基于matK和ITS2及二级结构对药材香薷及其混伪品的鉴别研究

目的 快速、准确鉴别药材香薷及其混伪品，保障香薷的药材质量和用药安全。方法 收集石香薷、江香薷和香薷植物材料分别进行matK和ITS2序列的扩增与测序，测序结果经Codon Code Aligner软件校对，同时从GenBank下载石香薷、江香斋及其易混品种海州香薷、香薷、密花香薷、牛至等物种的matK和ITS序列。其中，ITS序列经隐马尔可夫模型去除两端的5.8S和28S序列，共得到16个物种的ITS2序列50条；经Clustal软件校对共获得9个物种的matK序列28条。通过Mega7.0软件分析matK和ITS2序列，计算所有物种种内和种间遗传距离，构建邻接法(neighbor joining，NJ)聚类树，通过ITS2 Database预测ITS2二级结构，采用4Sale软件比对二级结构，通过ProfDistS软件构建基于联合ITS2一级序列及其二级结构的剖面邻接(profile neighbor-joining，PNJ)系统发育树。结果 基于matK和ITS2序列的遗传距离均表明香薷正品与其各种混伪品之间存在明显barcoding gap。NJ和PNJ进化树的拓扑关系一致，可以区分药材香薷及其混伪品。香薷的ITS2二级结构与其各混伪品具有显著差异。结论 建议matK和ITS2序列均可以作为鉴别香薷与其混伪品的DNA条形码，ITS2二级结构信息的加入可丰富鉴定结果，为香薷药材的准确鉴别、香薷属与石荠苎属植物的科学分类提供参考。     

基于ITS2条形码鉴定粤产竹根薯及其易混淆品

目的 采用DNA条形码分子鉴定技术鉴定粤产竹根薯（又名竹芋）Marantak arundinacea L.与及其易混淆品（包括飞羽竹芋、苹果竹芋和双线竹芋）,以确保竹根薯药材质量。方法 收集药材样品,对其ITS2序列进行PCR扩增并正向测序,所得序列用Codon Code Aligner软件校对拼接后,利用MEGA 6.05对序列进行分析比对,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法（NJ）构建系统聚类树。结果 竹根薯种内遗传距离明显小于它与其同属的种间遗传距离,基于ITS2序列建立了NJ树,能准确将竹根薯与其混淆品区分。结论 基于ITS2序列可以科学准确地对竹根薯及其易混淆品进行鉴定,为竹根薯的生药鉴别提供新的科学依据。     

安罗替尼联合AP方案治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究

目的 基于线粒体cytochrome coxidase I（CO I）和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法 对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论 形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

基于ITS2序列的三棱及其混伪品的分子鉴定

摘 要 目的：通过分析三棱及其混伪品的ITS2条形码序列,探索鉴定三棱及其混伪品的新方法。方法: 采集三棱及其混伪品共5个物种8个样本,并从Genbank网上下载三棱及其混伪品共6个物种23条ITS2序列,用MEGA5.0软件计算上述ITS2序列的种间、种内遗传距离,并构建系统发育树。结果: 三棱种内最大K2P距离为0.038,与混伪品种间最小K2P距离为0.697。由所构建的系统发育树可以看出,正品三棱的不同样品聚在一支,并能很好地与混伪品区分开。结论:ITS2条形码序列能够成功鉴定三棱与其混伪品,为三棱及其混伪品的鉴别提供了新的方法。     

北沙参及易混品的ITS2分子鉴定

目的北沙参(Glehniae Radix)药材性状与桔梗科(Campanulaceae)的南沙参(Adenophora tetraphylla(Thunb.)Fisch.)、轮叶党参(Codonopsis lanceolata(Sieb et Zucc)Benth.et Hook.)等类似,易产生混淆。作者通过对不同产地北沙参及其混淆品的ITS2(Internal Transcribed Spacer2)分子鉴定,探讨ITS2条形码序列对北沙参药材鉴定可行性。方法对样品进行DNA提取,并运用PCR扩增方法进行ITS2序列扩增,采用双向测序的方法对PCR产物进行测序。测序结果运用DNAMAN软件对测序结果进行拼接,用MEGA5.1软件对序列结果进行分析并建立K2P模型的NJ树,并预测ITS2的二级结构。结果与结论不同产地北沙参的ITS2序列一致,并且从NJ树可明显区分北沙参及其混淆品。     

