应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白

目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定。对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:经过4轮筛选后,对随机选取的20个噬菌体克隆进行鉴定,其中11个可与HMGB1启动子结合。DNA测序后经过同源性搜索,确定了与HMGB1启动子具有结合作用的蛋白,包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等6种已知功能蛋白和2种未知功能蛋白。结论:筛选到HMGB1启动子的结合蛋白,为研究HMGB1基因的转录调控机制奠定基础。     

人源性抗汉坦病毒抗体VH基因噬菌体表面展示文库的构建与筛选

目的 构建人抗汉坦病毒（HV）抗体重链可变区（VH）基因噬菌体表面展示文库,筛选人源性抗HV单克隆抗体（mAb）。方法 从HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,用RT－PCR扩增VH基因,与噬菌粒pHEN1连接,构建VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮吸附－洗脱－扩增的亲和筛选后,用ELISA鉴定抗HV噬菌体抗体的活性。结果 HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,成功扩增出VH基因,并构建了VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮亲和筛选,获得24个具有与HV结合活性的重组噬菌粒克隆。对其中一个克隆的VH基因（VH－D10）的序列分析表明,该基因的全长为363bp,编码121个氨基酸,与EMBL和GenBank中所有已知免疫球蛋白（Ig）基因进行同源性比较,其同源序列均人为IgVH原因。结论 成功地构建了人抗HV抗体VH基因噬菌体表面展示文库,并筛选到有HV结合活性的重组噬菌体克隆,为制备人源性抗HVmAb奠定了基础。     

小鼠CXCR4基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆小鼠CXCR4基因启动子, 并建立CXCR4报告基因系统.方法:设计合成PCR引物, 从小鼠基因组DNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的启动子区.序列测定确认后, 用克隆的启动子片段构建CXCR4荧光素酶报告基因载体pGL-CXCR4.转染细胞, 用双报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:成功扩增了小鼠CXCR4基因的启动子区.克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列.通过转染细胞和荧光素酶分析, 证实所构建的报告基因可以反映CXCR4启动子的活性.结论:成功扩增、克隆了小鼠CXCR4基因启动子, 并成功建立起其报告基因系统, 为后续的研究奠定了基础.     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

以FOXP3为靶点的免疫抑制剂药物筛选模型的建立

目的构建以FOXP3为靶点的免疫抑制剂筛选模型,用于筛选免疫抑制剂。方法以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增人类FOXP3基因启动子,将扩增的启动子DNA片段克隆至pGeneBLAzer-TOPO载体,以PCR方法确定插入片段方向,选取有正向片段的质粒克隆进行测序鉴定,用Lipofectine2000转染Jurkat细胞株,经G418抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR扩增鉴定阳性细胞克隆基因组中整合有FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体。以阳性对照前列腺素-2（PGE2）和PMA/Ionophore刺激细胞,探讨FOXP3启动子对下游报告子β-内酰胺酶活性的影响,并筛选了研究所内约2500余种天然产物。结果通过PCR成功扩增人类FOXP3基因启动子全长区域,构建了FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体,以PCR方法鉴定稳定转染细胞株Jurkat细胞基因组中整合有FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体,探讨了阳性对照PGE2和PMA/Ionophore对FOXP3基因启动子活性的影响,建立了以FOXP3为靶点的免疫抑制剂药物筛选模型,筛选了研究所2500余种天然产物,获得4个对FOXP3基因启动子具有上调作用的天然产物。结论建立了以FOXP3为靶点的免疫抑制剂筛选模型。     

日本血吸虫尾蚴cDNA文库的免疫学筛选及EST序列的分析

目的为获得日本血吸虫（Schistosoma japonicura，Sj）转化生长因子β1（TGF—β1）基因的部分或全长cDNA序列。同时验证用针对某一蛋白的抗体筛选表达文库是否可以得到相应蛋白对应的基因序列。方法采用兔抗鼠TGF—β1血清，对Sj尾蚴cDNA表达文库进行免疫学筛选，对阳性克隆进行PCR扩增后，将大于500bp的克隆进行复筛，对复筛阳性的克隆进行测序和生物信息学鉴定。结果对大约10^6个噬菌斑进行了初筛。共获得7个阳性克隆；经过PCR扩增后，其中有4个克隆大于500bp，复筛获得3个持续阳性克隆；对测序后的阳性克隆进行生物信息学鉴定，得到的三个克隆均与日本血吸虫辅酶Q10氧化还原酶（SjCHGC）基因具有高的同源性（Bhata分值都大于200）。结论SjCHGC蛋白与兔抗鼠TGF—β1抗体的反应为交叉反应，用抗某一蛋白的抗体筛选表达文库得到相应蛋白的基因序列的方法不一定可行。     

