pCMV-LC3-Ag85B重组质粒DNA疫苗对结核的免疫保护作用

目的构建结核分枝杆菌Ag85B抗原基因与微管相关蛋白轻链3(LC3)基因融合的DNA疫苗,探究其抗结核分枝杆菌保护效应。方法构建pCMV-LC3-Ag85B重组质粒并转染RAW264.7细胞,Western blot法检测目的蛋白的表达水平。分别以pCMV、pCMV-Ag85B、pCMV-LC3-Ag85B质粒免疫BALB/c小鼠。末次免疫2周后,Ag85B刺激下培养各组小鼠脾脏淋巴细胞,ELISA检测IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10分泌水平。末次免疫3个月后,用H37Rv标准株尾静脉注射感染小鼠,计数肺和脾脏结核分枝杆菌载量。结果 pCMV-LC3-Ag85B在RAW264.7细胞的表达水平与质粒浓度呈剂量依赖性。与pCMV-Ag85B免疫组相比,pCMV-LC3-Ag85B免疫组的IL-2、IFN-γ分泌显著增加,而肺和脾脏内结核分枝杆菌载量降低。结论 pCMV-LC3-Ag85B可显著增强Th1型免疫应答,并显示较好的抗结核分枝杆菌免疫保护效应。     

T-bet佐剂对Ag85B抗结核DNA疫苗的免疫调节

目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法检测质粒蛋白表达情况。3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将脾脏淋巴细胞悬液于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。结果:质粒蛋白成功表达,并且质粒剂量与质粒蛋白表达水平呈正相关。此外,T-bet/Ag85B不仅诱导IgG2a滴度显著增高伴随IgG1显著降低,而且还刺激IL-2/IFN-γ(Th1类)分泌增加伴随IL-4/IL-10(Th2类)减少。结论:T-bet增强抗Ag85B特异性IgG2a抗体反应,并诱导显著的Th1细胞优势免疫。     

口服免疫Ag85A脂质体DNA诱导T细胞亚群应答效应研究

目的:拟采用构建的可在真核细胞内表达Ag85A基因的质粒,以阳离子脂质体为运载体,制成DNA疫苗,经口途径投予小鼠,以观察Ag85A脂质体DNA疫苗诱导免疫应答效应,为口服DNA疫苗的临床应用提供理论和实验依据.方法:ELISA方法检测Ag85A特异性抗体产生水平及血清Th1型细胞因子IFN-γ及Th2型细胞因子IL-4的分泌水平,ELISPOT技术检测口服DNA疫苗后小鼠可分泌IFN-γ和IL-4脾淋巴细胞数量.流式细胞术观察口服DNA疫苗后小鼠脾淋巴细胞CD4+T细胞及CD8+T细胞亚群的变化,从而判断口服DNA疫苗的免疫效果及脂质体是否有免疫增强作用.结果:口服自制Ag85ADNA疫苗可见血清中抗Ag85A特异性抗体的产生;下调了脾CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的数量;分泌IFN-γ的Th1型细胞比率和血清中的IFN-γ水平下降,而分泌IL-4的Th2型细胞比率和血清中的IL-4水平升高.口服DNA疫苗组诱导Ag85A特异性抗体产生,脂质体具有免疫佐剂作用.结论:应用阳离子脂质体为运载体,重组Ag85A DNA疫苗口服免疫C57BL/6小鼠,诱导了CD4+及CD8+T细胞亚群的下调及IFN-γ的表达减少,而玎IL-4的分泌呈增高趋势;疫苗可诱导Ag85A特异性抗体的分泌,产生了明显的体液应答.     

