异构体（BIRC71，BIRC72）短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）真核表达载体转染Hela细胞，探讨其对Livin基因的沉默效应及诱导Hela细胞凋亡的作用。方法：采用脂质体转染法转染Hela细胞，荧光实时定量PCR、Western blotting检测转染前后宫颈癌Hela细胞Livin基因拷贝数和蛋白表达的变化，将shRNA表达载体流式细胞术检测不同时间（24、48、72h）的细胞凋亡率。结果：真核表达载体的转染效率48h较24、72h高；转染pGenesil-1-BIRC71、pGenesil-1-BIRC72后Hela细胞中Livin拷贝数明显减少（P〈0．05），蛋白质表达水平显著降低（P〈0．05）；流式细胞术检测24、48、72h凋亡率，转染LivinshRNA组细胞的凋亡率显著高于对照组（P〈0．05），随时间延长（24→72h）凋亡率相应增加。结论：靶向Livin的shRNA真核表达载体可以有效特异地阻断Livin基因的表达，明显诱导宫颈癌细胞凋亡。     

短发夹RNA抑制肝癌细胞HepG2 COX-2基因表达的探讨

目的：研究shRNA对肝癌细胞株HepG2中COX-2基因表达的抑制作用,同时检测对细胞周期和细胞生长的影响。方法：设计、合成一对环氧化酶-2（COX-2）基因编码的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,定向克隆至质粒载体pGenesil-1,构建抑制COX-2基因的短发夹RNA（short hairpin RNA shRNA）的重组表达质粒pshRNA-COX-2,用脂质体Lipofectamine^TM2000转染肝癌细胞HepG2,经RT-PCR和Westernblot分别检测pshRNA-COX-2重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白抑制效应,流式细胞仪检测细胞周期、细胞计数检测细胞生长变化。结果：pshRNA-COX-2重组表达质粒能够抑制COX-2基因表达。与未转染肝癌细胞HepG2相比,pshRNA-COX-2重组表达质粒转染肝癌细胞后,COX-2 mRNA和蛋白表达明显降低,抑制率分别为69.9%和50.3%;G0-G1期细胞由55.4%上升为77.9%,S期细胞由31.1%下降为16.2%;细胞生长明显减慢。结论：构建的pshRNA-COX-2重组表达载体能够显著抑制COX-2基因表达;引起G0-G1期细胞增多,S期细胞减少,从而阻止肝癌细胞生长。     

APE1shRNA重组质粒的构建及对人乳腺癌细胞生长的影响

目的设计构建靶向脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1（APE1/ref-1）特异性短发卡RNA的真核表达载体,并转染人乳腺癌T47D细胞。方法设计、合成针对APE1的特异性的短链寡核苷酸,构建APE1特异性shRNA的重组质粒,稳定转染人乳腺癌T47D细胞;采用聚合酶链反应和免疫印迹法检测转染前后T47D细胞中APE1的表达。采用四甲基偶氮唑盐法观察T47D细胞的生长情况。结果经酶切和测序鉴定,成功构建APE1特异性shRNA的重组质粒,并能够转染T47D细胞。转染后,APE1在mRNA和蛋白水平表达分别下降约53.1%和60.5%,T47D细胞增殖活性受到抑制。结论运用pGenesil-1.1质粒载体构建的靶向APE1特异性shRNA的重组质粒可以成功转染T47D细胞,有效抑制APE1的表达,并抑制肿瘤细胞的生长。     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

阳离子聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导STAT3-shRNA对前列腺癌生长的抑制作用

