Bcl-2基因特异性小干涉RNA增强食管癌细胞辐射敏感性的实验研究

目的 探讨Bcl-2基因特异性的小干涉RNA (siRNA)对食管癌细胞的辐射增敏作用。方法 构建表达Bcl-2基因特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入食管癌细胞EC109。Western blot检测Bcl-2蛋白在食管癌细胞的表达,流式细胞仪检测食管癌细胞的凋亡,克隆形成实验和裸鼠移植瘤生长抑制实验检测Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射对食管癌的生长抑制作用。结果 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可抑制Bcl-2蛋白在EC109细胞中的表达,诱导EC109细胞凋亡,增强X射线照射对EC109细胞克隆形成的抑制能力,增强X射线照射对EC109裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结论 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可显著增强食管癌细胞对X射线照射的敏感性,具有良好的临床应用前景。     

5-脱氧杂氮胞苷调控p16基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及调亡的影响

目的:探讨甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-CdR)对人宫颈癌HeLa细胞增殖和调亡的作用及其可能机制。方法:应用不同浓度的5-Aza-CdR处理HeLa细胞,甲基化特异PCR(MSP)法检测处理前后p16基因甲基化状态,应用RT-PCR方法检测p16基因mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:人宫颈癌HeLa细胞p16基因启动子区呈高甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加。结论:5-Aza-CdR能够逆转p16基因甲基化状态,调控p16基因表达,并有效抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖和诱导细胞调亡。     

fas基因修饰食管癌细胞的体外抑瘤效应

为研究fas基因转导对食管癌细胞的体外抑制作用，构建fas基因真核表达3载体fas-pBK并将其转导入食管癌细胞EC109.Western blot结果证实fas基因转导株Fas-EC109表达高水平的Fas蛋白；细胞生长曲线和软琼脂集落形成实验结果显示，与对照细胞相比，Fas-EC109的群体倍增时间延长，克隆形成能力降低，MTT比色法表明Fas-EC109对CDDP、VCR、5－FU的敏感性明显增加。本研究结果提示，转导fas基因能有效抑制体外培养的食管癌细胞的生长，增强癌细胞对化疗药物的敏感性。     

紫花牡荆素诱导食管癌细胞凋亡的分子机制

目的观察紫花牡荆素对食管癌（esophagus carcinoma,EC）细胞增殖能力的影响并探讨其分子机制。方法以噻唑蓝比色法与侵袭实验检测不同浓度紫花牡荆素处理对食管癌细胞株EC9706与EC109细胞增殖能力的影响,流式细胞术定量分析细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤 2相关蛋白（B cell lymphoma 2 associated X protein,BAX）、活化型Caspase 3及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达变化。结果不同浓度紫花牡荆素处理显著抑制EC9706与EC109细胞增殖水平并诱导细胞凋亡,同未加药（0 μmol/L）组比较差异均有统计学意义（P＜005）;紫花牡荆素处理可以上调BAX与Caspase 3表达水平,下调VEGF 表达水平。结论紫花牡荆素处理后导致BAX和活化型Caspase 3表达上调、VEGF表达下调可能是其抑制食管癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的重要分子机制。     

宫颈癌中H19基因的特异表达模式及印记缺失分析

目的探讨H19等位基因在宫颈癌中特异性表达的模式,H19基因的基因组印记缺失与宫颈癌两者之间的关系。方法结合PCR和限制性片段长度多态性分析（RFLP）技术以及DNA甲基化检测技术分析我院收集的宫颈癌标本H19等位基因进行杂合子筛选,并进一步研究基因组印记缺失与宫颈癌两者之间的关系。结果在36例宫颈癌中筛选出16例杂合子现象的标本,在这16例杂合子标本中,有7例发生了基因组印记缺失;H19基因发生基因组缺失现象与其启动子区域的高度去甲基化正相关。结论H19基因的基因组印记缺失可能和宫颈癌的发生有着高度的相关性。     

