siRNA沉默CEACAM1基因对人胶质瘤SHG44细胞生物学行为的作用

目的 探讨CEACAM1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对胶质瘤SHG44细胞增殖、体外迁移和侵袭能力的影响. 方法 设计并化学合成针对CEACAM1的3对siRNA,脂质体法瞬时转染SHG44细胞.Western blot检测转染后细胞中CEACAM1、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达水平变化.CCK-8法检测转染后的细胞增殖情况,流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化.通过Transwell小室迁移和侵袭实验,观察下调CEACAM1对SHG44细胞体外迁移和侵袭能力的影响.结果 三组特异性siRNA转染48 h后,Western blot的结果显示,3个siRNA转染组CEACAM1蛋白水平均低于正常对照组和阴性对照组(P＜0.01),以CEACAM1-siRNA3干扰效果最为明显.后续实验表明,与两个对照组相比较,CEACAM1-siRNA组的细胞增殖减慢,β-catenin和Cyclin D1表达水平明显减少(P＜0.05).Transwell小室迁移和侵袭实验表明CEACAM1下调后的SHG44细胞迁移和侵袭能力较正常对照组及阴性对照组明显降低(P＜0.05). 结论 CEACAM 1-siRNA能有效抑制人胶质瘤SHG44细胞CEACAM1蛋白的表达,并抑制细胞增殖,降低细胞的体外迁移及侵袭能力.     

CacyBP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的 观察干扰小RNA(siRNA)介导的Cacy BP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。方法 化学合成Cacy BP/SIP基因序列特异性siRNA(Cacy BP/SIP siRNA),采用脂质体法转染siRNA至MDA-MB-231细胞(Cacy BP/SIP siRNA组),MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Realtime PCR和Western blotting检测MDA-MB-231细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白的表达。另设阴性对照组和空白对照组。结果 与阴性对照组和空白对照组比较,Cacy BP/SIP siRNA组MDA-MB-231细胞增殖能力显著下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增高(P<0.05)。Caspase-3和Bax mRNA及蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白表达下调(P<0.05)。结论 靶向沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中Cacy BP/SIP基因表达后,可以抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡,其作用可能通过下调Bcl-2表达,上调Caspase-3和Bax表达发挥诱导细胞凋亡的作用。     

下调FoxM1通过激活JNK/线粒体通路增加人鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感性

目的 探讨特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) 沉默转录因子叉头框M1(FoxM1) 对人鼻咽癌HONE-1细胞增殖、凋亡、紫杉醇敏感性的影响及可能的分子机制.方法 采用siRNA靶向沉默鼻咽癌HONE-1细胞FoxM1表达并通过RT-PCR、实时定量PCR、Western blot检测转染后FoxM1的表达水平.siRNA转染后细胞的增殖和对紫杉醇的敏感性采用MTT法检测,流式细胞仪检测细胞周期分布,Annexin V-FITC /PI双染法检测细胞凋亡率.Western blot检测Ki67、CyclinE1、多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1) 及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 、p-JNK、 c-Jun、p-c-Jun、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平.结果 转染后FoxM1 mRNA及蛋白的表达均被下调(P＜0. 01) .siRNA转染组细胞增殖速率减缓(P＜0. 05),Ki67表达降低(P＜0. 05) .siRNA转染组G1期细胞比例增加(P＜0. 01),S期比例减低(P＜0. 05),Cyclin E1低表达(P＜0. 01) .同时, siRNA +紫杉醇组凋亡率明显高于阴性及空白对照+ 紫杉醇组(P＜0. 01) .siRNA转染组细胞MDR1水平下降(P＜0. 05),对紫杉醇的敏感性较两对照组明显增强(P＜0. 01) .siRNA + 紫杉醇组与阴性对照+ 紫杉醇组相比p-JNK1、p-c-Jun、Bax表达上调(P＜0. 01),Bcl-2表达下调(P＜0. 01) .结论 特异性siRNA沉默FoxM1表达可以影响JNK/线粒体通路活性,抑制鼻咽癌HONE-1细胞增殖,促进其凋亡,提高其对紫杉醇的敏感性.     

