慢性HBV感染者、健康人树突状细胞经HBsAg活化后的免疫效应差异

目的:研究慢性HBV感染者、健康人外周血树突状细胞(dendriticcells,DC)经HBsAg活化后的免疫功能的差异.方法:从慢性HBV感染者、健康人外周血中培养扩增DC和CIK,在DC成熟前加入纯的HBsAg刺激,并再与同一来源的CIK共同培养.用流式细胞仪检测DC、CIK表型,用ELISA法检测DC、CIK共培养上清液中的IL-12浓度,用CCK-8比色法测定DC诱导CIK对HepG2.2.15细胞的杀伤活性.结果:未经HBsAg致敏的健康人DC表面标志CDla、CD80及CD83明显高于慢性HBV感染者(P<0.05);经HBsAg致敏的健康人DC表面标志均高于慢性HBV感染者,差异具有统计学意义(P<0.01);慢性HBV感染者经HBsAg致敏的DC表面标志与未经HBsAg致敏无显著性差异.CIK细胞CD3、CD8、CD3、CD56的双阳性表达率,健康人HBsAg致敏者明显高于慢性HBV感染者及未经HBsAg致敏的健康人(P<0.01,P<0.05);慢性HBV感染组HBsAg致敏与未经HBsAg致敏者比较无显著性差异(P>0.05).HBsAg致敏DC诱导CIK对HepG2.2.15细胞的杀伤率,健康人显著高于慢性HBV感染者(P<0.01).健康人HBsAg致敏DC、CIK共培养上清液中的IL-12浓度显著高于慢性HBV感染者(P<0.001);慢性HBV感染者HBsAg致敏与未经HBsAg致敏IL-12含量差异不显著(P>0.05).结论:慢性HBV感染者、健康人DC经HBsAg活化后对HepG2.2.15细胞的免疫效应存在显著差异:健康人高于慢性HBV感染者.     

HBsAg和HBcAg联合负载DC与CIK共培养细胞体系的建立和功能评估

目的观察在不同HBV抗原负载下诱导的树突状细胞(DC)同细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养后CIK的功能。方法将2015年1月-2016年6月在南京军区福州总医院就诊的13例慢性乙型肝炎患者作为研究对象,分离13例慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞,并培养DC和CIK,设为CIK单独培养组、DC+CIK共培养组、DC+CIK+HBsAg共培养组、DC+CIK+HBcAg共培养组、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培养组,培养完成后,用ELISPOT方法测定CIK产生IFNγ的能力,用HepG2.2.15细胞作为靶细胞,测定CIK的杀伤功能。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果不同CIK试验组产IFNγ的水平差异有统计学意义(F=29.84,P0.001),其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg组产生的IFNγ水平最高;CIK杀伤率组间比较差异有统计学意义(F=14.77,P0.001),其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg最为突出。结论 HBsAg和HBcAg联合负载的DC与CIK共培养可能是治疗慢性乙型肝炎有效的细胞体系。     

DC与CIK或LAK联合对结肠癌细胞株SW480杀伤作用的研究

[目的]研究树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导或未诱导的杀伤细胞(CIK)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)对结肠癌细胞株SW480的杀伤活性.提供DC联合CIK或LAK治疗结肠癌的实验依据.[方法]取人外周血分离出单个核细胞(PBMNC),诱导生成DC、CIK、LAK细胞;流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后的表型变化;以CIK+DC细胞、CIK细胞、LAK+DC细胞及LAK细胞作为效应细胞,SW480为靶细胞,以15∶1、30∶1、45∶1为效靶比,LDH释放法测定细胞杀伤试验活性;ELISA检测杀伤试验中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、IL-17的分泌水平.[结果]流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后,其表面分子HLA-DR、CD40、CD80和CD86表达分别平均为90.23％、73.68％、85.96％、57.55％,与未经肿瘤抗原冲击DC比较,DC成熟的表面标志分子表达明显增加(P＜0.01).相同效靶比下,CIK+DC细胞组对SW480的杀伤作用最强,明显高于其他细胞组(P＜0.01);CIK+ DC细胞组在效靶比为45∶1时,杀伤活性最强(P＜0.01);单独CIK细胞组的杀伤活性明显高于LAK+DC细胞组(P＜0.01);LAK+ DC细胞组的杀伤活性明显高于单独LAK细胞组(P＜0.01).效靶比为45∶1时,各杀伤试验细胞组上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17的分泌量,CIK+DC细胞组的IFN-γ、IL-12的分泌量显著高于其他细胞组(P＜0.05);LAK+DC、单独LAK细胞组IL-2的分泌量明显高于CIK+DC、单独CIK细胞组(P＜0.05);单独CIK细胞组IFN-γ的分泌量明显高于LAK+DC、单独LAK细胞组(P＜0.05).[结论]CIK+DC细胞组对SW480的杀伤活性明显强于单独CIK、LAK+ DC组、单独LAK细胞组.其机制可能是,SW480抗原致敏的DC分泌IFN-γ、IL-12等刺激、诱导CIK细胞的活化和增殖,明显增强CIK细胞杀伤SW480的活性.     

