慢性房颤患者心房肌细胞钠通道的变化

目的 研究慢性房颤病人心房肌细胞钠通道电流特征及其基因表达.方法 膜片钳全细胞技术记录风湿性心脏病慢性房颤者和窦性心律者心房肌细胞钠通道电流;半定量反转录聚合酶链式反应测量心房肌细胞钠通道α亚单位基因(SCNSA)mRNA的表达.结果 (1)与窦性心律相比,慢性房颤病人钠通道电流密度和恢复动力学无改变,钠通道电压依赖性失活曲线向更正的方向偏移;(2)慢性房颤病人基因表达无改变.结论 慢性房颤病人心房传导速度的减慢不是由于钠通道电流的减小所致.     

缝隙连接蛋白43通过调控L型钙电流参与心房肌细胞的电重塑

目的:观察缝隙连接蛋白43(Cx43)是否通过与L型钙通道共定位,调控L型钙电流,参与房颤(AF)的发病机制。方法:使用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测AF和窦性心律患者心房组织中Cx43的蛋白和mRNA表达差异;用RNA干扰技术沉默心房肌细胞的Cx43表达,实时荧光定量PCR和全细胞膜片钳实验观察对L型钙通道mRNA表达和L型钙电流的影响;免疫共沉淀和激光共聚焦显微成像观察心房肌细胞中Cx43与L型钙通道是否存在共定位。结果:AF患者心房组织中的Cx43表达明显低于窦性心律患者;干扰Cx43表达可明显抑制L型钙电流和L型钙通道α1c亚基的mRNA表达;且心房肌细胞中Cx43与L型钙通道存在共定位。结论:心房肌细胞中的Cx43可通过与L型钙通道形成分子复合物,调控L型钙电流,参与心房肌细胞的电重塑。     

心房颤动患者内向整流性钾电流及Kir2.1 mRNA表达水平的研究

目的：研究心房颤动(房颤，AF)患者心房肌细胞内向整流性钾电流(Ik1)密度及Kir2.1(编码Ik1)mRNA表达水平，初步探讨慢性AF患者心房肌电生理重构机制。方法： 胶原酶Ⅱ两步酶解法分离心房肌细胞，膜片钳全细胞记录法记录离子电流；半定量逆转录聚合酶链反应方法检测心房组织Kir2.1 mRNA表达水平。结果： (1)AF患者心房肌细胞Ik1在超极化状态显著高于窦性心律(SR)组，在膜电位-120 mV时AF组Ik1增加34.04%(P＜0.05)，在-30 mV-+10 mV时其外向电流成分显著增加；(2)以GAPDH为内参标基因，AF组和SR组心房肌Kir2.1 mRNA相对表达量无显著差异(P＜0.05)。结论： AF患者右心房肌细胞Ik1密度在超极化状态显著增加是其电生理重构的重要离子基础之一；AF患者心房肌Kir2.1 mRNA表达水平无显著改变，推测Ik1重构为转录后调节。     

慢性房颤患者心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道的研究

目的： 研究慢性房颤时乙酰胆碱敏感钾通道电流及其基因表达的变化，探讨该离子通道变化在房颤发生与发展中的作用。 方法： 膜片钳全细胞技术记录风湿性心脏病慢性房颤患者和窦性心律患者心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道电流，分析两组的电流密度-电压关系曲线；半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测量心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道基因(Kir3.4)mRNA表达的变化。 结果： （1）与窦性心律组比较，在测试电位-80 mV--120 mV时，慢性房颤组心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道电流密度明显减小。其中测试电位为 -100 mV 时，慢性房颤组电流密度为(-11.665±1.027)pA/pF(n=11)，窦性心律组为(-19.486±0.766) pA/pF(n=11) (P<0.01)。（2）慢性房颤组心房肌细胞Kir3.4 mRNA表达低于窦性心律组54.3%，为0.523±0.301(n=11) vs 0.239±0.102 (n=11), P＜0.01。 结论： 慢性房颤时乙酰胆碱敏感钾通道电流密度的改变与乙酰胆碱敏感钾通道基因表达下调呈正相关，该通道的改变可能与房颤的发生和发展有关。     

