人血清淀粉样蛋白P的分离,纯化及抗血清的制备

目的分离、纯化人血清淀粉样蛋白Ｐ（ＳｅｒｕｍａｍｙｌｏｉｄＰ，ＳＡＰ）；利用新西兰大白兔制备抗血清。方法新鲜人血清２００ｍｌ与等体积４％琼脂糖凝胶（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ）混合，在钙离子存在条件下分离ＳＡＰ，然后用二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶ＣＬ—６Ｂ（ＤＥＡＥ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ）离子交换层析技术进一步纯化ＳＡＰ，用火箭电泳检测ＳＡＰ组分，用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ－Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）检测其纯度，经Ａ２８０（１％）＝１８２测定其含量。用纯化的ＳＡＰ与完全佐氏试剂混合注射于新西兰大白兔背部皮内，每次１００μｇ，间隔１０天，连续３次，第四次２００μｇ，ＳＡＰ总用量为５００μｇ，１０天后取血制备抗血清。结果从２００ｍｌ人血清中提取纯品２４ｍｇ，产率约４０％。抗血清经双向扩散法测定效价为１：１６。结论该改良法，操作简便，节省时间，但ＳＡＰ产率并不低。     

试管法纯化人胰岛细胞的初步研究

目的　探索用试管法初步建立纯化人胰岛细胞的方法。方法　用胶原酶P两步法消化分离胰腺 ,用试管法通过不连续密度梯度HC -A -Ficoll纯化液纯化人胰岛细胞。通过DTZ染色 ,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度 ,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。结果　纯化后平均每个胰腺可获得 (5 35 0 0±2 1 4 6 5 )个胰岛细胞团 ,平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团 (75 0± 2 6 7) ,平均纯度为 72 92 %。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好 ,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的 1 89倍 (P <0 0 1 )。结论　建立了人胰岛细胞纯化的方法 ,纯化的胰岛细胞功能良好     

河虾中主要过敏原组分鉴定及分离纯化

目的鉴定并分离纯化河虾中引起过敏反应的主要蛋白组分。方法河虾蛋白浸液皮下注射建立小鼠过敏模型,获得高效价特异性IgE血清用于免疫印迹分析。用饱和硫酸铵分段盐析和DEAE离子交换层析纯化目的蛋白。dot-ELISA及竞争ELISA检测纯化目的蛋白的过敏原活性。结果河虾蛋白浸液皮下注射成功建立了虾过敏小鼠模型。免疫印迹分析显示虾中有一分子量36kD的蛋白组分为主要过敏原。用硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析的方法成功分离到目的蛋白。dot-ELISA证明目的蛋白能与特异性IgE反应。竞争ELISA检测纯化目的蛋白与河虾蛋白浸液竞争结合特异性IgE的活性,最大竞争抑制率可达60％。结论本实验成功鉴定并分离到河虾中一分子量为36kD的主要过敏原组分,为过敏原的分析研究提供了一套比较完整的方法。     

酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及活性鉴定

目的：从牛脑中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)并鉴定生物活性，方法：根据DenisGOSPODAROW-ICZ的方法，新鲜牛脑匀浆，三步硫酸铵盐析。最后沉淀物溶解透析后予离子交换层析及琼脂糖胶亲和层析，促3T3细胞DNA合成率鉴定生物活性。结果：用1.0mol/LNaCl的缓冲液洗脱得到分子量为13600的多肽，得率为610μg/kg牛脑，氨基酸组成分析与已知的aFGF相同，促3T3细胞DNA合成的最低浓度为0.5ng/ml，最大效应浓度50ng/ml，ED50值为8ng/ml。结论：aFGF具有强烈的促细胞增殖作用。     

用层析和改良的酸酚法提取和纯化质粒

本文用过Sepharose 4B除去质粒粗提物中RNA,然后用改良的酸酚法除去开环型质粒。用0.8％琼脂糖凝胶电泳、紫外荧光薄层扫描和pst Ⅰ限制性内切酶消化质粒法鉴定。此方法可制备出足够的高纯度质粒。     

大肠杆菌中重组多肽Tat-PFKMVV的分离､表达和纯化

目的:构建重组表达载体pED-Tat-PFKMVV,在大肠杆菌中表达并通过纯化以获得重组多肽Tat-PFKMVV? 方法:用PCR的方法扩增出Tat-PFKMVV基因,插入含T7启动子的pED表达载体,构建重组表达载体 pED-Tat-PFKMVV,重组表达载体转化至大肠杆菌并表达,表达产物经洗涤?乙醇沉淀,酸水解和等电点沉淀纯化目的多肽?结果:克隆的Tat-PFKMVV基因与Genbank 对比,二者同源性为100%,酸水解位点正确?大肠杆菌表达的融合蛋白产物AnsB-C-Tat-PFKMVV经SDS-PAGE电泳显示相对分子量为17 000,质谱显示最终纯化产物Tat-PFKMVV蛋白相对分子量为2 659?通过GST-pull down实验证明Tat-PFKMVV蛋白能在体外解开神经元型一氧化氮合酶与肌肉型磷酸果糖激酶的偶联?结论:成功构建了表达AnsB-C-Tat-PFKMVV融合蛋白的原核表达体系,纯化得到了较高纯度的目的多肽Tat-PFKMVV?通过此过程建立了一套简单可行且高效的融合蛋白表达?水解?分离与纯化的方法?     