6种川产姜黄属药用植物叶绿体trnK基因序列变异分析及其分子鉴定

目的建立6种川产姜黄属（Curcuma）药用植物快速简单的分子鉴定方法。方法采用叶绿体赖氨酸tRNA基因（trnK）测序与序列变异分析方法。结果6种姜黄属药用植物（包括姜黄C. longa、莪术C. phaeocaulis、川郁金C. sichuanensis、川郁金C. chuanyujin、川黄姜C. chuanhuangjiang、川莪术C. chuanezhu）完整trnK基因长度在2699～2705 bp。序列可变区包括matK基因编码区和trnK外显子与matK内含子之间区域，共有6个单核苷酸多态性（SNPs）位点、1个9-bp的缺失重复序列和2个4-bp、14-bp插入重复序列。结论trnK基因序列可变位点可以作为6种川产姜黄属药用植物快速简单的分子鉴定标记，并为它们之间种的归并提供了分子依据。     

通关藤及其常见混伪品的ITS2条形码鉴别研究

目的:采用ITS2序列分析,对通关藤及其混淆品进行鉴别,确保用药安全。方法:从GenBank下载通关藤序列,使用MEGA5.0软件对测序序列及下载序列进行对比分析,统计变异位点、计算遗传距离、构建样品NJ树,运用NCBI Blast进行物种鉴定,并与性状鉴别结果进行核对。结果:ITS2序列分析与遗传距离计算结果显示各通关藤样品间有明显差异,NJ树聚类结果能明显区分通关藤正品与伪品。结论:ITS2可准确鉴别通关藤及其伪品,可用于中药材真伪的快速鉴别,应用前景广阔。     

25份燕窝样品的线粒体细胞色素氧化酶I基因序列分析

目的 对多种燕窝进行DNA条形码鉴别，为确定燕窝的基原提供分子依据。方法 对25份燕窝样品的细胞色素氧化酶I（mitochondria cytochrome oxidase subunit I gene，COI）条形码序列进行PCR扩增和测序，分析燕窝正品来源的种内变异，与混伪品的种间变异，以及序列相似性和进化树研究，用Taxon DNA软件评估"Barcoding Gap"。结果 金丝燕种内COI序列变异小，种间存在较多的变异位点，种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出，燕窝不同来源个体均聚在一起，能够与其混伪品区分开。结论 基于COI序列的DNA条形码技术可以用于鉴定燕窝的正品来源及其混伪品。     

中日产川芎的matK、ITS基因序列及其物种间的亲缘关系

目的分析中国产川芎Ligusticum chuanxiong Hort.及日本产川芎Cnidium officinale Makino的核基因组ITS和叶绿体基因组matK序列,为探讨中日产川芎物种间的亲缘关系提供分子依据。方法采用PCR直接测序技术测定川芎和日本川芎的ITS基因和matK基因核苷酸序列并作序列变异分析。结果川芎和日本川芎的matK序列长度均为1268 bp,编码422个氨基酸。ITS1-5.8S-ITS2序列长度均为699 bp,其中18S rRNA基因3′端序列54 bp,ITS1序列215 bp,5.8S rRNA基因序列162 bp,ITS2序列222 bp,26S rRNA基因5′端序列46 bp。根据排序比较,川芎原植物与其商品药材间的matK基因和ITS基因序列完全相同,而川芎与日本川芎间matK基因则仅有1个变异位点,即在上游959 nt处1个转换替代(T→C),反映在氨基酸序列则发生一个非同义取代V(GTG)→A(GCG);ITS基因也仅有1个变异位点,即在ITS1上游54 nt处1个转换替代(T→C)。结论通过进化速率较快的基因序列同源性分析,基本可以认为中日所产川芎基原一致,日本川芎学名似应改为Ligusticum chuanxiong Hort.。     