miR-138-5p通过调控Survivin表达对食管鳞癌细胞活性的影响

目的 探究miR-138-5p通过调控Survivin表达对食管鳞癌细胞活性的影响。方法 将实验分为W组（无转染组）、C组（食管鳞癌细胞转染NC组）、Z组（转染miR-138-5p组）。RT-PCR检测Survivin、miR-138-5p水平;Western blot检测Notch1、HIF-1α、MMP-9的表达;Transwell小室测迁移能力;CCK-8检测增殖能力;流式细胞仪检测凋亡情况;双荧光素酶报告基因检测miR-138-5p与Survivin靶向关系。结果 miR-138-5p在食管鳞癌组织中的水平低于癌旁组织（P<0.05）;食管鳞癌组织中Survivin水平较癌旁组织高（P<0.05）。miR-138-5p、Survivin在W组与C组中的水平较为接近（P>0.05）;与C组相比,Z组miR-138-5p的水平有所上升、Survivin水平有所下降（P<0.05）,由此可看出,miR-138-5p转染成功。W组与C组中Notch1、HIF-1α、MMP-9水平较为接近（P>0.05）;与C组相比,Z组中Notch1水平有所升高、HIF-1α、MMP-9水平有所下降（P<0.05）。W组食管鳞癌细胞迁移数量（282.67±27.65）与C组细胞迁移数量（279.31±28.22）相差较小（P>0.05）;与C组相比,Z组的迁移数量（76.57±6.71）有所降低（P<0.05）。W组与C组在各时间点的OD值较为接近（P>0.05）;Z组在各时间点的OD值均较W组与C组低（P<0.05）。W组食管鳞癌细胞凋亡率（2.47±0.11）%与C组食管鳞癌细胞凋亡率（2.45±0.13）%较为接近（P>0.05）;Z组食管鳞癌细胞凋亡率（13.32±1.23）%高于W组与C组（P<0.05）。双荧光素梅报告基因检测实验结果显示Survivin′-UTR-WT在miR-NC组表达水平为（0.79±0.09）、miR-138-5p组表达水平为（0.59±0.07）,组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）;Survivin′-UTR-MUT在miR-NC组（0.91±0.11）及miR-138-5p组（1.02±0.12）表达无显著差异（P＞0.05）。与食管癌组比较,miR-138-5p组大鼠移植瘤的瘤体积、瘤质量降低,抑瘤率升高（P<0.05）。结论 miR-138-5p可通过降低Survivin的表达,抑制食管鳞癌细胞的增殖及迁移,并促进其凋亡。     

食管反流促进肿瘤发生与抑癌基因mRNA表达的相关性

为研究胃二十指肠食管反流的大鼠诱癌过程中食管组织内p53,p16,p21等抑癌基因的mRNA表达，制作3种食管反流动物模型及对照组，术后均注射致癌剂，用原位杂交法检测术后20，26周时食管组织中p53,p16,p21基因的mRNA表达。结果显示，各反流组食管上皮中p53的mRNA表达均较对照组显著增强，其中十二指肠食管反流组（D组），十二指肠胃食管反流组（DG组）的表达较胃食管反流组（G组）更强，D组与DG组结果相似；D，DG组的p16,p21基因mRNA表达较C组减弱，而G组与C组相比差异无显著性意义。提示胃液及十二指肠内容物反流可改变抑癌基因在转录水平的表达，促进大鼠食管肿瘤的发生，其中十二指肠内容物的作用较强。     

GJB2基因突变始祖效应对中国耳聋人群的影响

目的 对中国耳聋患者中缝隙连接蛋白beta2(gap junction protein beta 2,GJB2)基因突变情况进行筛查,探寻该基因各种突变的分布情况。方法 在聋病门诊收集各种感音神经性聋患者141例,其中非综合征型耳聋135例(有家族史者17例),综合征型耳聋6例。另外收集听力正常者150例作为对照。采取PCR扩增、直接测序的方法检测GJB2基因突变。结果 在耳聋患者中发现7种GJB2基因碱基改变：79G→A,A,109G→A,341A→G,235deC,455A→G,176→191del16和504insGCAA。79G→A纯合15例,杂合5例;341A→G纯合4例,杂合8例;109G→A纯合1例,杂合4例;235deC纯合5例,杂合6例;176-191del16杂合3例;504insGCAA杂合2例;455A→G杂合1例。结论 在耳聋患者中开展GJB2基因的筛查工作可以将235delC作为一个候选突变筛查位点。     

