人生长终止特异性同源盒基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因表达产物是核转录因子,主要存在于心血管系统中,对胚胎发育、细胞生长、分化和迁移等起基因调控作用,其表达异常与多种疾病相关.为深入研究Gax基因在临床疾病中的作用,文中构建表达了人Gax基因的重组腺病毒载体.方法 根据pEGFP-N1-Gax质粒的多克隆位点,用NheⅠ和Hind Ⅲ双酶切获得人Gax基因片段,连接至穿梭质粒pDC18-mCMV上,构建穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax,然后与骨架质粒pPE3共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Gax,反复感染293细胞扩增病毒后,氯化铯梯度离心纯化病毒,并测定病毒滴度.结果 穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax经双酶切和测序证实构建成功;PCR鉴定人Gax基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为4.5×1010pfu/ml.结论 该研究成功构建了重组腺病毒载体Ad5-Gax,为进一步在体内外研究Gax基因参与多种疾病的发生发展提供了材料.     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

人白细胞介素21基因重组复制缺陷型腺病毒的制备与鉴定

目的 制备表达绿色荧光蛋白的含人白细胞介素21(IL-21)基因的重组复制缺陷型腺病毒,为IL-21基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法 从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,PCR产物和pDC316-mCMV-EGFP载体分别经限制性内切酶Notl与HindⅢ双酶切,然后将酶切产物连接、转化,构建pDC316-IL21-EGFP重组质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3CreF35共转染293细胞,包装产生Ad5F35-IL21-EGFP重组腺病毒,并测定病毒滴度.观察Ad5F35-IL21-EGFP腺病毒转染后食管癌细胞EC-9706的生长曲线和细胞周期的变化.结果 pDC316-IL21-EGFP重组质粒经酶切和测序证实,IL-21基因片段正确插入pDC316-mCMV-EGFP栽体中且与GenBank中,IL-21基因序列一致.AdSF35-IL21-EGFP重组腺病毒栽体在293细胞中包装成功.获得成熟的病毒颗粒,经鉴定有IL-21基因和绿色荧光蛋白的表达.测得Ad5F35-IL-21-EGFP病毒颗粒滴度为9×1011VP/ml,感染性滴度为5×1010IU/ml.AdSF35-IL21-EGFP转染后,EC-9706细胞的生长缓慢(P＜0.05),G1期细胞增加,而G2期和S期细胞减少.结论 成功制备了表达绿色荧光蛋白的人IL-21基因的重组腺病毒,且病毒滴度较高.腺病毒介导的外源性IL-21基因可有效转染EC-9706细胞,并对其生长有抑制作用.     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

携带乙肝核心抗原基因复制缺陷型重组腺病毒的高效制备和表达

目的构建表达乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的复制缺陷型重组腺病毒载体。方法扩增乙肝病毒(HBV)C基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBVC区基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹PacⅠ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装。体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达。结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBc。重组质粒pAd-HBc导入293细胞,经过包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBc,其病毒滴度达5×109pfu/mL,并能在真核细胞中有效表达目的基因。结论成功构建表达HBcAg复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础。     

重组人RAMP-1基因腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人受体活性修饰蛋白-1（RAMP1）基因的腺病毒表达载体,为进一步深人研究RAMPl的功能奠定基础。方法通过基因工程技术将RAMP1基因克隆到穿梭质粒pShutde—GFP—CMV中;I-CeuI＋I—SceI双酶切穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—RAMPl,将回收的GFP-CMV—RAMP1片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad—RAMP1并进行PCR鉴定及滴度测定。结果构建的重组穿梭质粒pShuttle—GFP—cMVl-RAMP1双酶切后,得到O．8kb（RAMP1）和5．1kb（pShuttle—GFP—CMV）两个片段;重组腺病毒质粒pAdxsi—GFP—CMV—RAMP1用XhoI酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒Ad—RAMP1 PCR鉴定可见阳性扩增条带;病毒滴度检测达4．5×10^11PFU／ml。结论成功构建了携带人RAMP1基因的重组腺病毒载体,为进一步研究RAMPl的功能研究奠定了基础。     

重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。     

人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达

目的 :为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变 p2 7的抗肿瘤特性 ,构建复制缺陷型重组hp2 7mt基因腺病毒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,经 2次亚克隆 ,插入到穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,形成转移质粒 pShuttle -CMV -hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的 pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含腺病毒骨架质粒 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183,使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacⅠ酶切 ,转入Ad2 93细胞 ,包装成重组腺病毒Ad -hp2 7mt。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ,用紫外分光光度计进行滴度测定。用重组 p2 7mt的腺病毒Ad - p2 7mt感染大肠癌细胞SW 4 80 ,WesternBlot检测p2 7蛋白的表达。结果 :用含pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183后 ,可获得约 30 %的阳性重组质粒。PCR检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为 7.95× 10 15pfu/L。转染大肠癌细胞后 ,p2 7在SW4 80中获得了高表达 ,而未转染细胞和Ad -LacZ转染的细胞中仅有低表达。结论 :腺病毒作为一种基因转移载体 ,可有效介导 p2 7在肿瘤细胞中的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因重组腺病毒简便快速的构建方法