心房纤颤患者心房肌Cx43的蛋白表达

目的：研究房颤患者心房肌细胞连接蛋白43(Cx43)的蛋白表达。方法：应用SP免疫组化方法，比较正常和房颤患者心房肌Cx43的表达。结果：(1)正常心房肌细胞Cx43呈斑点状或带状，大量分布于细胞侧连接处。部分位于闰盘处。(2)房颤患者心房肌细胞Cx43颗粒发生重排，杂乱地分布于心肌的各个部位。房颤时间长者，部分Cx43移入细胞质中，表现为某些区域极度增加或减少。(3)房颤患者心房肌细胞Cx43的蛋白表达量未发生显著变化。结论：Cx43在房颤患者心房肌细胞发生重排，呈无序分布，可能是心房纤颤发病的原因之一；并提示房颤仅对Cx43的表达形式产生影响。     

钙网织蛋白促进心脏瓣膜病患者心房重构

 目的: 明确钙网织蛋白的异常表达与分布能否促进心脏瓣膜病患者心房重构的发生。方法: 从78位进行瓣膜置换手术的患者中获得左右心房的标本。患者被分为窦性节律组、阵发性房颤组和持续性房颤组(房颤持续超过6个月),检测心房组织中钙网织蛋白、整合素α5和转化生长因子β1(TGF-β1)的蛋白表达情况。同时使用免疫共沉淀法测定钙网织蛋白与钙调磷酸酶B及整合素α5的结合情况。结果: 房颤组的钙网织蛋白、整合素α5和TGF-β1的蛋白表达均高于窦性节律组,特别是在二尖瓣疾病患者的左心房中。免疫共沉淀显示钙网织蛋白可以与钙调磷酸酶B和整合素α5结合产生相互作用。整合素α5的表达水平与TGF-β1的表达具有明显相关性,钙网织蛋白表达水平与整合素α5和TGF-β1的表达水平具有明显的相关性。在相同心功能分级情况下,钙网织蛋白的表达水平在持续性房颤组明显高于窦性心律组。结论: 房颤患者心房组织中的钙网织蛋白、整合素α5和TGF-β1表达增高,并与房颤类型有关,这提示钙网织蛋白参与了心脏瓣膜病房颤患者的心房重构。     

食管鳞癌中ERK及其活化形式蛋白的表达及意义

目的研究食管鳞癌及食管黏膜组织中的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)及其活化形式蛋白(P-ERK)的表达情况,并与食管癌临床病理特征进行相关性分析,探讨ERK及其活化形式蛋白在食管鳞癌发生发展中的作用。方法采用Western blotting法检测食管癌组织与黏膜组织中ERK及P-ERK蛋白的表达情况,并分别从食管鳞癌患者年龄、性别、病理分化程度、临床分期及淋巴结有无转移等方面进行相关性研究。同时,采用免疫组化SP法从食管鳞癌病理分化程度、临床分期及淋巴结有无转移方面进一步检测ERK及P-ERK与食管鳞癌的相关性。结果由Western blotting法结果可以看出,ERK及P-ERK在食管癌组织中表达明显增强,而在食管黏膜组织中则呈低表达,差异均有统计学意义(P<0.01)。ERK在患者的年龄、性别和分化程度各组间的表达差异无显著性(P>0.05),而在临床分期、淋巴结转移各组间差异有显著性(P<0.05),且T3-4期患者ERK及P-ERK蛋白的表达强度明显高于T1-2期患者;食管鳞癌淋巴结发生转移患者ERK及P-ERK蛋白的表达强度明...     