TAT-Ag85B蛋白疫苗的制备和抗结核分枝杆菌效果评价

目的探讨利用HIV反向转导结构域(TAT-PTD)系统表达的转导性Ag85B蛋白疫苗的抗结核分枝杆菌效应。方法构建p ET28a-Ag85B、p ET28a-TAT-Ag85B质粒,原核表达纯化和鉴定后获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;将BALB/c小鼠随机分为3组:Ag85B组,TAT-Ag85B组,PBS组。重组蛋白经皮下免疫小鼠3次,末次免疫后1周处死部分小鼠,ELISA检测小鼠血清中Ag85B抗体滴度,以及脾细胞分泌的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)的水平;用流式细胞术检测巨噬细胞经Ag85B、TAT-Ag85B蛋白刺激后表面分子CD80、CD86变化情况;剩余小鼠经尾静脉感染H37Rv结核分枝杆菌,感染后第1、2、4、8周动态监测小鼠肺和脾内结核分枝杆菌载量,并在感染后8周取肺脏进行HE染色,观察肺组织病变情况。结果成功获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;与Ag85B相比,TAT-Ag85B诱导小鼠表达高水平的Ig G和IFN-γ、IL-2,感染小鼠的脾、肺结核分枝杆菌载量明显减少,肺组织病变范围小、结核分枝杆菌数量少。另外,TAT-Ag85B增强巨噬细胞表面分子CD80/CD86的表达。结论 TAT-Ag85B蛋白疫苗增强巨噬细胞的抗原提呈能力,诱导小鼠产生强烈的Th1免疫应答,有一定的抗结核分枝杆菌保护作用。     

pBudCE4.1/PPE68DNA疫苗诱导Balb/c小鼠产生Th1免疫应答

目的构建结核分枝杆菌PPE68 DNA疫苗,并探讨其在小鼠体内诱导的Th1免疫应答。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和复制子OriM基因亚克隆入真核表达质粒pBudCE4.1中构建穿梭质粒,并用其免疫Balb/c小鼠,于第3次免疫后2周处死小鼠,分别检测免疫小鼠血清IgG2a水平、IFN-γ和IL-12水平;特异性蛋白刺激后淋巴细胞增殖状态;小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果 PPE68 DNA疫苗免疫小鼠后血清中的IgG2a水平、IFN-γ和IL-12均有意义的提高,脾淋巴细胞增殖显著。脾肺未见明显病理改变。结论 PPE68DNA疫苗可有效诱导小鼠Th1免疫应答,为进一步研究其抗MTB的免疫保护作用奠定了基础。     

Ag85A DNA疫苗加强免疫显著提高卡介苗初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答

目的 构建表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗,分析其加强免疫后提高卡介苗(BCG)初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答.方法 以Mtb毒株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Ag85A抗原编码的结构基因并克隆至真核表达载体pVAX1中构建其DNA疫苗;接着,将纯化后的该DNA疫苗加强免疫BCG初免小鼠2针,以BCG和DNA单独免疫小鼠为对照,免疫8周后无菌分离脾淋巴细胞,分别应用IFN-γ ELISPOT和多因子胞内流式细胞术(intracellular staining)分析免疫小鼠的Mtb抗原特异性效应细胞免疫水平与分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2的多功能CD4+T细胞频率及其强度以及CD8+T细胞免疫应答.结果 与BCG免疫及DNA单独免疫组相比,Ag85A DNA加强免疫不仅能显著提高小鼠IFN-γ+TNF-α+IL-2+多功能T细胞,IFN-γ+IL-2+、IL-2+TNF-α+双功能T细胞与IL-2+单功能T细胞的频率以及IL-2的分泌能力,还能显著诱导小鼠产生更多分泌IFN-γ和IL-2的CD8+T细胞.结论 本研究成功构建了表达Mtb免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗并分析了其免疫原性,证实了BCG初免-DNA加强的免疫策略可同时显著增强实验小鼠的Mtb抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞应答水平,有利于提高BCG的免疫原性,为增强BCG逐渐下降的抗结核保护效果提供新思路.     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。     

注射用布氏菌活疫苗免疫学评价

目的以小鼠为动物模型,通过检测布氏菌活疫苗免疫小鼠产生的体液免疫、细胞免疫应答及保护力,对其进行免疫学评价。方法将30只小鼠随机分为3组,皮下免疫布氏活疫苗,免疫4周后分离血清及脾脏淋巴细胞。ELISA法检测免疫动物血清中总IgG抗体,抗体亚类IgG1及IgG2a;ELISPOT法检测分泌IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目,以及用ELISA方法检测体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-4的细胞因子水平;用羊布氏菌弱毒株M5攻击免疫动物,通过脾脏细菌计数评价布氏活疫苗的免疫保护作用。结果用ELISA法检测到免疫布氏活苗的小鼠体内有特异性抗体产生;ELISPOT可检测到较高的分泌IFN-γ脾脏淋巴细胞数目,ELISA方法可检测到较高的IFN-γ水平,表明布氏活疫苗主要诱导Th1型免疫应答;通过布氏活疫苗保护力分析,表明该疫苗具有较好的免疫保护效果。结论布氏疫苗采用注射免疫途径是可行的,免疫后能获得较好的免疫效果。     

抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原(Ag85B-ESAT-6)亚单位疫苗黏膜免疫对结核分枝杆菌的免疫应答

目的 评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法 分别用AE、 AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和Th2细胞的IL-10分泌水平,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、 IL-2、 IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。MTB静脉感染免疫小鼠,ELISA检测感染小鼠血清抗体及脾细胞细胞因子分泌水平,HE染色分析肺病理改变,平板法计数菌落形成单位(CFU)检测脾和肺荷菌数。结果 AE和AE联合c-di-AMP经鼻黏膜免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体,促进脾细胞增殖、脾和肺脏Th1/Th2型细胞因子和TNF-α转录增加、脾Th1/Th2型细胞因子分泌增加。小鼠MTB感染后,与对照组相比,AE和AE联合c-di-AMP免疫小鼠特异性抗体水平仍升高,Th1/Th2型细胞免疫应答增强,肺组织呈炎症反应,肺、脾荷菌数显著降低,且AE联合c-di-...     

结核分枝杆菌联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌免疫保护性抗原DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗联合免疫,BCG免疫以及联合DNA疫苗初免-BCG加强免疫等不同的免疫策略,诱导免疫应答效果观察.方法:健康雌性BALB/c小鼠24只,随机分成PBS 阴性对照组,DNA初免-BCG异源加强组,DNA(Ag85A和ESAT-6)初免DNA同源加强组和BCG阳性对照组,共进行3次免疫,初免2次,最后1次加强,间隔2周1次.PBS组3次均注射PBS 溶液;DNA/BCG组以质粒DNA免疫2次,最后1次以BCG加强免疫;DNA/DNA组3次均以质粒DNA进行免疫;BCG组则注射PBS溶液2次后以BCG免疫.末次免疫后4、6、8周分别分离血清测定总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,体外经TB-PPD刺激后进行淋巴细胞增殖实验(XTT法)并测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平.结果:DNA/BCG、DNA/DNA、BCG组体外经TB-PPD刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,3组平均效价为1:120、1:160、1:80,DNA/DNA组的抗体效价高于另外2组;小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,其中DNA/BCG组IFN-γ的分泌水平高于DNA/DNA组和BCG组(P<0.05).结论:联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫策略能在小鼠体内诱导较强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ.     

共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性免疫应答的影响

目的 研究共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性体液和细胞免疫应答的影响.方法 将HBV表面抗原核酸疫苗pcDS2单独或联合共刺激分子4-1BBL质粒肌肉注射免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBs IgG及亚型IgG1和IgG2a;迟发型超敏反应(DTH)反应检测体内细胞反应;流式细胞仪检测CD4+ T淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ及CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ水平;流式细胞仪检测小鼠脾细胞HBsAg特异性体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL).结果 与单纯免疫核酸疫苗pcDS2组比较,pcDS2和4-1BBL联合免疫组小鼠的抗-HBs水平显著提高,抗-HBs IgG亚类以IgG2a占优;免疫小鼠经HBsAg脚掌皮下刺激后,联合免疫组小鼠脚掌的厚度显著高于pcDS2组;联合免疫组CD4+T淋巴细胞的IL-4和IFN-γ表达水平及CD8+T淋巴细胞的IFN-γ表达水平显著升高;DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBsAg特异性体外CIL杀伤作用高于对照组,其中联合免疫组小鼠的体外CTL杀伤作用最强.结论共刺激分子4-1BBL不仅能增强HBV DNA疫苗诱导特异性体液免疫应答,还能增强特异性型细胞免疫反应,尤其增强体内CIL的杀伤活性.     