目的探讨第5代阳离子聚酰胺-胺型树枝状聚合物(G5-PAMAM-D)作为小发卡RNA (shRNA)真核表达质粒的载体,进行前列腺癌RNA干扰基因治疗的可行性。方法根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)cDNA序列结构,分别设计构建表达EGFP mRNA、STAT3 mRNA的特异shRNA真核表达质粒pSilencing 4.1-EGFP-shRNA和pSilencing 4.1- STAT3-shRNA。在体外以G5-PAMAM-D为载体,将质粒pEGFP-C1和pSilencing 4.1-EGFP-shRNA共转染前列腺癌细胞PC-3、22Rvl,通过观察EGFP表达检测干扰效果以及转染效率;然后,以同样的方式将pSilencing 4.1-STAT3-shRNA转入前列腺癌细胞系,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞生长的抑制作用,丫啶橙染色观察细胞凋亡。制作前列腺癌小鼠模型,将G5-PAMAM-D与质粒pSilencing 4.1-STAT3-shRNA的混合物注射人荷瘤鼠肿瘤内,观察对肿瘤生长的抑制作用。结果体外实验表明,G5-PAMAM-D可将pSilencing 4.1.EGFP-shRNA转入前列腺癌细胞,明显沉默EGFP的表达,并且G5-PAMAM-D可将pSilencing 4.1-STAT3-shRNA有效转入前列腺癌细胞中,明显抑制肿瘤细胞的生长,增加细胞的凋亡。体内实验证明,G5-PAMAM-D/pSilencing 4.1-STAT3-shRNA可抑制荷瘤鼠前列腺癌的生长,而各对照组肿瘤生长无明显抑制。结论G5-PAMAM-D作为基因载体,可将shRNA的真核表达质粒在体内外转入前列腺癌组织细胞,并有效表达shRNA;G5-PAMAM-D可能成为应用前景广阔的小干扰RNA(siRNA)的载体。     

RNA干扰maspin基因对胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响

目的:探讨转染maspin特异性短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)重组质粒对胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响.方法:设计并合成针对maspin基因的shRNA,并将其与真核表达载体pGenesil-1.1连接,构建重组质粒pGenesil-maspin.应用RT-PCR和Western 印迹法检测转染重组质粒后MKN-28细胞中maspin、bcl-2和bax mRNA及蛋白的表达变化,应用FCM法检测转染重组质粒对MKN-28细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响.结果:成功构建maspin特异性shRNA重组质粒pGenesil-maspin1、pGenesil-maspin2及pGenesil-HK(阴性对照); pGenesil-maspin成功转染后可明显下调胃癌细胞MKN-28中 maspin和bax mRNA及蛋白的表达水平(P<0.01),并上调bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01);重组质粒转染后,MKN-28细胞的细胞周期呈现G0/G1期细胞减少(P<0.01),细胞凋亡率下降(P<0.01).结论:外源性maspin shRNA转染MKN-28细胞后能下调maspin的表达,抑制胃癌细胞的凋亡,且使细胞周期分布发生改变;其分子机制可能与上调bcl-2和下调bax的表达有关.     

双干扰质粒共转染对胃癌BAG-1基因亚型表达的抑制作用

目的 构建针对人BAG-1(Bcl-2-associated athanogene 1)基因的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,探讨其对人胃癌SGC-7901细胞BAG-1主要亚型表达的抑制作用及对细胞生长的影响.方法 以人BAG-1 mRNA编码区为RNA干扰靶点,设计2条不同的位于BAG-1基因P29、P33、P46、P50亚型的两个通用外显子上64nt寡核苷酸干扰片段A、B及1条阴性对照片段S,将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至SGC-7901细胞中,设空白对照组(未转染质粒SGC-7901-Un)、阴性对照组(转染阴性对照质粒pGensil-Neg)、干扰组(转染干扰质粒pGensil-BAG1-A和pGensil-BAG1-B),用RT-PCR、Western blot检测BAG-1基因的干扰效果.MTT法检测细胞生长情况并绘制生长曲线.结果 酶切及测序结果证实,pGensil BAG1-A和pGensil-BAG1 B干扰质粒及阴性对照质粒pGensil-S构建成功.质粒在SGC-7901细胞中的转染效率达40％～50％.阴性对照组细胞BAG-1基因表达与空白对照组无明显差异,干扰组细胞BAG-1基因表达较空白对照组显著下降(P＜0.01),表达抑制率在mRNA水平为(63±9.8)％,在蛋白水平对BAG1-P46、BAG1-P32亚型的抑制率分别为(94.3±1.08)％、(66.1±6.5)％.生长曲线表明细胞生长受到了抑制.结论 针对人BAG-1基因的shRNA真核表达质粒pGensil-BAG1-A和pGensil-BAG1-B共转染能高效特异的抑制胃癌SGC-7901细胞中BAG-1主要亚型的表达,并抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长.     