PTD-HBcAg融合蛋白诱导特异性CTL在HepG2.2.15细胞抑制HBV复制的研究

目的探讨PTD-HBcAg融合蛋白诱导小鼠体内特异性CTL并抑制HepG2.2.15细胞HBV复制的作用。方法 PTD-HBcAg、HBcAg和阴性对照分别与等体积的弗氏佐剂乳化后皮下免疫小鼠;第14d,分离脾淋巴细胞并分别用PTD-HBcAg、HBcAg、PTD和PBS加强刺激后收集上清,检测细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10;刺激后的淋巴细胞作为效应细胞与HepG2.2.15细胞共培养,检测,效应细胞对HBsAg、HBVDNA的抑制作用及对HepG2.2.15细胞、HepG2细胞的杀伤效果。结果 PTD-HBcAg组分泌的IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10与HBcAg组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05);PTD-HBcAg融合蛋白组较HBcAg组和阴性对照组有更明显的病毒抑制作用(P0.05);PTD-HBcAg组对HepG2.2.15细胞的杀伤率明显高于HBcAg组和阴性对照组(P0.05)。结论 PTD-HBcAg可诱导HBV特异性CTL,能有效抑制HepG2.2.15细胞HBV的复制。     

人脐血来源树突细胞抗乙型肝炎病毒细胞免疫的体外实验研究

目的借助DC的强大抗原呈递能力,使其负载HBsAg后以激活HBsAg特异性的CTL,从而探索一种可有效活化机体抗HBV细胞免疫的免疫方式。方法从健康产妇分娩的胎儿脐血中分离出单个核细胞,在细胞因子组合的作用下诱导出DC,于体外负载HBsAg后,激活自体T细胞成CTL,于体外培养环境下检测其对表达HBsAg的靶细胞HepG2-S的杀伤效应。结果人脐血来源的单个核细胞可在多种细胞因子的作用下,被诱导为DC。DC在负载HBsAg后可于体外活化HBsAg特异性的CTL。效应细胞为负载HBsAg的DC活化脐血单个核细胞,靶细胞分别为不表达和表达HBsAg的HepG2,当效应细胞和靶细胞比为1:1时出现最大的杀伤效率,CTL对靶细胞的杀伤率分别为(16.36±6.42)%和(78.09±9.66)%,差别有统计学意义(P<0.01)。结论健康人脐血来源的DC,具有较强的抗原呈递功能,可在体外激活产生HBsAg特异性CTL,在表达HBsAg的靶细胞模型上可观察到一定杀伤效果,为人脐血来源DC用于抗HBV治疗进行了有益的探索。     

骨髓瘤独特型抗原负载树突细胞介导的抗肿瘤效应研究

目的:研究骨髓瘤独特型抗原(Idiotype,Id)负载树突细胞(DC)对同源细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体外抗瘤活性的影响。方法:采集健康供者外周血单个核细胞(PBMNC)用常规方法诱导DC和CIK细胞,将骨髓瘤OPM-2细胞培养上清提取的Id冲击或未冲击的DC与CIK细胞共培养(CIK、DC加CIK、Id-DC加CIK),用流式细胞术分析细胞表型,MTT法检测体外效应细胞杀伤活性。结果:在(5～20):1效靶比范围内, CIK细胞对OPM-2和K562细胞的杀伤率分别为(24．47±3．00)％～(40．64±1．62)％和(23．36±1．51)％～(42．52±2．06)％。DC加CIK及Id—DC加CIK对OPM-2和K562细胞的杀伤活性均高于CIK组,差异有统计学意义(P<0．05);而在相同效靶比之下,Id-DC加CIK对OPM-2细胞的杀伤活性最强,差异有统计学意义(P <0．05)。结论:CIK细胞对骨髓瘤细胞有强的杀伤活性,经Id负载的DC与CIK细胞共培养能进一步增强其特异性杀伤活性,对骨髓瘤可能有免疫治疗作用。     

肝癌干细胞抗原致敏的DC-CTL对肝癌的抑制作用

目的研究肝癌干细胞抗原致敏的树突细胞(DC)-细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对裸鼠肝癌的抑瘤作用。方法肝细胞性肝癌患者手术后取肝癌组织,根据肝癌干细胞表面标志CD133,用磁珠分选法初步获得肝癌干细胞,反复冻融提取法获得肝癌干细胞抗原;采集同一患者外周血,加入细胞因子体外诱导、扩增抗原致敏的DC和细胞因子诱导的杀伤(CIK),从CIK中分选出CD3~+CD8~+T细胞;将肝癌干细胞抗原致敏的DC与CD3~+CD8~+T细胞共培养后,获得抗原致敏的DC-CTL细胞;制备裸鼠肝癌模型,动物实验观察抗原致敏的DC-CTL对裸鼠肝癌的抑瘤作用。结果肝癌干细胞抗原致敏的DC-CTL细胞和肝癌细胞抗原致敏的DC-CTL细胞对裸鼠肝癌均有极显著的抑制作用,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05),肝癌干细胞抗原致敏组的抑瘤率明显增高。结论肝癌干细胞抗原致敏的DC-CTL对肝癌具有显著抑制作用。     