细胞因子IL-2、IL-12及IL-18增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的免疫保护作用

目的探讨白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)以及白细胞介素-18(IL-18)对结核分枝杆菌ESAT-6DNA疫苗免疫保护作用的影响。方法 50只雌性Balb/c小鼠随机分为IL-2-pcDNA-ESAT-6、IL-12-pcDNA-ESAT-6、IL-18-pcDNA-ESAT-6、pcDNA-ESAT-6以及PBS对照组,分别于0、2、4周共免疫3次。末次免疫2周后各组处死5只小鼠,ELISA检测小鼠血清IgG、IgA,并分别检测0、2、4、6周小鼠阴道灌洗液中sIgA水平。CCK-8法检测免疫小鼠脾细胞的增殖情况,并测定脾细胞上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10的分泌水平。末次免疫2周后,腹腔注射结核杆菌H37Rv感染小鼠,感染后4周取小鼠肺组织进行菌落培养计数;同时通过HE染色以及肺组织炎症因子检测评估其炎症情况。结果细胞因子IL-2、IL-12以及IL-18均能够显著增加小鼠血清IgG、IgA以及阴道灌洗液sIgA的分泌(P0.05),并促进免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖(P0.05);IL-2、IL-12及IL-18还能够显著增加脾细胞中IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌水平;此外,相较于ESAT-6真核疫苗组以及PBS对照组,IL-2、IL-12及IL-18均能够显著降低小鼠肺组织菌体载量以及炎性侵润,并减少炎性因子分泌。结论细胞因子IL-2、IL-12及IL-18均能不同程度的增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的体液以及细胞免疫应答水平,并显著提高其免疫保护效果。     

乙型肝炎疫苗联合B7-H1蛋白疫苗对HBV转基因小鼠抗HBsAg免疫应答的影响

目的:研究B7-H1蛋白疫苗对HBV转基因小鼠免疫应答的影响,探索治疗慢性乙型肝炎的新方法。方法:用不同剂量的乙型肝炎疫苗和B7-H1蛋白疫苗联合免疫HBV转基因小鼠,应用ELISA法检测转基因小鼠在不同时间点血清抗B7-H1抗体滴度,同时在免疫后第14周末处死小鼠取脾细胞,检测不同的免疫方法对小鼠脾细胞产生HBsAg特异性Th1类细胞因子(IFN-γ及IL-2)、对HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞数量及对小鼠淋巴细胞增殖的影响。结果:成功完成小鼠的免疫计划,5周起血清中即能测到B7-H1抗体,同一时间点各组之间的抗体滴度值并无明显差异。加B7-H1蛋白免疫各组与相同剂量单用HBsAg蛋白免疫各组相比:IL-2均明显减低(P<0.05),分泌IFN-γT的T细胞数量下降,但脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平各组间无明显差异;MTT法测定的淋巴细胞增殖能力各组间也无明显变化。结论:B7-H1蛋白疫苗可诱导HBV转基因小鼠产生明显的抗B7-H1抗体应答,但不能增强抗HBsAg的免疫应答。较小剂量的HBsAg即可引起HBV转基因小鼠Th1类细胞因子(IFN-γ及IL-2)的分泌以及淋巴细胞增殖。     

肺炎支原体P1C-IL-2融合基因疫苗鼻饲对小鼠免疫效果的检测

目的 研究肺炎支原体(Mp) P1C-IL-2融合基因疫苗经鼻饲免疫小鼠后的免疫应答水平和免疫保护作用,了解IL-2对P1C核酸疫苗的免疫佐剂效应.方法 将构建的P1C-IL-2核酸疫苗鼻饲免疫BALB/c鼠,ELISA检测免疫小鼠血清IgG滴度、IgG亚类和支气管肺泡灌洗液中IgA及IFN-γ、IL-4的水平;建立小鼠Mp感染模型,观察Mp攻击后小鼠肺组织炎症情况和支气管肺泡灌洗液中Mp菌落数的变化.结果 P1C-IL-2双基因疫苗组小鼠血清中的总IgG、IgG1、IgG2a亚类和支气管肺泡灌洗液中IFN-γ和IL-4水平均较PIC疫苗组小鼠显著增高(P＜0.05),但两组支气管肺泡灌洗液IgA差异无显著性(P＞0.05).用Mp滴鼻感染免疫小鼠,第1、3、6天P1C-IL-2双基因融合疫苗组小鼠肺组织炎症病理评分显著高于P1C单基因疫苗免疫组小鼠,两组小鼠支气管肺泡灌洗液中的Mp菌落数差异无显著性(P＞0.05).结论 IL-2能显著增强PIC疫苗的免疫应答水平,但在感染早期也激发了较强的肺组织炎症.     