目的:利用细菌内同源重组法构建含血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒。方法:应用PCR技术从质粒PUHD AT2R中克隆出AT2R基因片段,定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化Adeasier1细胞,抽提经鉴定含有目的基因的重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒Ad AT2R。用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有GFP报告基因,对病毒滴度进行监测。结果:PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因AT2R,滴度为1.5×1012pfu/ml。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒比传统的细胞内同源重组法具有成功率高、方法简便、快捷和实验周期短的优点。AT2R基因重组腺病毒的成功构建为进一步实验研究奠定了基础。     

人PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)基因的重组腺病毒载体。方法从人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中提取并扩增人PPARγcDNA目的片段,将该目的片段经AgeⅠ/NheⅠ酶切后插入经相同内切酶酶切后表达质粒(CMV-MCS-SV40-EGFP)得到重组穿梭质粒;再将该重组穿梭质粒与AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHG loxΔE1,3Cre)经Cre/loxP酶切重组,构建重组腺病毒(Ad-PPARγ);最后,将Ad-PPARγ感染HEK293T细胞,进行病毒的包装、扩增、纯化及滴度检测。结果通过PCR鉴定及基因测序分析,PPARγ过表达重组腺病毒载体构建成功;Western blot结果显示经包装及纯化的Ad-PPARγ感染HUVECs后,可显著上调HUVECs中PPARγ基因的表达。结论PPARγ过表达重组腺病毒载体构建成功,且能有效上调HUVECs中PPARγ基因的表达。     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7).方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy 1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7.RT PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况.结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT PCR检测证实Smad7表达增强.结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础.     

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE.线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒.结果 RT-PCR反应扩增出1 841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的 基因DMT1-IRE.转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因.结论 携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础.     

大鼠BMP-7重组腺病毒构建及在肾小管上皮细胞中表达

目的:利用AdEasy~(TM) system构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达.方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定.经Not I和Hind Ⅲ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-BMP-7.EcoRI酶切重组pShuttle-BMP-7,与pAdEasy~(TM)DNA电穿孔共转化BJ5183感受态菌, 抽提重组AdBMP-7质粒,PacI酶切线性化重组质粒AdBMP-7后,转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增,腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度.用AdBMP-7感染大鼠肾小管上皮细胞,以ELISA法和Western-blot法检测BMP(-7)在大鼠肾小管上皮细胞中的表达.RT-PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,以鉴定重组腺病毒AdBMP-7的生物学活性.结果:构建了BMP-7基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度重组腺病毒保存液.该重组腺病毒在体外能有效转染大鼠肾小管上皮细胞并高表达BMP-7蛋白,所表达的BMP-7蛋白能有效逆转由TGF-β1诱导的α-SMA表达增高.结论:成功地构建了携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并初步证实其具有一定的抗肾纤维化功能.     

携带人白细胞介素18基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建、鉴定和滴度测定

目的构建人白细胞介素18（IL-18）基因复制缺陷型腺病毒表达载体。方法以质粒pJWIL—18为模板，设计并合成上、下游引物，利用多聚酶链反应（PCR）扩增获得IL-18基因片段，酶切后克隆至pCA13质粒，构建重组质粒pCA13IL—18。鉴定正确后，将pCA13 IL—18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，9-12天出现病毒空斑。提取重组腺病毒的DNA。进行PCR鉴定。大量扩增后，氯化铯梯度离心纯化腺病毒，测病毒滴度。结果酶切分析、序列测定、PCR验证表明，IL-18基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体中。结论成功构建了表达人IL-18基因的复制缺陷性腺病毒载体。     

GM-CSF基因腺病毒表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的构建人GM-CSF基因的重组腺病毒载体,探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。方法设计一对GM-CSF基因上下游引物,以质粒pBlu-hGM-CSF为模板,经PCR扩增获得GM-CSF基因全部序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-GM-CSF。经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将2种重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,并感染人树突状细胞。结果完成构建含有人GM-CSF基因的重组腺病毒,病毒滴度Ad-GM-CSF 5.2×109pfu/mL。RT-PCR及ELISA检测证实GM-CSF在DC中表达。结论构建重组腺病毒载体,并在DC表达GM-CSF抗原蛋白。     

人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的:利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素(canstatin)重组腺病毒载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法:PCR法扩增cansta-tin全长基因,克隆至pGEM-T载体,经酶切和测序证实后,亚克隆到穿梭质粒pAdS-CMV中,获得穿梭质粒pAdS-CMV/canstatin.用PasI酶单独酶切穿梭质粒pad5-CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体,采用标准的磷酸钙方法共转染HEK293细胞.7～10 d后收获细胞裂解物,在HEK293细胞中扩增,病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,分光光度计检测重组病毒滴度.结果:测序证实pEGM-T/canstatin基因片段与GenBank公布的can-statin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/L).结论:成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒,为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.     

人低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人HIF1α腺病毒表达载体,研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用。方法采用分子克隆技术,从pcDNA3.1/V5-HisA-HIF1α质粒获得HIF1αcDNA,经pcDNA3.1(+)克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组穿梭质粒,含有HIF1αcDNA的表达盒通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109pfu/mL。结论成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α,为冠心病的基因治疗研究奠定基础。