RNA干扰沉默MKK7对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰沉默丝裂原激活的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MKK7)基因对SH-SY5Y细胞凋亡的影响?方法:设计并合成针对MKK7的小干扰RNA (small interference RNA,siRNA)3条(MKK7siRNA-1?MKK7siRNA-2?MKK7siRNA-3)及与MKK7基因无同源性的带有红色荧光的阴性对照siRNA(negative control siRNA),在lipofectamine 2000介导下转染SH-SY5Y细胞,荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR观察MKK7 mRNA表达及Western blot 检测MKK7蛋白的表达,进而筛选出转染效果好的MKK7siRNA,CCK-8检测各组细胞活力,Hochest 33258检测各组细胞凋亡染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测p-JNK?凋亡蛋白cleaved caspase-3的变化?结果:① MKK7siRNA-3组的MKK7 mRNA表达最低,MKK7蛋白表达最低;②与空白对照组(control group)比较,MKK7siRNA-3组的细胞活力无统计学差异,p-JNK?cleaved caspase-3水平降低,凋亡率降低?结论:RNA干扰沉默MKK7可通过下调JNK磷酸化进而抑制SH-SY5Y细胞的凋亡?     

Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响

目的研究RNA干扰Nek2表达对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响以及相关的分子机制。方法设计合成3条针对Nek2基因的siRNA,转染至SKOV3细胞中,采用Real-time RT-PCR和Western blot技术筛选出抑制效率最高的Nek2-siRNA序列,用Transwell方法检测转染该序列的SKOV3细胞侵袭能力的改变,并用Western blot方法检测Nek2-siRNA转染后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的变化。结果①RNA干扰序列2对SKOV3细胞中Nek2的抑制效果最明显;②与未转染组和阴性对照组相比,转染了Nek2-siRNA的SKOV3细胞侵袭能力明显下降(P<0.01);③Western blot检测表明,与未转染组和阴性对照组相比,Nek2-siRNA转染48 h后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显下调,而TIMP-1的表达明显上调(P<0.01)。结论 Nek2-siRNA能有效得沉默SKOV3细胞中Nek2的表达,通过下调MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭转移。     

小干扰RNA沉默β-catenin基因对人结肠癌SW480细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)沉默人结肠癌SW480细胞β-catenin基因表达对SW480细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法合成靶向β-catenin的双链siRNA(β-catenin-siRNA),转染SW480细胞,RTPCR及Western blotting检测SW480细胞中β-catenin mRNA及蛋白的表达,MTT实验和流式细胞术分别检测SW480细胞的增殖和凋亡。结果:RT-PCR及Western blotting检测结果显示β-catenin-siRNA转染后,与空白组、阴性对照组及实验组相比,β-catenin-siRNA转染组SW480细胞中β-catenin mRNA水平明显下降,其蛋白表达也明显下调。β-catenin-siRNA转染后,SW480细胞的凋亡率明显高于阴性对照组及实验组,细胞增殖能力明显下降。结论:siRNA沉默β-catenin的表达可诱导SW480细胞凋亡,抑制细胞的增殖,为结肠癌的临床治疗提出新的思路,可以作为结肠癌治疗的一个新靶点。     

IRAK-4基因沉默对人成骨样细胞凋亡的影响

【目的】研究siRNA沉默白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)基因对人成骨样细胞株MG63凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。【方法】 以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞(CON组:不加入任何转染试剂;SC组:以scrambled siRNA序列进行转染;KD组:以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染),应用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡水平,western blotting检测Bcl-2、Bax基因的表达。【结果】 与对照组相比,靶基因沉默组(KD组)细胞的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低;转染48h后,KD组细胞增殖变缓,凋亡增加,Bcl-2蛋白的表达明显下调且Bcl-2/BaxSC>Bcl-2/BaxKD; Spearman等级相关分析显示MG63细胞凋亡比例与Bcl-2/Bax的比值间有显著的相关性。 【结论】 siRNA沉默IRAK-4基因能够诱导人成骨样细胞株MG63凋亡,且靶细胞凋亡水平与Bcl-2、Bax基因表达水平的比值相关.     

PAX2特异性siRNA在诱导HEC-1A细胞增殖及凋亡中的作用

目的研究靶向全长配对盒基因-2(PAX2)siRNA在诱导子宫内膜癌细胞增殖、凋亡中的作用。方法慢病毒载体介导针对PAX2基因的siRNA转染HEC-1A细胞,Western blot、激光共聚焦显微镜、Annexin-V/PI双标法及四甲基偶氮唑蓝(MTT)分别检测PAX2蛋白表达、细胞凋亡形态学改变、凋亡率及细胞增殖变化。结果 PAX2-siRNA转染后,HEC-1A细胞的PAX2蛋白表达明显降低(P<0.05);细胞早期凋亡率显著增加(22.07±2.17)%,与空载体转染组(1.12±0.37)%及未转染组(0.89±0.52)%比较,差异均具有统计学意义(均P<0.01);细胞生长速率显著减慢,细胞经Hoechst 33258荧光染色,见转染后细胞的胞核呈浓集固缩改变,而空载体转染组和未转染组细胞的胞核无凋亡形态学改变。结论 PAX2特异性siRNA能明显抑制PAX2蛋白在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达,抑制细胞增殖并诱导HEC-1A细胞凋亡。     