IL-2 与IL-33 佐剂增强铜绿假单胞菌外膜囊泡的免疫保护效果

目的:探究IL-2、IL-33佐剂对铜绿假单胞菌(Pa)外膜囊泡(OMVs)抗感染免疫保护作用的影响。方法:体外培养Pa提取OMVs后加入IL-2、IL-33佐剂,并于0、2、4周皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠,每组18只。末次免疫2周后,ELISA检测各组小鼠血清IgG、IgA及IgG亚类水平以及小鼠脾细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平,同时检测CD4、CD8蛋白水平;CCK-8法评估IL-2、IL-33分子佐剂对小鼠脾细胞增殖情况的影响;末次免疫2周后Pa滴鼻感染小鼠,感染后10 d统计各组小鼠死亡率,检测肺组织中菌体载量,并通过HE染色评估肺组织病理损伤情况。结果:ELISA结果显示,OMVs-IL-2、OMVs-IL-33组小鼠血清中IgG、IgA以及IgG亚类水平均显著高于各对照组(P0.05),且其中各实验组IgG2a/IgG1均大于1;IL-2、IL-33均能够显著促进OMVs诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-2及IL-12(P0.05),但对细胞因子IL-4、IL-6分泌水平影响无统计学意义(P0.05);此外,OMVs-IL-2、OMVs-IL-33免疫小鼠脾细胞上清中CD4、CD8蛋白水平均显著高于对照组(P0.05);CCK-8结果显示,OMVs-IL-2、OMVs-IL-33组的淋巴细胞增殖水平最为显著(P0.05);Pa感染后,OMVs-IL-2、OMVs-IL-33组小鼠的死亡率及肺组织菌体载量均显著低于各对照组(P0.05),且小鼠肺组织的炎症侵润程度均明显减轻。结论:IL-2、IL-33佐剂能够增强Pa-OMVs诱导的体液及细胞免疫应答水平,显著提高其抗感染保护作用,具有较大临床意义。     

不同剂量结核病DNA疫苗及细胞因子联合免疫的研究

目的：评价结核分枝杆菌MPT64（简称M64）和ESAT6（简称E6）DNA疫苗不同剂量联合免疫、与细胞因子联合免疫的保护效力，以及Ag85A（简称85A）和Ag5B（简称85B）DNA疫苗的保护效力。方法：将C57BL／6小鼠随机分为14组免疫：①生理盐水；②载体pVAX1 100μg；③卡介苗；④M64100μg＋E6100μg；⑤M6450μg＋E650μg；⑥M6475μg＋E625μg；⑦M6425μg＋E675μg；⑧M6425μg＋E625μg；⑨M64100μg＋IFN-γ 100μg；⑩E6100μg＋IFN-γ100μg；（11）M64100μg＋IL-12 100μg；（12）E6100μg＋IL-12 100μg；（13）85A100μg；逼（14）5B100μg。用ELISA法检测血清抗体，结核分枝杆菌通过尾静脉攻击小鼠，动态观察小鼠体重变化；攻击4周后，取肺、肝和脾观察病理改变、称重量、做菌落计数。结果：不同剂量的M64和E6DNA联合免疫、85A和85BDNA分别免疫均能诱导小鼠产生特异性抗体，但M64或E6与IFN-γ或IL-12质粒DNA共同免疫后特异性抗体水平与对照组无显著性差异；各组血清抗体亚型IgG2a均无显著升高，IgG2b均显著高于IgGI。第2、3A、8、9、11、12组在感染后4周体重明显增加，而第1、14、5、6组体重下降；第3、11、9、7组的肺菌落指数较少。第10、13组肺肉眼未见明显病变；第2～4、7、9～13组肺组织主要为不同程度的增殖性反应，第1、6、8、14组肺组织为增殖性反应与渗出性反应并存，第5组为渗出性反应。结论：DNA免疫的量需100μg才能诱导产生强的保护效力；M64和E6DNA各100μg混合免疫、85ADNA疫苗的保护效力与卡介苗相当；b164和E6DNA与IFN-γ或IL-12质粒DNA共同免疫后，明显增强其保护效力。     

结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性.方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数.结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用.结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选.     