ACE基因插入/缺失及β2肾上腺素受体基因多态性与房颤的相关性研究

目的：研究血管紧张素转换酶基因插入／缺失（ACEI／D）多态性及隧肾上腺素受体基因（β2-AR＋46A—G）多态性与心房颤动的相关性，寻找房颤发病的分子机制。方法：选择55例房颤患者（房颤组）及63例非房颤者（对照组），用PCR的方法检测两组ACE基因插入／缺失多态性，用RFLP法检测隧-AR＋46A→G变异。结果：房颤组与对照组ACEI／D多态性缺失纯合型（DD型）、杂合子（DI型）、插入纯合型（Ⅱ）基因型频率分别为32．76％、41．8％、25．5％和19．0％、44．4％、36．5％；房颤组与对照组β2-AR＋46A→G多态性Gly16纯合型、Arg16纯合型、Gly16／Arg16基因型频率分别是12．7％、17．47％、61．8％和14．3％、25．3％、60．3％；房颤组与对照组D等位基因、I等位基因分布频率为53．6％、46．4％和41．2％、58．7％；房颤组与对照组Gly16等位基因、Arg16等位基因分布频率为39．6％、60．4％和38．9％、61．1％；其中D等位基因分布频率在房颤组中较对照组明显增大；在9种不同基因型联合中发现，Gly／Arg型＋DD型和Gly型＋DD型的两种联合在房颤组和对照组间的分布有明显差异（P〈0．05），且这两种联合基因型发病相对危险度（OR）=2．455（95％CI：1．080～5．579）。结论：D等位基因可能是房颤的易患因素；ACEDD基因型与心肌纤维化及心脏重构的关系较为紧密，β2-AR基因＋46A→G多态性、ID基因型和Ⅱ基因型与心肌纤维化及心脏重构无明显相关性；β2-ARGly16等位基因与ACEDD基因型的联合可能对房颤的患病有着潜在的影响。     

IL-34对食管鳞癌细胞增殖、凋亡和迁移的作用研究

目的 研究白细胞介素-34(interleukin 34, IL-34)在食管鳞癌中的表达及其对食管鳞癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 采用免疫组织化学染色检测IL-34在食管鳞癌组织标本中的表达情况,采用qRT-PCR法探究IL-34在不同食管鳞癌细胞系中mRNA表达水平。利用慢病毒感染,过表达食管鳞癌细胞系ECA-109中IL-34,高内涵筛选后通过Celigo细胞计数检测细胞增殖能力,通过流式细胞术检测细胞凋亡能力,通过划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力。结果 癌组织中IL-34水平高于正常组织,但由于临床样本过少差异无统计学意义(P>0.05);食管鳞癌细胞系中IL-34的mRNA水平显著高于正常食管上皮细胞(P<0.01)。IL-34过表达可显著减少ECA-109细胞凋亡,促进其增殖和迁移(P<0.01)。结论 IL-34在食管鳞癌中过表达,并与食管鳞癌细胞的增殖、迁移和凋亡显著相关,可能成为食管鳞癌新的标志物。     

INK4A基因及P16蛋白在辐射诱导小鼠白血病模型中的变化

目的 研究INK4A基因及编码的P16蛋白在辐射诱导的小鼠白血病模型中的改变。方法 7.0 Gy ⁶⁰Co γ射线分4次照射BALB/c小鼠建立辐射诱导的小鼠白血病模型; PCR扩增INK4A 基因第1、第2 外显子,检测等位基因纯合性缺失,甲基化敏感酶切PCR 法检测INK4A基因的甲基化发生情况,并应用PCR单链构象多态性分析方法检测碱基突变的发生;Western blot检测P16蛋白含量改变。结果 在21例白血病模型组织中,外显子2缺失5例,4例发生甲基化,有11例蛋白表达明显下降。结论 辐射诱导的小鼠白血病模型发生过程中伴有P16蛋白表达下降, INK4A基因改变以纯合性缺失和甲基化为主。     