慢性心房颤动对人心房肌钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的影响

目的：探讨慢性心房颤动(房颤)对人心房肌细胞内游离Ca2+浓度及心肌组织钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ)表达的影响。 方法: 用激光共聚焦显微镜技术，对急性分离的慢性风湿性心脏病伴慢性房颤或窦性心律患者的心房肌细胞内游离Ca2+浓度进行测定，同时用Western blotting法检测心房肌组织CaMKⅡ表达的变化。 结果: 慢性风湿性心脏病伴慢性房颤患者心房肌细胞内游离Ca2+浓度显著高于窦性心律患者［(276.38±38.12）nmol/L vs （122.28±45.63)nmol/L, P<0.05］。慢性风湿性心脏病伴慢性房颤患者心房肌CaMKⅡ的表达明显强于窦性心律患者（10.14±0.31 vs 6.86±0.89， P<0.05）。 结论: 慢性房颤患者心房肌细胞内存在钙超载，Ca2+/CaMKⅡ信号转导途径可能是维持慢性房颤重要的病理生理基础之一。     

Caveolin-1蛋白及ERK1/2信号转导途径在17β-雌二醇抑制血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 研究caveolin-1蛋白及细胞外信号调节激酶（ERK1/2）在17β-雌二醇（E2）抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖中的作用。方法：在培养的VSMCs上,采用［3H］-TdR掺入法、Western blotting观察E2预处理前后血清（FCS）对VSMCs DNA合成及caveolin-1、MKP-1、磷酸化ERK1/2蛋白表达的影响,同时采用RT-PCR技术观察caveolin-1 mRNA的变化。结果：E2作用24 h,可明显抑制FCS诱导的VSMCs增殖。RT-PCR及Western blotting结果显示,FCS可抑制caveolin-1 mRNA及蛋白表达,而E2预处理可增加其表达。同时,Western blotting结果还提示,E2预处理可增加MKP-1蛋白表达,抑制ERK1/2蛋白表达。结论：E2可通过增加caveolin-1及MKP-1蛋白表达,抑制磷酸化ERK1/2活性,促进其降解,来抑制VSMCs增殖。     

芳香烃受体在心房颤动患者心房组织中的表达及意义

目的:检测芳香烃受体(AhR)在风湿性心脏病(风心病)心房颤动患者右心耳组织中的表达,探讨其在心房纤维化中的作用及意义。方法:取风心病换瓣手术患者的右心耳组织为实验组,其中风心病窦性心律组25例和风心病慢性房颤组11例;取先天性心脏病(先心病)心脏手术患者的右心耳组织12例作为对照组。采用Masson染色法检测右心耳组织胶原含量,采用免疫组化技术检测AhR、AhR核转位蛋白(ARNT)和CYP1A1蛋白的表达和分布,采用实时荧光定量PCR检测AhR、ARNT和CYP1A1的mRNA表达,采用Western blot检测AhR、ARNT和CYP1A1的蛋白表达。结果:与先心病组相比,风心病窦律组和风心病慢性房颤组胶原含量和AhR、ARNT、CYP1A1的表达明显增高;与风心病窦律组相比,风心病慢性房颤组胶原含量和AhR、ARNT、CYP1A1的表达明显增高(P0.05)。结论:风心病患者心房组织中AhR的表达与纤维化程度相关;AhR/ARNT/CYP1A1在风心病患者中表达增加,可能参与风心病心房纤维化的发生发展。     

心房颤动致犬肺静脉肌袖缝隙连接蛋白40表达降低

目的探讨心房颤动时犬肺静脉肌袖缝隙连接蛋白40和43(Cx40,Cx43)基因及蛋白表达的变化及其意义。方法17只杂种犬随机分为心房颤动组(11只)和对照组(6只),房颤组经颈外静脉将电极置入右心耳快速起搏(400次/分)8周复制房颤模型,开胸取右上肺静脉近心房1cm内组织,用荧光实时定量PCR及Western blot技术检测缝隙连接蛋白40和43(Cx40,Cx43)mRNA及蛋白的表达量。结果房颤组和对照组犬肺静脉肌袖组织Cx40和Cx43的mRNA表达无显著性差异,房颤组Cx40蛋白表达明显低于对照组(P<0.05),Cx43蛋白表达无显著性差异。结论房颤可使肺静脉肌袖Cx40蛋白表达降低,缝隙连接发生重构,从而促进房颤的维持和稳定。     