结核分枝杆菌DNA疫苗pVS85B的构建及免疫保护实验研究

评价构建的结核DNA疫苗pVS85B免疫小鼠后脾细胞体外产生细胞因子和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的能力。利用基因操作技术将结核菌ag85b插入pVAX1载体,构建表达结核菌Ag85B分泌型蛋白的DNA疫苗pVS85B。将雌性C57BL/6小鼠分成5组,每组20只,分别用pVS85B、pVAX1、pIL2S和PBS分别免疫3次,均间隔2周,以相同剂量加强免疫2次。另一组用BCG(105CFU)免疫1次。每组10只鼠在最后一次加强免疫后,无菌取脾培养,检测上清细胞因子。另10只鼠用结核菌H37Rv经静脉攻击,2周后取脾、肝和肺培养结核菌并进行菌落计数。结果是pVS85B免疫组鼠脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mIFN-γ平均含量分别为(311.3±46.2)和(273.6±55.4)pg/ml,显著高于3个阴性对照组(P<0.001),与BCG免疫组无显著性差异(P>0.05)。5个组的平均mIL-6和mIL-10无显著性差异。pVS85B免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌载量分别为(47 716.6±5 689.0)、(50 113.4±6 532.2)和(51 095.3±2 788.9)CFU/g,分别低于pVAX1、pIL2S和PBS三个阴性对照组的相应器官的结核菌载量(P<0.001)。pVS85B免疫组脾、肝和肺的结核菌载量显著高于BCG免疫对照组。提示,表达结核菌分泌型Ag85B的DNA疫苗pVS85B能够刺激机体产生抗结核菌所需的Th1型免疫应答,免疫鼠获得抵抗H37Rv攻击的能力。     

藤黄微球菌Rpf结构域多肽诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的:研究藤黄微球菌Rpf结构域多肽的免疫学特性.方法:用原核表达的藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫哌BALB/c小鼠3次,每次间隔2周.用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增值指数.ELISA方法检测淋巴淋巴细胞悬液中IFN-γ、IL-10和IL-12产生水平.另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数.结果:藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶128 000,淋巴细胞增殖指数为(2.10±0.12),明显高于生理盐水对照组(0.90±0.21).ELISA方法检测Rpf结构域多肽免疫组IFN-γ,IL-10和IL-12水平为(1 126±36) ng/L,(368±13)ng/L和(289±14)ng/L,明显高于生理盐水对照组(P<0.01).与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rpf结构域多肽免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有明显作用(细菌负荷为5.03±0.11,P<0.05).结论:藤黄微球菌Rpf结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分.     

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察

目的:构建编码结核分枝杆菌Ag85A分泌蛋白重组真核表达质粒,研究其与hIL-12联合免疫小鼠后的细胞免疫应答。方法:(1)构建质粒:采用PCR法从H37Rv菌株中扩增Ag85A编码基因,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体PMD20-T中,经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于真核表达载体PCDNA3.1的相应酶切位点。(2)动物实验:50只C57BL/6N小鼠随机分为:①Ag85A基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组);②重组Ag85A基因疫苗组;③卡介苗BCG组(阳性对照);④空载体组(阴性对照);⑤PBS组(空白对照)。基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次,约0.3 ml/只。第三次免疫小鼠后28天,处死各组小鼠,分离脾细胞,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFNγ-、IL-2、IL-4水平;乳酸脱氢酶释放法检测脾细胞杀伤活性;分离的脾细胞经TB-PPD刺激后,XTT比色法检测脾淋巴细胞增殖活性。结果:(1)成功构建结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗。(2)联合免疫组能诱导较强烈的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-r和IL-2水平显著高于Ag85A基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少;特异性CTL杀伤活性明显增强;淋巴细胞增殖活性也明显高于其他组别。结论:hlL-12表达质粒能够增强结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗所诱导的小鼠免疫应答。