食管癌及癌旁组织p53蛋白、VEGF及MVD联合检测的临床意义

目的讨论食管癌及癌旁组织中MVD、VEGF和p53蛋白表达与食管癌临床、病理因素之间的关系,探讨其表达在食管癌患者转移、预后中的作用,并为以食管癌血管生成为靶点的靶向治疗提供理论基础。方法采用免疫组织化学方法,检测30例食管癌患者手术切除标本中癌灶、癌近旁、癌远旁组织的p53蛋白、VEGF的表达,并用FⅧ相关抗原标记、检测MVD。进行统计学分析,探讨其在性别、年龄、临床分期、淋巴结转移、生存率中的关系。结果①癌灶内VEGF阳性染色主要位于癌细胞胞浆内,癌灶p53蛋白阳性染色主要位于癌细胞胞核内,呈棕褐色。肿瘤内血管分布呈明显异质性,在癌组织浸润的边缘较密集,p53蛋白、VEGF、MVD与食管鳞癌关系在性别、年龄、TNM中无显著性差异。但在不同部位、有无淋巴结转移和5年生存率中有显著的统计学差异。②p53蛋白与VEGF表达有显著相关性（P〈0．05）。③p53、VEGF表达与MVD相关性具有显著统计学差异。结论在食管鳞癌组织及癌近旁、癌远旁组织中p53蛋白、VEGF、MVD均有不同程度表达,阳性表达率有显著性差异。联合检测可作为食管鳞癌恶性潜能的重要生物学指标．并为食管癌手术切除长度从一个新的角度提供参考及理论基础,并可作为其判断预后的重要生物学指标,并为以血管生成为靶点的靶向治疗提供参考。     

胃癌中TIMP3基因的甲基化与表达间的相关性分析

目的探讨转移抑制基因TIMP3(金属组织蛋白酶抑制因子-3)在胃癌和胃癌细胞系中启动子甲基化及其蛋白和mRNA表达的特点,并分析两者之间的关联。方法应用MSP法检测TIMP3基因启动子区的甲基化状态;RT-PCR和免疫组织/细胞化学法检测TIMP3基因mRNA和蛋白的表达;观察DNA去甲基化剂(5-aza-2’-deoxycitydine)对人胃癌细胞系(MGC803和HGC-27)细胞系TIMP3基因表达的影响。结果TIMP3基因于胃癌组织中的甲基化频率为17/33(51.5%);四个胃癌细胞系均存在TIMP3基因的甲基化,而MGC803、BGC823和HGC-27仍有该基因的表达或低水平表达;在去甲基化剂的作用下TIMP3基因的表达水平明显上调。结论TIMP3的异常甲基化是其表达下调或沉默的主要原因并存在部分甲基化的倾向。该指标可作为胃癌的敏感性表观遗传学标记物在胃癌的筛查和诊断中应用。     

表观遗传抑制剂对人肝癌Hep-G2细胞p14基因表达及甲基化的影响

目的探讨表观遗传抑制剂对人肝癌Hep-G2细胞p14基因表达及甲基化的影响。方法人肝癌Hep-G2细胞经过不同浓度和不同时间的5-Aza-CdR和TSA处理,采用MSP法检测p14基因甲基化水平,其表达水平采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测。结果 5μmol/L 5-Aza-CdR和0.4 mg/L TSA对Hep-G2细胞的生长抑制作用最强;处理时间为3 d时,对细胞的影响最强;二者诱导Hep-G2细胞的凋亡效果也在同样的浓度和时间点表现最强。同时观察到,5-Aza-CdR和TSA能诱导p14基因去甲基化,增强mRNA表达水平。结论 p14甲基化在肝癌细胞生长过程中发挥重要作用,表观遗传抑制剂有助于p14表达上调,恢复其肿瘤抑制作用。     