人SNW1基因的克隆、表达及其调控IFN-β表达的初步研究

目的克隆人SNW1基因并构建其真核表达载体,验证SNW1基因的表达和细胞定位,探索SNW1基因对IFN-β转录的调控作用。方法以来自293T细胞的c DNA为模板PCR扩增人SNW1基因并克隆至真核表达载体p CMV-N-Flag上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序;通过瞬时转染和免疫印迹验证SNW1在细胞中的表达;通过免疫荧光确定SNW1在细胞内的定位;利用IFNB启动子荧光素酶双报告系统和仙台病毒(Se V)初步检测SNW1对IFN-β转录的调控作用。结果 PCR扩增出约1.6 kb的条带,大小与预期相符;酶切结果表明SNW1成功克隆至PCMV-N-Flag,进一步测序验证SNW1序列正确;Flag-SNW1蛋白大小约Mr70 000,主要定位于细胞核中;在Se V感染条件下过量表达SNW1可以显著增强IFN-β的表达,而过量表达的SNW1对IFN-β的本底表达有一定的抑制作用。结论成功克隆并构建了SNW1真核表达载体,初步显示SNW1对IFN-β的转录具有较强的调控作用。     

应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β（IFNp）结合蛋白。方法 用多聚酶链反应（PCR）技术扩增IFNB基因，连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109，与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）和X-α-半乳糖（X-α-gal列）上进行双重筛选阳性克隆，提取酵母质粒后转化大肠埃希菌（DH5α）并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，进行酶切鉴定及序列测定，并进行生物信息学分析。结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到19个克隆基因，编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNB具有结合作用。结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNB具有结合作用的蛋白。     

恶性疟原虫FCC—1／HN株环子孢子蛋白基因分枝杆菌——大肠杆穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

本文对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein,CSP)基因片段进行克隆和序列测定。根据恶性疟原虫837株基因编码序列设计合成一对引物,采用PCR技术从恶性疟原虫FCC-1/HN株基因组DNA中特异扩增CSP基因片段的Ⅰ区、中央重复区、重复区后可变区和Ⅱ区;经纯化的扩增产物用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后,定向克隆入大肠杆菌——分枝杆菌穿梭表达质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α,重组克隆经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定,并对重组子进行序列测定。结果表明从恶性疟原虫FCC-1／HN株基因组DNA中可特异扩增出约1171bp的基因片段,阳性重组质粒经双酶切和PCR鉴定与预期的结果一致,序列测定表明所克隆的基因和编码环子孢子抗原的基因片段相符。     

抗SARS抗体独特型单链抗体的筛选及鉴定

目的从人源噬菌体抗体库中筛选抗SARS独特型抗体为SARS的诊断及疫苗的研究奠定基础。方法以混合SARS病人恢复期血清免疫球蛋白（Ig）作为筛选分子,从噬菌体抗体库中筛选出能与病人血清IgG（IgM）结合的抗体,并通过与混合正常人血清Ig作负性筛选,从而获得抗SARS病毒的独特型抗体（AId）。通过4轮“吸附-洗涤-扩增”,从最后一轮所得单克隆菌株中分别通过ELISA筛选出能和SARS病人恢复期血清Ig结合的菌株,提取质粒DNA,并对PCR扩增产物进行DNA序列测定,最后用所筛选的克隆通过与不同人群血清反应,证实其特异性。结果随机挑选经第4轮筛选后的200个单克隆菌落,其中有10个与SARS病人恢复期血清Ig结合的OD值明显高于其与正常人Ig结合的OD值;以上10个克隆经PCR扩增,其中有6个克隆于l000bp处有电泳条带;其DNA序列经与BLAST数据库和IMGT／QUEST软件比对有5个均与人的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）高度同源,且与其同源性最高的人Ig的VH属VHI亚群,VL属k链,属VKⅡ亚群;最后确认有3个克隆其噬菌体抗体和SARS病人血清Ig结合的OD值均明显高于与正常人血清Ig结合的OD值。结论利用抗体库技术可不经免疫制备特异性抗SARS抗体独特型抗体,为SARS诊断及疫苗的研制奠定基础。     