膀胱癌T-24细胞系中细胞角蛋白20的分离纯化及鉴定

目的分离纯化细胞角蛋白20(Cytokeratin20,CK20)并加以鉴定,为进一步研制抗CK20单克隆抗体奠定基础。方法培养人膀胱肿瘤T-24细胞系并用免疫组化检测CK20表达,然后大量培养并收集细胞,超声波细胞粉碎后,先用萃取、高速离心、透析等方式进行蛋白初分离,然后利用以DE52为介质的阴离子交换层析分离纯化CK20蛋白,以电泳示踪,最后采用SDS-PAGE、HLPC和Western-blotting加以鉴定。结果在阴离子交换层析时出现3组洗脱峰,CK20主要存在第二组峰中,该峰在SDS-PAGE和Western—blotting上均呈现单一条带,HLPC分析显示CK20蛋白主峰呈正态分布,仅处一个较低峰度的蛋白质杂峰。结论该纯化方法简便、可行、效果好、获得的蛋白纯度高,提取的蛋白可确认为CK20并且具有较高的免疫生物活性。     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的分离纯化及酶学性质

采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Butyl-Sepharose CL 4B疏水层析,从重组大肠杆菌DH5a菌体中分离纯化得到粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA).经纯化,AfPGA纯度较粗酶提高50.6倍、比活达到212.7 U/mg,经HPLC测定纯度为92.8%,收率为78%.理化性质分析表明:AfPGA含有2个亚基(α亚基和β亚基,其Mw分别为2.90×104和5.92×104;AfP-GA等电点约为7.9～8.0,最适pH约为10.0,并在pH>7.0时表现出了稳定的催化活力.     

重组大肠杆菌表达的Ber e1纯化工艺中去除内毒素效果研究

目的 去除重组巴西坚果过敏原蛋白Ber e 1(rBer e 1)溶液中的内毒素,为后续实验和重组过敏原蛋白的临床应用打下基础.方法 采用亲和层析法、超滤法和离子交换法联合应用以及Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用,比较这两个方案去除重组蛋白溶液中的内毒素效果.结果 亲和层析法、超滤法和离子交换法联合应用的内毒素去除率为99.99％,内毒素浓度为6.25 EU/ml,蛋白回收率为42.8％;Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用的内毒素去除率为99.99％,内毒素浓度为2.09 EU/ml,蛋白回收率为26.1％.结论 Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用蛋白溶液内毒素的去除效果较佳,且内毒素含量以及Triton X-114残留量均在《中国药典》的规定范围内.     

大孔吸附树脂法分离纯化虎杖中白藜芦醇的研究

目的研究大孔吸附树脂分离纯化虎杖中白藜芦醇的工艺条件及参数。方法以白藜芦醇的吸附量和解吸率为考察指标,从中筛选树脂,并研究大孔吸附树脂分离纯化白藜芦醇的吸附性能和洗脱参数。结果NKA-Ⅱ树脂对白藜芦醇有较好的吸附分离效果,适合于虎杖中白藜芦醇的提纯,经该树脂吸附解吸,饱和吸附量可达31.6mg/g,解吸率达91.7%。结论通过大孔树脂分离纯化后,终产品中白藜芦醇的纯度可达31.28%,而上柱前粗提物中白藜芦醇纯度为4.35%。说明采用本法分离纯化虎杖中白藜芦醇是可行的。     

Purification and characterization of human anti-HBsAg Fab fragment produced by genetic engineering technology

Hepatitis B vims (HBV) infechon is a severe healthboat in China. h was found in some .,.~h..[l'ZJ thatsome special monoclonal anticces (InAb) Play an import IDle in the fight with vial infechon. C~,the InAbs are obtained from murine hybridolna cells andinevitably POssess ~ogenicity against h~. ThePhage-display libel technology makes it POssilile tO averthybridolna technology to directly obtain hUInan anhbodyFab faint and thus foe anhgenicity of the InAbs isavoided. As a result, the h…     

基因工程抗体anti-HBsAgFab原核表达体系大规模培养条件的实验研究

目的 探讨含anti-HBsAg Fab/pBAD表达载体的工程化大肠杆菌的大规模培养条件。方法 在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律,摸索最佳的培养模式及诱导表达条件。后根据摇瓶发酵结果于发酵罐中行补料高密度发酵试验,确定最佳补料模式。结果 由摇瓶发酵获得的数据表明,以培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点、在25 ℃条件下以0.2% 阿拉伯糖诱导12 h,Fab的得率最佳,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大D₆₀₀达到55.2,相当于湿菌含量110 g/L水平;同时,经证实Fab的抗原结合活性良好。结论 初步确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺路线,为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

抗癌蛋白NOR1基因工程重组蛋白表达条件的优化和纯化

目的:构建NOR1基因原核表达载体,并在大肠杆菌中原核表达NOR1重组蛋白,对其诱导条件进行优化,并纯化NOR1蛋白.方法:PCR扩增人NOR1基因全长开放阅读框,克隆入原核表达载体pET28b.重组质粒转化大肠杆菌,采用不同温度、不同抗生素浓度、不同IPTG浓度诱导NOR1蛋白表达.选择最佳条件大量诱导NOR1蛋白表...     