RNAi技术抑制HepG2细胞中DcR3的表达

目的探讨特异性DcR3-siRNA对人肝细胞癌细胞系HepG2的DcR3基因表达的影响。方法设计并合成带FAM荧光标记的针对DcR3的siRNA4条和非特异性siRNA1条,用脂质体转染HepG2细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪判断转染效果;应用半定量RT-PCR和免疫细胞化学检测特异性DcR3-siRNA的对HepG2细胞中DcR3表达的抑制作用。结果各特异性DcR3-siRNA均能抑制DcR3 mRNA表达(P<0.05),其中以siRNA4的作用更明显,干扰作用达62.9%;将siRNA4转染HepG2细胞,免疫细胞化学结果显示,siRNA4能明显抑制HepG2细胞中DcR3蛋白的表达(P<0.01)。结论特异性DcR3-siRNA在体外实验能抑制目的基因的表达。     

WT1基因特异性siRNA对K562细胞表达及增殖的影响

目的:研究WT1基因特异性小干扰RNA (small RNA interference, siRNA)对K562细胞表达及增殖的影响,为白血病的基因治疗提供新的思路.方法:以慢性粒细胞白血病细胞系-K562为研究对象,化学合成并转染针对K562细胞WT1基因的siRNA,倒置显微镜观察细胞的生长状态及形态学改变;MTT法检测细胞增殖状态;半定量RT-PCR检测siRNA对WT1基因表达的抑制作用;流式细胞仪法检测K562细胞凋亡.结果:siRNA转染K562细胞后, 细胞生长受抑,增殖能力减弱,其增殖抑制作用于转染后48、72 h最明显, 增殖抑制率分别为50.6%和54.1%.半定量RT-PCR显示WT1mRNA表达水平明显低于对照组;WT1 siRNA转染48 h后有42.19 %的K562细胞发生凋亡.结论:WT1基因特异性siRNA可显著抑制K562细胞增殖,促进凋亡,为白血病的基因治疗提供了新的思路.     

癌胚抗原黏附分子1对胃癌细胞株AGS生物学特性的影响

目的:探讨癌胚抗原黏附分子1对胃癌细胞株AGS生物学特性的影响.方法:将CEACAM1 siRNA转染人胃癌细胞株AGS,再用western-blot检测CEACAM1的表达;流式细胞术、Transwell实验和裸鼠负荷瘤实验分析转染后的AGS细胞的生物学特性变化.结果:转染CEACAM1 siRNA后的AGS细胞几乎不表达CEACAM1.CEACAM1沉默基因对AGS细胞增殖、凋亡和细胞周期无影响.转染CEACAM1 siRNA后的AGS细胞侵袭能力明显降低,荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制.结论:沉默CEACAM1基因的表达能够明显抑制AGS细胞的转移以及活体成瘤性,为胃癌的基因治疗提供理论依据.     

siRNA沉默E2F3基因对人膀胱癌细胞的增殖抑制作用

目的：探讨siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌细胞(5637细胞)增殖的抑制作用,阐明E2F3基沉默对5637细胞增殖抑制作用的生物学机制。方法：化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F3基因的寡核苷酸链,经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ 双酶切克隆至pRNAT-U6.1/Neo系统,重组构建E2F3 siRNA的RNAi质粒,以质粒转染DH5α菌株筛选得到稳定表达siRNA的细胞,转染5637细胞E2F3基因沉默,RT-PCR及Western blotting 检测E2F3表达,流式细胞术检测5637细胞周期,采用Annexin-V/PS双染法检测细胞凋亡率。结果：RT-PCR及Western blotting检测干扰后5637细胞E2F3基因表达抑制,3条干扰序列对5637细胞周期抑制且G1期细胞比例增高,与阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.05和P<0.001）;细胞凋亡率增加,与空白对照组及阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.001）。结论：siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌5637细胞具有明显增殖抑制和促进凋亡的作用。     