Study on inhibition of growth of ACHN cells via shRNA expression vector-mediated cyclinE1 gene silencing

OBJECTIVE To explore the inhibition of ACHN cells via shRNA expression vector mediated cyclinE1 gene silencing.METHODS The shRNA targeting at cyclinE1 gene was designed and synthesized. By ligation, the fragment was inserted into pGenesil-1-U6 to construct the recombinant plasmid pGenesil-1- U6-cyclinE1. The identified recombinant plasmid was introduced into ACHN cells with lipofectamine 2000. The inhibition of cyclinE1 mRNA and protein expression were analyzed by RT-PCR and western-blotting. MTT method was used for observing cell proliferation and drawing growth curve. The cell cycle and ratios of apoptotic cell were assessed by flow cytometric detection. The ability of invasion and speed of cell migration were detected by transwell chamber invasive models and cell scratch method.RESULTS The inhibition of expression of cyclinE1 in ACHN cells mediated by recombinant vector (0.0933 ± 0.05) was significantly lower than that in the group of transfected with empty vector (0.8827 ± 0.04) and the control group (0.9021 ± 0.03) (P < 0.05). Flow cytometry showed that recombinant cells were blocked in the G1 phase and the apoptotic ratio was increased significantly (11.15 ± 4.00)% (P < 0.05). The curves of cell growth indicated that the proliferation of cell transfected with recombinant plasmid was inhibited significantly compared with that in control group (P <0.05). The results of transwell and cell scratch suggested that the abilities of invasion and migration of the cells transfected with recombinant plasmid were decreased conspicuously (P < 0.05).CONCLUSION The expression of cyclinE1 could be inhibited successfully by RNA interference induced by shRNA expression vector. This consequently inhibits the cell growth and induces apoptosis. Our study provided a preliminary result in searching of RNA interference (RNAi) therapy for renal cell carcinoma.     

Midkine shRNA对胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究shRNA干扰midkine对胃肿瘤细胞SGC7901生物学特性的影响。方法：构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒,采用脂质体2000转染SGC7901细胞,检测细胞的增殖和克隆形成能力以及细胞凋亡情况。结果：与对照组相比,转染重质粒后1—5天,SGC7901细胞增殖明显受到抑制（P〈0．01）,细胞形成克隆数明显降低（P〈0．01）,并且有明显的亚二倍体峰出现（P〈0．05）。结论：针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞SGC7901 midkine表达,细胞增殖及克隆形成能力减弱,细胞凋亡增加,为midkine基因靶向治疗提供一定的实验依据。     

Midkine shRNA对胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响

目的:研究shRNA 干扰midkine对胃肿瘤细胞SGC7901生物学特性的影响.方法:构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒,采用脂质体2000转染SGC7901细胞,检测细胞的增殖和克隆形成能力以及细胞凋亡情况.结果:与对照组相比,转染重质粒后1-5天, SGC7901细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01),细胞形成克隆数明显降低(P＜0.01),并且有明显的亚二倍体峰出现(P＜0.05).结论:针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞SGC7901 midkine表达,细胞增殖及克隆形成能力减弱,细胞凋亡增加,为midkine 基因靶向治疗提供一定的实验依据.     