人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定

目的: 构建人抗HBsAg单链抗体-Tat蛋白转导结构域(ScFv-Tat)融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并分析ScFv-Tat融合蛋白的活性及内化情况. 方法: 设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因,克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTAT-HA,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达. 表达产物用SDS-PAGE及Western blot鉴定,用亲和层析柱纯化. 间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFv-Tat融合蛋白的亲和活性,将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后,免疫细胞化学染色分析ScFv-Tat融合蛋白的结合及内化情况. 结果: 成功地构建了人抗HBsAg单链抗体-Tat融合蛋白的原核表达载体,在IPTG诱导下获得了表达,表达的ScFv-Tat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性,并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞. 结论: 单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后,实现了ScFv-Tat融合蛋白的特异性内化,为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.     

CGGBPl蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的：对人CGGBPl蛋白进行原核表达及纯化，为进一步研究CGGBPl的生物功能奠定基础．方法：构建原核表达载体pRSETA／CGGBPl．在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBPl蛋白，经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化，利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d（CC．G）29重复序列双链DNA特异性结合．结果：诱导后表达得到CGGBPl蛋白，纯化得到的可溶性表达产物CGGBPl蛋白可以和d（CGG）29重复序列双链DNA特异性结合．结论：表达并纯化得到可溶性CGGBPl蛋白，为进一步研究CGGBPl的结构与功能奠定了必要的基础．     

人源抗HBs基因工程抗体在E.coli中的高效表达与折叠

1 材料和方法 1.1 表达质粒的构建从含有人源性抗HBsAg抗体Fab段基因的噬菌体[1]中扩增出重链Fd片段,上游引物5'gcggaattcatatggtt(G)aaactgctg(C) gaa(G) cagtctg'cggaattcattaa(T)g(C)ag(A)gtc(T)ttgtcacag(A)gac(T)ttt(G)gg t(C)t(C)caactttc3';从上述噬菌体中扩增出轻链基因,上游引物5'gcggaattcatatggaa(G)ctg(C) gtt(G) atgact(C)cagtctccagacacc3'和下游引物5'cggaattcattaacat(C)tca(T)cc t(C)ct gttgaa gctcttc3'.     

Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中克隆表达thanatin突变体(Th-T)蛋白并纯化. 方法:PCR合成Th-T基因并克隆到pET32a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,构建Th-T原核表达载体(pET32a-Th-T)并转化到大肠杆菌BL21融合表达,通过正交实验优化表达条件,His-Bind介质纯化.考察经酶切纯化后的重组Th-T对4种供试菌的最低抑制浓度.结果:菌体在LB培养基(pH 6.5)培养4.5 h,IPTG 0.4 mmol·L-1诱导7 h,Th-T融合蛋白大量可溶性表达,经药敏试验证明纯化的重组Th-T具有预期的抗菌活性.结论:本研究为通过大肠杆菌体系表达重组Th-T抗菌药物奠定了基础.     

CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对人CGGBP1蛋白进行原核表达及纯化,为进一步研究CGGBP1的生物功能奠定基础.方法:构建原核表达载体pRSET A/CGGBP1.在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBP1蛋白,经Ni2 -NTA亲和层析纯化,利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结果:诱导后表达得到CGGBP1蛋白,纯化得到的可溶性表达产物CGGBP1蛋白可以和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结论:表达并纯化得到可溶性CGGBP1蛋白,为进一步研究CGGBP1的结构与功能奠定了必要的基础.     

颗粒酶B的表达纯化和鉴定

目的：克隆颗粒酶B(GraB)，构建GraB的原核表达载体，从而建立其原核表达体系，获得高效表达的重组GraB。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT-PCR克隆GraB cDNA，构建GraB原核表达载体，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定；异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物。表达产物亲和层析纯化并用免疫印迹法鉴定，以GraB底物测定其活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，并能作用于GraB特异性底物。结论：建立了GraB原核表达系统。     

重组葡激酶及其在大肠杆菌中高效表达与纯化

目的：研究高效表达葡激酶载体的构建及其体外表达与产物的纯化。方法：用PCR方法扩增葡激酶cDNA,插入质粒pET-22b中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3),经IPTG诱导表达,表达产物用Q-Poros和S-Sepharose纯化。结果：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为葡激酶重组质粒,体外表达产物经离子交换纯化后HPLC纯度达98%以上,SDS-PAGE和Western Blot实验证实该产物为葡激酶。结论：成功构建了重组葡激酶表达载体,并经表达纯化获得高纯度葡激酶,为产业化和临床应用奠定了良好基础。