共同沉默DcR3和EGFR基因对结肠癌细胞株SW480体外生长的影响

目的 探讨共同沉默诱骗受体3(DcR3)和表皮生长因子(EGFR)基因对结肠癌细胞株SW480生长增殖的影响和诱导凋亡作用研究.方法 根据DcR3、EGFR的cDNA序列构建3组针对DcR3和EGFR的siRNA,分别使用脂质体Lipofectamine 2000转染的方法将各个siRNA导入结肠癌细胞株SW480中,48 h后通过实时荧光定量PCR检测各个siRNA对肿瘤靶基因mRNA表达的影响,采用Western-blot技术检测其靶基因蛋白的表达水平,筛选出对人结肠癌SW480细胞系中DcR3和EGFR抑制效果最强的siRNA,然后单独或联合转染SW480细胞,MTT法检测转染后对结肠癌细胞株SW480生长增殖活性的影响,流式细胞仪检测对结肠癌细胞株SW480的诱导凋亡作用.结果 共同沉默DcR3和EGFR基因对SW480细胞增殖的抑制作用优于DcR3或EGFR单基因沉默组(P<0.05).双基因共沉默组、DcR3单基因沉默组、EGFR单基因沉默组转染48 h后转染细胞的凋亡率分别为(20.1±1.7)％,(16.5±2.2)％及(15.9±1.3)％,差别具有统计学意义(P<0.05).结论 DcR3和EGFR双基因共沉默能有效抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖并诱导其凋亡,且作用优于DcR3或EGFR单基因沉默.     

RNAi沉默MACC1基因表达抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移

目的探讨RNAi沉默MACC1基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移的影响及相关的分子机制。方法化学合成针对MACC1基因的荧光标记的siRNA-FAM,利用siRNA转染试剂将MACC1特异性siRNA-FAM转染至乳腺癌MCF-7细胞;采用RT-PCR检测siRNA对MACC1 mRNA表达的影响,Western blot检测siRNA对MACC1蛋白合成的影响;MTT实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞增殖活性的影响;Transwell迁移实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞迁移能力的影响;Western blot检测干扰MACC1对S100A4及vimentin蛋白合成的影响。结果 MACC1基因在乳腺癌MCF-7细胞高表达;针对MACC1基因的siRNA转染MCF-7细胞48 h后,siRNA组与空白对照组比较,能够显著抑制MACC1基因表达和蛋白合成,抑制效率分别为81%和75%;MACC1特异性siRNA转染MCF-7细胞24、48、72 h后,MMT结果显示与空白对照组比较,siRNA组能够抑制细胞生长,并随着时间延长抑制明显(P<0.05);转染MCF-7细胞48 h后,Transwell迁移实验结果显示siRNA组与空白对照组比较,穿过小室细胞数明显降低,其能有效抑制MCF-7细胞迁移(P<0.05);siRNA组与空白对照组相比,S100A4和vimentin表达降低(P<0.05)。以上实验阴性对照组和空白对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用特异性siRNA干扰MACC1基因表达,可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移能力,且这一过程可能与S100A4和Vimentin的表达下调有关。     

RNA干扰抑制胰岛素样生长因子-1表达并诱导胶质瘤细胞凋亡

目的研究RNA干扰效应对胶质瘤C_6细胞株胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达的抑制作用及其对C_6细胞凋亡诱导的作用。方法体外化学合成靶向IGF-1基因的小干扰RNA(siRNA),采用脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C_6细胞株,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组；同时使用绿色荧光素标记的siRNA异硫氰酸荧光素(FITC)-siRNA转染细胞,于荧光显微镜下观察siRNA转染效率；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测siRNA对IGF-1基因表达的抑制作用；流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见到细胞内清晰的绿色荧光,脂质体Oligo- fectamine~(TM)2000的转染效率可＞95%；化学合成的siRNA明显抑制IGF-1 mRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF-1 mRNA表达水平可下调约40%～70%,流式细胞术检测转染IGF1-siRNA细胞凋亡率为14．14%,明显高于对照组的0．95%。结论在细胞水平上,化学合成的靶向IGF-1的siRNA可明显抑制IGF-1基因的表达,引致胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步利用RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

