树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

胆固醇酯转运蛋白基因型研究进展

胆固醇酯转蛋白 (ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｅｓｔｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎ ,ＣＥＴＰ)于1978年首先由Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ等从人血浆中分离纯化出来 ,主要负责血浆中中性脂质胆固醇酯 (ＣＥ)和甘油三酯 (ＴＧ)的转运。2 0多年来 ,人们对ＣＥＴＰ究竟是抗动脉粥样硬化 (ＡＳ)因子还是致ＡＳ因子一直争论不休 ,其基因表达特别是基因多态性和 (或 )基因突变引起的不同基因型在ＣＥＴＰ调节和活性中的作用及机制更是扑朔迷离 ,令许多希望揭示ＣＥＴＰ与ＡＳ的关系从而为ＡＳ的防治开辟新途径的科学家们进行了大量研究工作。随着分子生…     

胆固醇酯转运蛋白的提纯和鉴定

目的：分离纯化人血清胆固醇酯转运蛋白（ＣＥＴＰ），为制备ＣＥＴＰ单克隆抗体和ＣＥＴＰ浓度测定提供物质基础。方法：制备无脂血清，用Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ、ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００三步柱层析分离、纯化ＣＥＴＰ。结果：纯化的ＣＥＴＰ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ与ＣＥＴＰ特异性单克隆抗体免疫反应和活性测定等鉴定证实为纯化ＣＥＴＰ。结论：经三步柱层析获得了纯化ＣＥＴＰ，得率约２５％，活性３０ｎｍｏｌ／（μｇ·ｈ）。     

家兔胆固醇酯转移蛋白基因克隆及其真核表达载体的构建

目的: 克隆家兔胆固醇酯转移蛋白(CETP) 基因,构建其真核表达载体,研究CETP基因的结构与功能,为进一步研究CETP在动脉粥样硬化(As)中的作用机制提供参考。方法: 采用TRIzol提取家兔肝组织总RNA,采用RT-PCR 方法将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用LA Taq酶进行PCR扩增,克隆出CETP基因,将CETP cDNA片段克隆至pMD19-T载体上,对重组的CETP- pMD19-T测序后,登录GenBank进行序列比对,利用nnPredict软件分析预测CETP的二级结构。将CETP
cDNA片段克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。结果：测序及序列比对显示与M27486基因序列98%相符;家兔CETP基因cDNA全长1 659 bp,编码序列(CDs区)长1 494 bp,编码498个氨基酸。CETP的二级结构以α螺旋结构为主,相对分子质量为142119.4, pI为4.91。结论: 成功克隆了家兔CETP基因,并成功构建了其真核表达载体,明确了CETP的二级结构。     

胆固醇酯转运蛋白TaqIB基因多态性与视网膜中央静脉阻塞的关系

目的:探讨胆固醇酯转运蛋白(CETP)TaqIB基因多态性与视网膜中央静脉阻塞的关系。方法:采用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测60例经视网膜荧光造影诊断的视网膜中央静脉阻塞患者和120例对照者的CETP基因多态性。结果:视网膜中央静脉阻塞组B1/B1基因型频率(33.3%)明显高于对照组(12.5%)(P<0.05),B1等位基因频率(51.8%)也明显高于对照组(31.8%)(P<0.05)。结论:CETP基因和视网膜中央静脉阻塞的发病有关。     

胆固醇酯转移蛋白转基因家兔制作及生物学特性分析

摘要: 目的 制作肝脏特异性高表达人胆固醇酯转移蛋白（CETP）转基因家兔并对其生物学特性分析进行分析。方法 利用显微注射方法制作CETP转基因家兔,利用Western Blot、Real-time PCR和CETP活性鉴定试剂盒鉴定模型家兔中人CETP转基因的表达和活性。结果 PCR检验结果显示我们成功获得CETP转基因家兔,转基因主要在肝脏特异性表达,其血浆CETP活性相对于非转基因家兔明显升高。结论 本研究首次成功建立了高表达人CETP的转基因家兔,为研究CETP功能和其参与心血管疾病的机制提供了良好模型。     

血清胆固醇酯转运蛋白的变化及临床应用

目的 :了解胆固醇酯转运蛋白 (CETP)对动脉粥样硬化的致病关联性。方法 :以ELISA法检测正常健康者及患者血清中CETP的浓度 ,同时检测了血脂其他相关指标。进行统计学处理 ,进行正态性检验 ,相关性分析 ,参考值的确定。结果 :正态性检验呈正偏态分布。参考范围 0 .33～ 4 .7mg·L- 1 。CETP与脂类其它指标无明显的相关性。结论 :显示CETP浓度过高或过低或缺乏均与动脉粥样硬化的形成存在着明显的关联性 ,具有临床应用价值。     

胆固醇酯转运蛋白变异体Ile405Val及其对HDL代谢的影响

通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增胆固醇酯转运蛋白（ＣＥＴＰ）基因,继而采用荧光直读法测定ＣＥＴＰ基因ＤＮＡ序列,首次发现一频发ＣＥＴＰ基因突变点,即ＣＥＴＰ第４０５位异亮氨酸残基（Ｉｌｅ）为缬氨酸残基（Ｖａｌ）取代（Ｉｌｅ４０５Ｖａｌ）。用分子流行病学方法进一步研究表明该ＣＥＴＰ基因变异体在德意志和意大利人群中出现频率显著不同（０．３０ｖｓ０．４０,Ｐ＜０．０１）,但均与血清高密度脂蛋白－胆固醇（ＨＤＬ－Ｃ）的升高密切相关（均为Ｐ＜０．０１）。     