钙激活蛋白酶系统与慢性房颤犬心房重构关系的研究

目的： 探讨慢性房颤犬心房肌钙激活蛋白酶（calpain）系统表达水平的改变及其与心房重构的相关性。方法： 17只杂种犬随机分为心房颤动组（11只）和对照组（6只），于起搏前后均进行经胸超声心动图检查，测量舒张期左房内径。房颤组经颈外静脉将电极置入右心耳快速起搏（400 beats/min）8周复制房颤模型，开胸取心房组织，测定心房肌Ca2+浓度，用荧光实时定量PCR和Western blotting技术检测calpain及其抑制剂calpastatin mRNA和蛋白的表达量。结果： 房颤组心房肌Ca2+浓度升高，左房内径显著大于起搏前及对照组(P<0.05)，房颤组和对照组比较犬心房肌calpainⅠ、calpainⅡmRNA表达无显著差异(P＞0.05)，房颤组calpastatin mRNA表达明显高于对照组(P<0.05)；房颤组calpainⅠ、calpainⅡ蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)，calpastatin蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)。CalpainⅠ、calpainⅡ蛋白表达水平与左房内径呈显著正相关(r=0.53，r=0.67,P<0.05)，calpastatin蛋白表达水平与左房内径呈显著负相关(r=-0.74，P<0.05)。结论： 房颤所引起calpain系统的蛋白表达改变，使calpain/calpastatin系统相互间作用失衡，造成多种蛋白被降解可能是心房重构的重要机制。     

Possible involvement of TGF-β/periostin in fibrosis of right atrial appendages in patients with atrial fibrillation

Atrial fibrosis contributes to development and recurrence of atrial fibrillation (AF). TGF-β and periostin have been reported to be involved in fibrogenesis. Here we investigated the role of TGF-β and periostin in atrial fibrosis of AF and in the recurrence of AF after surgery ablation. Western blot, Masson staining, immunohistochemistry and colorimetry were performed to detect the degree of atrial fibrosis and the expression of TGF-β, periostin and collagens in 70 biopsies of right atrial appendage (RAA) obtained in this study. Then the patients who received surgical ablation were followed up for about one year. The results showed an increasing gradient of atrial expression of TGF-β, periostin and collagens paralleled by a higher level of atrial fibrosis in control, SR and AF groups. The expression of TGF-β and periostin was significantly correlated with fibrotic markers. In addition, LAD and the expression of TGF-β were larger or higher in recurrence group than that in nonrecurrence group after surgery ablation. The results suggest that upregulated expression of TGF-β and periostin in RAAs is correlated with the degree of atrial fibrosis in patients with AF.     

HIV impairs TNF-alpha release in response to Toll-like receptor 4 stimulation in human macrophages in vitro

The molecular mechanisms for increased risk of bacterial pneumonia in HIV+ persons remain incompletely understood. Recognizing the critical role of Toll-like receptor (TLR) signaling in host defense, this study showed that human U937 macrophage stimulation by the TLR4-specific ligand, lipid A (biologically active component of bacterial LPS), promoted TNF-alpha release through extracellular regulated kinase (ERK)1/2 mitogen-activated protein (MAP) kinase phosphorylation. In contrast, HIV+ U1 macrophages had significantly reduced TNF-alpha release (despite preserved TLR4 expression) and reduced ERK1/2 phosphorylation, whereas TNF-alpha release was intact via a TLR4-independent pathway. In HIV+ U1 cells, reduced ERK1/2 phosphorylation was not due to reduced upstream MEK1/2 activation, but was associated with a reciprocal induction of MAP kinase phosphatase-1 (MKP-1). HIV nef protein was sufficient to reduce TNF-alpha release and induce MKP-1 in healthy macrophages. Pharmacologic inhibition of endogenous cellular phosphatases increased ERK1/2 phosphorylation and partially restored TLR4-mediated TNF-alpha release in HIV+ macrophages. Furthermore, targeted gene silencing of MKP-1 partially restored lipid A-mediated TNF-alpha release in HIV+ U1 cells. Similar results were observed using clinically relevant human alveolar macrophages, comparing healthy to asymptomatic HIV+ persons at clinical risk for bacterial pneumonia. Thus, reduced TLR4-mediated TNF-alpha release through altered ERK1/2 regulation by HIV may impair an effective innate immune response to bacterial challenge. Inhibition of cellular phosphatases may serve as a potential therapeutic target in the management of bacterial pneumonia in HIV+ persons.     