市售覆盆子药材DNA条形码鉴定研究

目的基于ITS2条形码序列检测市场销售覆盆子药材,为保证覆盆子药材使用的正确性和安全性提供一种新的鉴定手段。方法获取掌叶覆盆子及其5种常见同属易混种ITS2序列,以及GenBank上下载的共计48条序列。使用Gene Tool软件分析ITS2序列长度,GC含量和变异位点等情况,利用Clustal X和MEGA 7.0软件计算遗传距离和构建邻接系统发育聚类树。同时随机检测24份市售覆盆子药材,利用中药材DNA条形码鉴定系统和构建邻接系统发育聚类树确定物种,鉴别真伪。结果掌叶覆盆子基原植物可与其同属易混种进行明显区分;市售药材中正品22份,伪品1份,混合物1份。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术能够成功鉴定市场销售的掌叶覆盆子及其混伪品。     

Commercialized non-Camellia tea: traditional function and molecular identification

Non-Camellia tea is a part of the colorful Chinese tea culture, and is also widely used as beverage and medicine in folk for disease prevention and treatment. In this study, 37 samples were collected, including 33 kinds of non-Camellia teas and 4 kinds of teas (Camellia). Traditional functions of non-Camellia teas were investigated. Furthermore, non-Camellia teas of original plants were characterized and identified by molecular methods. Four candidate regions (rbcL, matK, ITS2, psbA-trnH) were amplified by polymerase chain reaction. In addition, DNA barcodes were used for the first time to discriminate the commercial non-Camellia tea and their adulterants, and to evaluate their safety. This study showed that BLASTN and the relevant phylogenetic tree are efficient tools for identification of the commercial non-Camellia tea and their adulterants. However, some sequences from original plants have not been found and there is a limitation of sequence number of original plants in GenBank. Submitting more original plant sequences to the GenBank will be helpful for evaluating the safety of non-Camellia teas.KEY WORDS: Non-Camellia tea, Traditional function, Molecular identification, BLASTN, Phylogenetic tree     

Medicinal parasitic plants on diverse hosts with their usages and barcodes

Medicinal properties of parasitic plants were investigated by means of ethnobotanical study in some areas of northeastern Thailand. Important traditional usages are: Scurrula atropurpurea nourishes blood, Dendrophthoe pentandra decreases high blood pressure, and Helixanthera parasitica treats liver disease. Their systematics were also determined. The research is based on findings obtained from 100 parasite–host pairs. Of these, eight parasitic species were recorded; they are members of two families, viz. family Loranthaceae, namely D. lanosa, D. pentandra, H. parasitica, Macrosolen brandisianus, M. cochinchinensis and S. atropurpurea, and family Viscaceae, namely Viscum articulatum and V. ovalifolium. In addition, each parasitic species is found on diverse hosts, indicating non-host-parasitic specificity. Species-specific tagging of all species studied was carried out using the rbcL and psbA-trnH chloroplast regions. These tag sequences are submitted to GenBank databases under accession numbers JN687563–JN687578. Genetic distances calculated from nucleotide variations in a couple of species of each genus, Dendrophthoe, Macrosolen, and Viscum, were 0.032, 0.067 and 0.036 in the rbcL region, and 0.269, 0.073 and 0.264 in the psbA-trnH spacer region, respectively. These variations will be used for further identification of incomplete plant parts or other forms such as capsule, powder, dried or chopped pieces.     

Identification of three seagrass species in coral reef ecosystem by using multiple genes of DNA barcoding