人IFN-β基因启动子荧光表达载体的构建及鉴定

目的构建人IFN-β基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pGE3-IFNB1),并在A549细胞中进行表达验证。方法采用PCR方法扩增出IFN-β启动子区片段,克隆入荧光表达载体pGL3 basic和pGE3 basic,并用脂质体瞬时转染A549细胞,6 h后用汉滩病毒(HTNV)感染转染后的细胞,24 h后检测重组载体在细胞内的表达情况。结果重组载体pGL3-IFNB1和pGE3-IFNB1分别经双酶切鉴定及序列测定证实载体构建正确;且在A549细胞内成功表达。经HTNV刺激后表达明显增加。结论成功构建了人IFN-β启动子荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白表达载体(pGE3-IFNB1),为进一步研究病毒诱导产生IFN-β机制提供了有用的工具。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ基因P1、P3启动子克隆及意义

目的:人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因P1、P3启动子的克隆。方法:根据GenBank数据库提供的IGF-Ⅱ基因DNA全序列及有关文献, 应用巢式PCR技术从L-02正常人胎肝细胞系中扩增分离出P1、P3启动子片段, 并采用TOPO TA Cloning kit将PCR产物克隆入pCR2.1-TOPO T载体。结果:经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定, 克隆的IGF-Ⅱ基因P1、P3启动子片段碱基序列与GenBank数据库一致。结论:成功克隆了IGF-II基因P1、P3启动子。     

抗阿尔茨海默病Aβ人源单链抗体基因的筛选和表达

目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础.     

应用噬菌体随机十二肽库筛选旋毛虫Ts87蛋白抗原表位

以抗旋毛虫Ts87蛋白单克隆抗体2A2作为靶标,对噬菌体展示随机十二肽库进行筛选.通过ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并对阳性克隆提取DNA进行测序分析.结果显示,经3轮生物淘洗后,目标噬菌体得到433倍富集.随机挑选20个克隆进行ELISA鉴定,其中有18个噬菌体克隆可以与单抗2A2特异性结合.测序分析发现,这18个克隆带有4种氨基酸序列,分别为:TPHPHIFYREAS、DWKAWTQMLDSY、WQIEYFrLHSLW和VSPHEYWSEL.经比对未发现这4种序列与Ts87蛋白序列有明显同源性.将这4株噬菌体克隆扩增后,经Western-blot鉴定均可被单抗2A2识别.结果表明本次筛选鉴定得到的4个噬菌体展示肽可能是旋毛虫 Ts87蛋白的模拟抗原表位.     

人血管细胞中hCREG1基因启动子对血清饥饿发生应答

目的： 为揭示E1A 激活基因阻遏子（CREG1）在人血管平滑肌细胞(VSMCs)和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中表达的调控机制，构建人CREG1（hCREG1）启动子报告基因载体，探讨CREG1在不同血管细胞中的表达。方法: 在对hCREG1进行生物信息学分析的基础上，以人基因组DNA为模板，PCR方法扩增含有hCREG1基因上游-3 677 bp序列，构建了hCREG1 5′上游-3 677 bp、-2 310 bp和-945 bp序列片段，分别将这3个序列克隆到pMD18-T载体上并定向亚克隆到pEGFP-1报告基因载体-pEGFP-hCREG1-P3677、pEGFP-hCREG1-P2310和pEGFP-hCREG1-P945。将重组质粒瞬时转染VSMCs株HITASY和HUVECs，检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达。结果: 经测序鉴定证实，3个报告基因载体中插入的PCR扩增序列均与hCREG1基因上游DNA序列完全匹配。瞬时转染体外培养的人VSMCs和HUVECs后，经荧光观察和蛋白质印迹（Western blotting）证实，细胞内存在GFP的表达，并且0.5%FBS培养的HITASY细胞中GFP表达较10%FBS培养的细胞中明显增加。HUVECs中的GFP表达较人VSMCs明显增加。结论: hCREG1基因启动子报告基因载体构建成功，核心启动子存在于5′上游序列的-945 bp-0 bp区域，为进一步研究hCREG1基因表达提供了条件。     

用T7噬菌体展示筛选系统筛选与靶蛋白相结合的蛋白

目的 :建立有效的T7噬菌体筛选系统 ,筛选与靶蛋白 (信号分子 )有结合关系的多肽或蛋白。方法 :以p38MAPK、PRAK为靶蛋白 ,分别用不同的介质 (ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂 ) ,通过结合 -洗脱 -扩增 3个步骤 ,筛选噬菌体cDNA文库 (T7人肝和 /或人肺cDNA文库 )。结果 :选择第四轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆 ,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片断 ,回收PCR产物并进行顺序 ,将获得的序列在美国国立卫生院 (NIH)的GenBank数据库中进行同源序列比较 ,获得若干编码蛋白的序列。在这些蛋白中有激酶、转录因子、细胞骨架…     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.