IFNγ基因修饰的树突状细胞在肝癌免疫治疗中的应用

目的:研究IFNγ修饰的树突状细胞(dendriticcell,DC)对T淋巴细胞增殖和分化的影响以及后者对肝癌HepG2细胞的杀伤作用.方法:构建携带人IFNγ基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(Ad-IFNγ),用其感染人外周血单个核细胞来源的DC,观察后者表型和吞噬功能的变化.再用反复冻融裂解法提取的肝癌HepG2细胞抗原致敏DC,将其与自身T淋巴细胞共同培养,观察T淋巴细胞的增殖和分化情况以及活化T细胞对HepG2细胞的杀伤作用.结果:Ad-IFNγ转染后24 h.各组DC的吞噬能力差异无统计学意义(F=2.31,p=0.13).Ad-IFNγ转染的DC培养上清中有IFNγ的高表达,其表达量显著高于另外两组(P<0.01).Ad-IFNγ-DC促进T细胞增殖的能力明显强于Ad-LacZ-DC和NTDC(P<0.01).以HepG2细胞抗原致敏时,Ad-IFNγ-DC活化的T淋巴细胞对HepG2细胞的杀伤率在E:T=20:1和E:T=50:1时分别为43.64%±3.5l%和48.87%±4.83%.显著高于Ad.LaeZ-DC和NTDC组(p<0.001)结论:IFNγ的修饰能促进DC成熟,增强DC促进T淋巴细胞增殖的作用,诱导细胞免疫,增强T细胞的细胞毒作用,使T细胞能有效地杀伤肿瘤细胞.     

慢性乙型肝炎病毒感染产妇的胎儿脐带血树突状细胞的表型及功能

目的探讨孕妇慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染对其胎儿脐血的树突状细胞(DC)的表型和功能的影响,并与健康胎儿、健康成人及成人慢性HBV感染者进行对比研究。方法体外分离慢性HBV 感染产妇及健康产妇胎儿脐带血、健康成人及慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞进行树突状细胞转化,行流式细胞术对其表型进行分析,通过交叉混合淋巴细胞培养和DC培养上清液白细胞介素(IL)-12检测来分析DC的功能。结果慢性HBV感染产妇脐血来源DC的CD 80、CD 83的表达显著低于健康胎儿组、健康成人组、成人慢性HBV感染组,CD14的表达则显著高于此三组,P值均<0.0 5;慢性HBV感染产妇脐带血DC分泌的IL-12水平也明显低于健康产妇、健康成人组及慢性乙型肝炎患者(P<0.05);促异体T淋巴细胞增殖能力的强弱依次为健康成人DC-健康脐血T淋巴细胞>健康成人DC-健康成人异体T淋巴细胞>健康脐血DC-异体健康脐血T淋巴细胞>健康脐血DC-健康成人T淋巴细胞>孕母HBV感染脐血DC-健康脐血T淋巴细胞>孕母HBV感染脐血DC-健康异体成人T淋巴细胞。结论慢性HBV感染产妇胎儿脐血DC的成熟和功能显著低于健康胎儿脐血DC、健康成人甚至慢性乙型肝炎患者外周血DC。     

HBsAg、HBcAg活化树突状细胞治疗慢性乙型肝炎的体外研究

目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)经HBsAg、HBcAg活化后的免疫功能.方法 从慢性乙型肝炎患者外周血中培养扩增DC,在DC成熟前,加入纯的HBsAg、HBcAg刺激,用流式细胞仪检测DC表型,用液闪计数仪观察DC对T细胞的增殖作用,用ELISA法检测混合淋巴细胞反应(MLR)中细胞因子的分泌水平.结果 经HBcAg刺激DC的CD86表达率为(92.14±5.12)%,明显高于HBsAg刺激组和未加抗原组(P＜0.01);经HBcAg刺激组DC诱导同种异体静止T细胞增殖的能力每分钟液闪计数值(cpm)为34259±3127,明显高于HBsAg刺激组(20258±2917)和单个核细胞组(3469±417),P＜0.01;经HBcAg刺激组DC MLR中IL-12浓度为(342±42.3)ng/L,分别高于HBsAg刺激组和未加抗原组(P＜0.01).结论 体外经HBcAg刺激DC可有效提呈抗原病毒,并可进一步刺激T细胞产生.