Seagrasses constitute a significant part of coral reef ecosystems, representing high primary productivity and one of the most important coastal habitats in marine ecosystems. Though seagrasses possess irreplaceable ecological services to the marine environment, taxonomical ambiguity still exists due to similar morphological characters and phenotypic plasticity. As an emerging technology, DNA barcoding can effectively identify cryptic species using a short orthologous DNA region. In this study, we collected samples from five different locations (Daya Bay, Xincun Bay, Sanya Bay, Xisha Islands, and Nansha Islands), and three seagrass species Cymodocea rotundata, Thalassia hemprichii and Halophila ovalis was evaluated. Moreover, ITS, matK and rbcL genes were used as DNA barcodes. The results indicated that single ITS and concatenated ITS/matK/rbcL both conducted better species resolution than single matK and rbcL. Nevertheless, single ITS was more convenient. Furthermore, in all the four topology trees, three species resolved as 3 clusters as well H. ovalis and T. hemprichii grouped as sister clade. In the meantime, differentiation lay in intra-species based on the result of single ITS and three-locus analysis. Within H. ovalis and T. hemprichii separately, individuals from Xisha Islands first group together, then grouped with individuals from Nansha Islands and/or Xincun Bay and/or Sanya Bay and/or Daya Bay, which indicated that geographical distribution influenced population evolution. However, intra-species differentiation did not emerge in the tree of matK or rbcL.

     

基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品

建立了基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品(全叶青兰和夏枯草)的方法.对维吾尔药材薰衣草及其混伪品的ITS2 序列进行PCR扩增和双向测序,使用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行序列拼接,用MEGA 6.0 软件对拼接后的序列进行多重比对.并计算种内、种间遗传距离,构建NJ 系统聚类树,预测...     

覆盆子及其近缘混淆品的PCR-RFLP鉴别研究

目的 建立一种覆盆子特异性的分子鉴别方法。方法 通过对覆盆子及其混淆品的ITS序列进行测序分析,根据差异位点设计限制性内切酶,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)进行鉴别,建立并优化PCR鉴别方法,并对其稳定性和适用性进行考察与验证。结果 设计的引物可实现对覆盆子及其混淆品序列的扩增,扩增产物为800 bp大小的条带,通过对限制性内切酶MboI进行酶切后的片段长度进行分析,仅覆盆子的序列可被酶切形成2个片段,而混淆品的序列不能被切开,从而特异性鉴别是否为覆盆子。结论 本实验建立的PCR-RFLP方法可用于鉴别覆盆子。     

艾叶及其常见混伪品的分子鉴定

目的：对艾叶及其几种常见混伪品进行分子鉴定。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）法直接测序,对艾及其8种混伪品进行核糖体DNA内转录间隔区片段2（ITS2）扩增并双向测序,所得序列经CodonCodeAligner拼接后,用系统发育软件MEGA4．0进行相关数据分析,同时利用邻接（NJ）法构建系统聚类树。结果：艾叶基原植物艾ITS2序列长度为225bp,种内平均Kimura．双参数（K2P）遗传距离（0．000）小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离（0．022）;由所构建的系统聚类树图可以看出,艾具有单系性,同时又与其他混伪品明显分开。结论：ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别中药材艾叶及其混伪品,可为其质量评价及临床安全用药提供重要的分子鉴别依据。     

ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前

目的：建立以ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前及其同属近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。方法：搜集徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品,采用改良的CTAB法提取DNA,通过实验分别获得ITS2和psbA-trnH序列,将同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到43条ITS2+psbA-trnH复合序列,从GenBank数据库中下载来源于同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到14条ITS2+psbA-trnH 网上复合序列,用MEGA 6.05软件分析徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品的复合序列变异位点,计算种内、种间的K2P距离,并构建NJ系统聚类树。结果：徐长卿、白薇和白前药材ITS2+psbA-trnH复合序列比对后产生17个变异位点;徐长卿、白薇和白前基源物种种内最大K2P距离均小于其与混伪品的种间最小K2P距离;系统NJ树能准确将徐长卿白薇和白前及其近缘混伪品。结论：该研究建立了应用ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇、白前及其近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。     

基于ITS序列鉴别特色民族药材土牛膝及其混伪品的研究

目的:利用DNA条形码对特色民族药材土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝)及其混伪品进行分子鉴定.方法:利用DNA条形码方法,分别对土牛膝及其混伪品的ITS和MatK基因片段进行扩增并双向测序,使用Codon?Code?Aligner软件对扩增序列进行拼接,用MEGA软件对数据比对分析,并基于K2P模型进行遗传距离分析...