Asbestos-induced MKP-3 expression augments TNF-alpha gene expression in human monocytes

TNF-alpha is associated with the development of interstitial fibrosis. We have demonstrated that the p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase regulates TNF-alpha expression in monocytes exposed to asbestos. In this report, we asked if extracellular signal-regulated kinase (ERK) was also involved in TNF-alpha expression in monocytes exposed to asbestos. We found that p38 and ERK were differentially activated in alveolar macrophages obtained from patients with asbestosis compared with normal subjects. More specifically, p38 was constitutively active and ERK activation was suppressed. Since the upstream pathway leading to ERK was intact, we hypothesized that an ERK-specific phosphatase was, in part, responsible for the decreased ERK activity. We evaluated whether the dual specificity phosphatase MAP kinase phosphatase (MKP)-3, which is highly expressed in the lung and specifically dephosphorylates ERK, was increased after exposure to asbestos. We found that MKP-3 increased after exposure to asbestos, and its expression was regulated by p38. We found that p38 and ERK negatively regulated one another, and MKP-3 had a role in this differential activation. We also found that p38 was a positive regulator and ERK was a negative regulator of TNF-alpha gene expression. Cells overexpressing MKP-3 had a significant increase in TNF-alpha gene expression, suggesting than an environment favoring p38 MAP kinase activation is necessary for TNF-alpha production in monocytes exposed to asbestos. Taken together, these data demonstrate that the p38 MAP kinase down-regulates ERK via activation of MKP-3 in human monocytes exposed to asbestos to enhance TNF-alpha gene expression.     

蛋白激酶A在慢性心房颤动患者2型小电导钙激活钾通道调控中的作用

 目的：探讨心房颤动（AF）时心房肌细胞2型小电导钙激活钾通道（SK2通道）功能的改变及蛋白激酶A（PKA）相关途径对SK2通道电流的调节。方法：从体外循环手术中获取右心耳组织,应用改良的急性酶分离法获得人心房单个心肌细胞,采用膜片钳全细胞记录模式进行SK2通道电流记录。对比窦性心律（SR）组和AF组SK2通道电流密度及其在混合电流中所占比例的变化。观察PKA特异性抑制剂H-89对SK2通道电流的作用。采用BCA法和ELISA法检测心房组织总蛋白和PKA的含量。结果：（1）SR组和AF组的SK2通道电流均呈现内向整流特性。AF组SK2通道电流密度明显增高,且在混合电流中所占比例增加。在-130 mV钳制电压下,SR组和AF组SK2通道电流密度分别为(-2.61±0.14) pA/pF和(-6.21±0.59) pA/pF,在混合电流中所占比例分别为(20.01±1.44)%和(42.87±1.79)%,差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）H-89能够降低SR组和AF组SK2通道电流密度,且对AF组SK2通道电流密度的抑制更明显。在-130 mV钳制电压下,H-89对SR组和AF组SK2通道电流密度的抑制率分别为(39.27±4.08)%和(76.32±2.94)%;SK2通道电流在混合电流中比例亦下降,抑制率分别为(37.48±4.77)%和(56.40±3.66)%,差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）AF使PKA含量下降。SR组和AF组PKA含量分别为(511.91±7.22) ng/L和(444.09±7.88) ng/L,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：AF患者心房肌细胞SK2通道电流密度及其在混合电流中比例升高,是AF发生和维持的基础之一,电流改变参与了心房电重构过程。PKA能够通过一定途径调节SK2通道功能,且对AF心房肌细胞SK2通道的调节更为显著。