树鼩肝组织cDNA文库的快速构建

目的:为了研究不易感动脉粥样硬化动物树鼩多种载脂蛋白的基因分子结构,我们在国内外首次快速构建了树鼩肝细胞cDNA文库。方法:采用一步法提取树鼩肝细胞总RNA;以寡核胸苷酸为吸附介质,柱层析法进一步纯化mRNA。以此为模板,利用改良的cDNA快速合成方法,反转录合成树鼩肝细胞cDNA第一、二链。对cDNA双链末端修饰,连接含双酶切位点的连接子后重组于噬菌体载体。结果:包装后获得2.1×10~6高滴度的树鼩肝细胞cDNA文库,放射自显影显示合成的cDNA产物大小在400～5000个核苷酸之间,该文库的克隆重组率为98.5％以上,PCR扩增随机提取的白色噬菌斑DNA,电泳鉴定均有cDNA插入片段。以制备的两种多价抗血清为探针,从构建的cDNA文库中筛选克隆出完整的树鼩apoAI和apoCI的cDNA核苷酸序列。结论:与常规方法比较,本法简便、快速,易于操作和掌握。本研究还对应用此方法构建cDNA文库的某些环节进行了探讨。     

树鼩在眼科学的基础研究进展

树鼩具有发达的视觉系统，视锥细胞数量占感光细胞的96%，具有较好的色觉及立体视觉，且树鼩资源丰富，成本较低，比较医学和基因组学研究证实树鼩是理想的眼科实验动物模型。利用树鼩开展眼科研究主要集中在近视模型的建立、近视对巩膜和脉络膜造成的变化，以及树鼩视网膜、视神经、角膜基础及视皮质的研究。本文对树鼩在眼科学的基础研究进行综述。     

广西和云南树鼩群体遗传多样性的比较分析

目的 比较分析我国广西、云南两个树鼩群体的遗传差异和分化程度,推动树鼩优良品系的培育和优化实验动物模型。方法 提取广西和云南各32只树鼩的全血基因组DNA,分别采用9对荧光标记微卫星引物进行PCR扩增,通过毛细管电泳技术检测扩增片段,并利用POPGENE等软件比较两个树鼩群体的遗传相关指标。结果 广西和云南两个树鼩群体平均期望杂合度（He）为0.703,平均多态信息含量（PIC）为0.725,Fis均值>0。CCBL1B、CCDC61、EDA1和OPA3四个位点表现为极显著偏离哈迪-温伯格平衡。两群体的遗传距离及无偏遗传距离分别为1.277和1.268,遗传相似系数约为0.28。遗传结构变异的分布情况显示61.57%的微卫星遗传变异来自于群体内部,38.43%存在于群体之间。STRUCTURE分析发现广西和云南树鼩为中缅树鼩群体的两个不同的亚种。结论 广西和云南树鼩两个群体的遗传多样性都较丰富,两个群体间具有较大的遗传差异和分化程度,遗传变异主要来源于群体内部。     

树鼩HGF全长编码序列的克隆及分子特征分析

目的获取树鼩肝细胞生长因子的全长编码序列并进行分子特征分析。方法以树鼩肝组织总RNA为材料,通过RT-PCR扩增和序列拼接获得树鼩肝细胞生长因子全长编码序列,进而通过DNAMAN,Pymol等生物信息学软件对其序列和分子特征进行分析。结果树鼩HGF分子结构在进化中相对保守,树鼩HGF整体结构与人相似。但树鼩HGFαNK1区域相比人HGF多出一个α螺旋,并且有两个更长的β折叠片,另外,树鼩在该区域存在一个很强的表面正电荷区域。这些差异可能会对树鼩HGF与其受体的作用方式产生影响。结论本实验为明确树鼩HGF与其受体的作用方式和树鼩HGF的合成与制备奠定了基础。     

茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型的建立

目的 采用临床分离的茄病镰刀菌感染树鼩角膜,建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。方法 茄病镰刀菌接种到沙保氏培养基,26℃培养箱培养7 d,收集真菌混悬液,血细胞计数板调整孢子数量为1×10¹⁰CFU/mL。清洁级树鼩40只随机分为实验组（n=30）、对照组（n=10）。实验组用胰岛素针头（29 G）将真菌孢子混悬液50 μL注入角膜基中央,对照组注入生理盐水50 μL。通过前段照相、共聚焦显微镜检查、病理组织学变化、感染角膜组织培养对模型进行评价。结果 真菌浸润范围、角膜上皮细胞和内皮细胞水肿程度、菌丝数量均与时间呈正相关;炎性细胞浸润数量造模后第7天达到高峰,以中性粒细胞为主;实验各时间点均可见菌丝平行于基质纤维生长;感染后角膜组织培养可见茄病镰刀菌生长;造模成功率为86%。结论 采用基质注射茄病镰刀菌孢子的方法首次成功建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别,建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL,说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现,EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出,间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上,确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性,初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。