长链非编码RNA PCGEM1对肝癌Huh7细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA) PCGEM1对肝癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法构建LncRNA PCGEM1慢病毒沉默表达载体,培养人肝癌细胞系Huh7细胞至对数生长期,分为空白对照组、阴性对照组和观察组,空白对照组细胞未进行转染,阴性对照组细胞应用空慢病毒载体进行转染,观察组细胞应用LncRNA PCGEM1慢病毒沉默表达载体进行转染。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组肝癌细胞中LncRNA PCGEM1及Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达,细胞计数试剂盒-8检测细胞的增殖能力,Transwell小室实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果 3组细胞中LncRNA PCGEM1及Caspase-3、Caspase-9 mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(F=4.328、5.473、4.198,P<0.05);观察组细胞中LncRNA PCGEM1及Caspase-3、Caspase-9mRNA相对表达量均显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),空白对照组与阴性对照组细胞中LncRNA PCGEM1及Caspase-3、Caspase-9 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。转染24、48、72、96 h时,3组细胞增殖能力比较差异有统计学意义(F=4.126、4.572、5.218、5.379,P<0.05);观察组细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),空白对照组与阴性对照组细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。3组细胞迁移细胞数、细胞凋亡率比较差异有统计学意义(F=6.873、6.844,P<0.05),观察组迁移细胞数及细胞凋亡率显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);空白对照组与阴性对照组迁移细胞数、细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝癌Huh7细胞中存在LncRNA PCGEM1表达,下调LncRNA PCGEM1的表达能抑制肝癌细胞增殖、侵袭及凋亡。     

UbcH10基因沉默联合紫杉醇干预对NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响

目的观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响。方法化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照。以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组。结果Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P0.01)。MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P0.05)。siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性。     

脑神经胶质瘤细胞癌胚抗原相关细胞黏附分子1对替莫唑胺化疗敏感性的作用及其机制研究

目的 探究脑神经胶质瘤细胞癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)表达对替莫唑胺（TMZ）化疗敏感性的作用及其机制研究。方法 体外培养TMZ耐药人脑神经胶质瘤细胞系U251/TMZ细胞，采用空载质粒或siRNA转染U251/TMZ细胞，分为空载组、TMZ组、siRNA组及siRNA+TMZ组，转染48 h后，GFP荧光检测细胞转染效率。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞CEACAM1 mRNA的表达，MTT法检测U251/TMZ细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，酶联免疫吸附试验和Western blotting检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达。结果 与空载组比较，siRNA组、siRNA+TMZ组CEACAM1 mRNA相对表达量降低（P <0.05），细胞增殖抑制率、细胞凋亡率升高（P <0.05）,Wnt1蛋白表达水平、β-catenin及c-myc蛋白相对表达量降低（P <0.05）；与TMZ组比较，siRNA组、siRNA+TMZ组CEACAM1 mRNA相对表达量降低（P <0.05），细胞增殖抑制率、细胞凋亡率升高（P <...     

HSP70 siRNA对宫颈癌HeLa细胞HSP70表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的通过体外实验观察HSP70的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞株增殖及凋亡的影响,探讨HSP70在HeLa细胞增殖和凋亡中的功能。方法针对HSP70基因设计siRNA序列,克隆到空载体pTZU6+1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。在脂质体2000的介导下转染HeLa细胞,同时转染空载体为阴性对照及不加任何试剂的空白对照。转染48h后,应用半定量RT-PCR,Westernblot检测HeLa细胞HSP70mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测HeLa细胞的生长抑制率;AO/EB染色法观察HeLa细胞形态学变化;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率和细胞周期分布情况。结果与对照组相比,转染pHSP70-siRNA组HSP70的mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01),表明Phsp70-siRNA质粒转染能有效降低HSP70的表达;细胞生长抑制率明显增高(P<0.05),且在48h时细胞抑制率达到最大;在荧光显微镜下观察到HeLa细胞出现凋亡形态;流式细胞术结果显示pHSP70-siRNA组细胞凋亡率显著高于对照组,且G0/...     

RNA干扰PTTG基因对泌乳素型垂体瘤细胞凋亡的机制研究

目的 研究RNA干扰垂体瘤转化基因(PTTG)对泌乳素型垂体瘤细胞(HPA)凋亡的影响并探讨其作用机制.方法 设计并合成靶定PTTG的特异性siRNA片段,转入体外培养HPA细胞,48h后验证siRNA的干扰效应;Annexin V/PI染色法观察PTTG基因沉默对细胞凋亡的影响;RT-PCR和Western blot检测caspase-3在mRNA和蛋白水平表达;caspase活性检测试剂盒检测caspase活性.结果 设计合成的PTTGsiKNA转染后,能够有效抑制体外培养HPA细胞内PTTG表达实现其基因沉默效应;经浓度梯度CDDP诱导24h,转染和未转染细胞均产生细胞凋亡,caspase-3表达增强,并呈现出浓度依赖性;RNA干扰组细胞凋亡率低于未转染组,转染组caspase-3活化受抑,其caspase-3基因表达、蛋白活性均低于未转染组(P<0.05).结论 PTTG在人泌乳素型垂体瘤中过表达,能通过激活caspase-3促进HPA细胞凋亡,可作为该肿瘤临床诊断和基因治疗的新靶点.