靶向尿激酶受体uPAR基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

背景与目的：尿激酶受体（uPAR）与肿瘤的侵袭和转移密切相关,抑制uPAR的表达,可以抑制肿瘤的转移。本研究构建uPAR基因短发夹RNA（shRNA）的表达质粒,为舌鳞状细胞癌RNA干涉（RNAi）介导的基因治疗打下基础。方法：根据GenBank数据库提供的uPAR基因序列,选择设计合成能转录shRNA的DNA序列,将它们插入真核表达载体pWH1构建重组质粒,用酶切的方法进行鉴定;最后将构建成功的特异性表达载体（pWH1-uPAR）转染至舌鳞状细胞癌,通过RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot观察其对舌鳞状细胞癌uPAR mRNA和蛋白水平表达的影响。利用MTT实验检测细胞增殖能力的变化。结果：成功构建了uPAR shRNA表达载体;与Ts细胞和转染空载体pWH1的Ts细胞相比,转染pWH1-uPAR表达载体的Ts细胞uPAR mRNA和蛋白的表达明显降低。MTT结果显示uPAR shRNA对Ts细胞增殖的抑制率为32.9%。结论：设计构建的真核表达载体可以特异性干扰uPAR基因的表达,为进一步研究uPAR基因的功能和舌鳞状细胞癌治疗提供有效的方法和手段。     

靶向COX-2的RNA干扰抑制胃癌细胞增殖及相关信号分子改变

目的:本研究初步探讨RNA干扰技术应用于胃癌基因治疗的特异性及作用机制。方法:设计靶向COX-2基因的siRNA,构建重组表达质粒pTZU6 1-siRNA-COX-2并导入胃癌SGC-7901细胞株,在体外诱导RNA干扰,采用RT-PCR和Western blot同时检测处理组和对照组COX-2基因表达,MTT检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期;并用Westernblot检测相关信号分子p53、PCNA及Ki67蛋白表达。结果:体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6 1-siRNA-COX-2导入胃癌SGC-7901细胞株后,胃癌细胞生长明显被抑制;细胞周期相分布发生显著变化,G1/G0期细胞明显减少,S期细胞显著增加;与对照相比,COX-2 mRNA分别下调88.36%和86.24%,COX-2蛋白表达分别下调94.27%和91.59%。p53蛋白表达上调,PCNA及ki67蛋白表达均明显下调。对照组各指标均无明显变化。结论:siRNA明显抑制了COX-2的表达及胃癌SGC-7901细胞增殖,并引起细胞周期改变,可能与上调p53蛋白和下调PCNA及ki67蛋白表达有关。     

干涉RNA抑制人骨肉瘤细胞PCNA表达的实验研究

目的构建增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PC NA)短发夹状RNA表达载体,检测其对骨肉瘤细胞PCNAmRNA及蛋白表达的影响。方法体外构建PCNAshR NA表达载体pSilence2.1neo PCNA,转染骨肉瘤细胞系MG63,RT PCR和免疫组化方法检测转染后PCNAmR NA及蛋白的表达,MTT比色法和集落形成实验检测细胞增殖活性。结果pSilence2.1neo PCNA载体转染能显著抑制PCNAmRNA和蛋白的表达,转染后24、48和72hmRNA表达抑制率分别为68.62%、80.62%和73.12%,PI值分别为空白组的47.72%、23.37%和35.90%。转染后48h细胞增殖的抑制率为68.89%。结论pSilence2.1neo PCNA可显著抑制MG63细胞PCNAmRNA和蛋白的表达及细胞的增殖活性。     

Overexpression of Proliferating Cell Nuclear Antigen in Mammalian Cells Negates Growth Arrest by Serum Starvation and Cell Contact

Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) functions as a processivity factor for DNA polymerase δ, and is expressed at high levels in growing normal and tumor cells. To clarify the relationship between cell proliferation and PCNA expression, we generated NIH-3T3 cells that overexpress PCNA and analyzed the phenotype of these cells. The resulting 3T3-PCNA cells, which overexpressed PCNA, were found to proliferate beyond the saturation density of the parental NIH-3T3 cells. Although NIH-3T3 cell proliferation is arrested under serum starvation conditions, 3T3-PCNA cell proliferation is not arrested by serum starvation. The expression levels of cdk2, cdk4 and cdk6 were the same in 3T3-PCNA and NIH-3T3 cells. The activity of cdk4 was identical for both cell types. However, the activity of cdk2 was higher in serum-starved 3T3-PCNA cells than in NIH-3T3 cells, although the expression of cyclin E decreased in both types of cells, suggesting that increases in cdk2 activity are related to negation of growth arrest in 3T3-PCNA cells. These results indicate that increases in PCNA expression lead to the disruption of growth control and may lead to malignant transformation.