p16缺失/突变与周围型肺癌CT及病理的相关性研究

目的：通过对周围型肺鳞癌和腺癌抑癌基因p16缺失／突变的检测，并将其与鳞癌和腺癌的病理表现、CT表现相联系，探讨它们之间的相关性，明确具有鉴别诊断价值的CT征象。资料与方法：63例肺内肿瘤样病变，行普通CT和HRCT检查。利用PCR－SSCP法检测病变p16 exon2缺失／突变。结果：鳞癌和腺癌间p16 exon2缺失率／突变率无差异。有淋巴结转移、分化程度低者p16exon2缺失率／突变率明显增高（P＜0．05）；有短毛刺、棘突、空泡征、胸膜凹陷、灶周短线影的鳞癌和腺癌p16 exon2缺失率／突变。率明显高于无以上征象者。结论：鳞癌和腺癌p16缺失／突变与组织学类型无关，p16缺失／突变可作为评价肺鳞癌和腺癌恶性程度、淋巴结转移潜能及预后的有效指标之一。具有棘突者p16缺失率／突变率明显增高，是周围型肺鳞癌和腺癌最有诊断价值的征象，其次为短毛刺、空泡征、灶周短线影和胸膜凹陷征。     

食管癌细胞系TE13R120放射抗性与HDAC3、NF-kB和NRAGE关系的研究

目的探讨HDAC3、NF—kB和NRAGE基因与食管癌细胞放射抗性的关系。方法以人食管癌细胞系TE13和由TE13经γ射线反复照射建立的放射抗性细胞系TE13R120为研究对象，用Western blotting技术检测这两种细胞于不同时间、剂量点照射后基因HDAC3、NF—kB和NRAGE的蛋白表达；用流式细胞术检测相同时间、剂量点两种细胞的凋亡和细胞周期分布情况。结果Western blotting显示，与TE13相比，TE13R120细胞照射前后HDAC3的核表达均增高，NF-kB的表达也明显增强，NRAGE在两种细胞胞浆中的表达无差异。与TE13相比，TE13R120中S期细胞明显增多，照射后G2期阻滞明显，凋亡水平较低。结论基因HDAC3和NF-kB可能在食管癌细胞放射抗性形成中发挥作用并可能有协同作用；NRAGE与食管癌辐射抗性的关系有待进一步研究。     

p16基因转染对胰腺癌细胞生长及辐射敏感性的研究

目的 探索p16基因转染对胰腺癌细胞生长辐射敏感性的作用。方法 将外源野生型p16基因连接到pCDNA3.1^＋载体构建pCDNA3.16＋ -p16重组质粒,利用Lipofectamine^TM介导转染胰腺癌JF305细胞,筛选阳性克隆。照射后,RT-PCR检测p16基因表达,Western blot检测蛋白表达;用MTT法测定细胞生长曲线和肿瘤细胞杀伤率。结果 转染p16基因的JF305细胞有外源p16基因的整合及表达,生长速度明显减少,对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胰腺癌细胞恶性增殖,提高胰腺癌细胞对辐射的敏感性。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合曲古菌素A对人胃癌细胞株化疗敏感性的协同增强作用

目的探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)联合曲古菌素A(TSA)协同增强人胃癌细胞MKN-74化疗敏感性的作用及机制。方法以MTT法观察5-Aza-CdR和(或)TSA与氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂(OXA)、伊立替康代谢产物SN38或吉西他滨(GEM)联合应用对MKN-74细胞生长的抑制;流式细胞术分析细胞凋亡情况;RT-PCR检测p21、caspase3、Rb和p16基因表达,经Bandscan4.3分析软件进行条带灰度分析,计算目的基因与GAPDH灰度比值。结果5-Aza-CdR联合TSA可进一步增强5-Aza-CdR对5-FU、PTX、OXA或GEM的化疗增敏作用,也可以增强TSA对OXA、GEM的化疗增敏作用。TSA OXA组、5-Aza-CdR OXA组与5-Aza-CdR TSA OXA组的细胞凋亡率分别为28.07%±2.37%、25.33%±2.84%及38.37%±3.23%;TSA GEM组、5-Aza-CdR GEM组与5-Aza-CdR TSA GEM组的细胞凋亡率分别为17.20%±2.07%、19.30%±2.95%、29.57%±3.10%(P<0.05),说明5-Aza-CdR联合TSA协同可以促进OXA或GEM诱导MKN-74细胞凋亡。5-Aza-CdR联合TSA还可以增强caspase3、p16、Rb和p21基因的表达,与对照组(以其灰度值为1.00)相比,4种基因的表达分别为2.67、2.28、2.39和2.75。结论5-Aza-CdR联合TSA可能通过协同调控基因表达、诱导细胞凋亡,提高胃癌细胞的化疗敏感性。