中国鼠疫耶尔森菌染色体结构特征的研究

目的 了解中国鼠疫耶尔森菌不同分离株之间的染色体结构差异,探索染色体重排在鼠疫菌中发生的原因及用于菌株遗传特征识别和亲缘关系分析的可能性.方法 以完成全基因组测序的首株鼠疫菌株CO92(美国)为参考株,以从中国分离出的已完成全基因组测序的4株鼠疫菌株(内蒙古91001、云南剑川D182038、云南玉龙D106004、西藏那曲Z176003)为对比株,根据美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)上公布的这5株鼠疫菌的染色体序列及染色体上所有编码基因序列间的相似性,将鼠疫菌染色体人为的划分成多个大的DNA节段(染色体板块),确定这些板块在不同鼠疫菌株间排列方式的差异以及板块之间的断裂区片段的基因组成;根据菌株两两比较所得的重排差异结果,分析菌株间的亲缘关系.结果 除Z176003菌株外,CO92、D182038、D106004、91001菌株可被分成44个相对独立的染色体板块,板块内部基因组成和排列高度稳定,板块之间可以相对移动.与参考株CO92菌株比较,D182038、D106004菌株染色体均存在13处重排,Z176003菌株染色体存在14处重排,91001菌株染色体存在37处板块排列顺序的改变.菌株间两两比较,D106004与Z176003菌株之间仅有8处染色体板块排列方式不同,表明二者的亲缘关系最为接近.CO92菌株染色体上的相邻板块之间存在43个断裂区,有39个断裂区的DNA片段含有插入序列,其中25个插入序列为IS100.结论 鼠疫菌基因组具有一定的流动性,不同菌株间的染色体结构存在较大差异,染色体重排事件发生的原因与其拥有的插入序列密切相关.菌株间染色体的重排差异,能用于菌株遗传特征的识别和亲缘远近关系的分析.     

云南省不同型鼠疫自然疫源地鼠疫菌生化特性比较

目的 通过对云南省不同流行地区、宿主、媒介分离出的鼠疫菌生化特性及毒力因子Pst Ⅰ的鉴定结果,比较云南省家、野鼠型鼠疫自然疫源地及新发现玉龙县鼠疫疫源地鼠疫菌生化特性的差别及疫源地相互之间的联系.方法 采用资料回顾方法,收集用试管法鉴定的云南省218株鼠疫菌生化特性(酵解鼠李糖、甘油、麦芽糖、阿胶糖、密二糖)和毒力因子Pst Ⅰ的结果,利用SAS 8.0统计软件进行汇总,采用双向无序R×C表χ2检验的Fisher确切概毕法对鉴定结果进行分析.结果 收集野鼠型鼠疫疫源地鼠疫菌48株.其中有1株发酵麦芽糖,48株均发酵甘油;收集家鼠型鼠疫疫源地鼠疫菌165株,其中有1株不发酵麦芽糖、发酵甘油,1株脱氮阴性,属变异菌株;收集玉龙县新分离鼠疫菌5株,均发酵甘油、麦芽糖.对不同疫源地鼠疫菌麦芽糖、甘油发酵试验结果进行比较,差异有统计学意义(P<0.01);对鼠疫菌鼠李糖、阿胶糖、密二糖发酵试验和毒力因子Pst Ⅰ进行比较.差异无统计学意义(P>0.01).结论 云南省不同型鼠疫自然疫源地鼠疫菌生化特性不同,其中家、野鼠型疫源地鼠疫菌生化特性有交串现象;玉龙县鼠疫菌生化特性与家、野鼠型疫源地鼠疫菌截然不同,与西藏北部旱獭鼠疫菌的生化特性接近.     

云南省玉龙县鼠疫菌的生化特性

目的 对玉龙县、云南家、野两型及西藏北部旱獭鼠疫菌代表株的生化特性进行比较,分析玉龙县疫源地的性质.方法 采用常规方法对玉龙县鼠疫菌、云南省家、野两型及西藏北部旱獭型共12株鼠疫菌代表株进行生化特性的研究.结果 5株玉龙县鼠疫菌发酵甘油、麦芽糖、阿胶糖,不发酵密二糖、鼠李糖,脱氮阳性.结论 玉龙县鼠疫菌与云南剑川菌株(野鼠型)及云南省家鼠型菌株生化特性不同,与西藏北部旱獭鼠疫菌的生化特性接近;按纪树立分型接近于喜马拉雅早獭青藏高原生态型,按宋延富分型属于喜马拉雅旱獭生物型A生物亚型.     

四川省石渠县鼠疫菌脉冲场电泳分析

目的：确定四川省石渠县分离的鼠疫菌株的类型。方法：脉冲场电泳。结果：四川分离的鼠疫菌中出现3个图型。从鼠疫病人分离到的菌株与青海田鼠体分离的菌株明显不同，而与强毒的青藏高原型菌株相似；青海田鼠体分离的菌株与内蒙古布氏田鼠型菌株相似，与其他地区的菌株均不相同。结论：青海田鼠间可能存在一种独立的鼠疫自然疫源地，1999年四川省石渠县发生的人间鼠疫并非由该地占优势的青海田鼠型菌株引起，可能在该疫源地之外感染。     

中国鼠疫菌某些生化特征及地理分布

目的 探讨中国鼠疫菌株生化性状及地理分布特征。方法 采用常规方法,研究我国现有11种类型的鼠疫自然疫源地2 370株鼠疫菌酵解麦芽糖、鼠李糖、蜜二糖、阿胶糖、甘油及脱氮反应的变化。结果 根据测定结果,与地理分布生物群落联系起来,可将中国鼠疫自然疫源地鼠疫菌分为新的17个生化型:青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地分离的鼠疫菌定名为川青高原型,新疆准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌定名为准噶尔型,云南省玉龙县大绒鼠、齐氏姬鼠分离暂定名为玉龙型。青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地生化性状较为复杂,含5种类型生化型,其中藏南地区1983年后新增加了27个疫源县,本研究发现青藏高原型菌株不仅只分部在藏北高原,在藏南地区已有分布,且岗底斯山型菌株原来只分布在西南地区的仲巴、普兰,现已延伸到藏南地区。还发现一些鼠疫自然疫源地鼠疫菌生化特性有交串现象,如云南省家、野鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌,内蒙古高原长爪沙鼠、达乌尔黄鼠鼠疫自然疫源地。结论 中国鼠疫菌对糖酵解特性较稳定,鼠疫菌生化型在各疫源地呈明显的地区性分布,与主要宿主、地理气候条件、植被等密切相关,分为17个生化型。     

利用分子生物学技术对鼠疫耶尔森菌的分类鉴定

目的 对4株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)自然分离株.方法 用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征.结果 4株菌具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖(+)、鼠李糖(-)、麦芽糖(+)、蜜二糖(-)、甘油(-)、脱氮(+),与鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV76)一致;其毒力因子为F1(+),VW(+),Pgm(-),PstⅠ(+),与鼠疫菌菌苗株(EV)特征完全一致;109个/ml可疑菌对实验动物小白鼠无致死能力.具有鼠疫标识基因;差异片段(DFR)分型结果,4株菌的24个DFR扩增,DFR谱不同于任何鼠疫菌自然分离菌株基因组型.结论 尽管4菌株具备鼠疫菌自然分离株的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌自然分离株,而是鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV菌).     

鼠疫耶尔森菌基因组中IS100插入位点的特异性分析

目的 通过鼠疫耶尔森菌基因组中插入序列IS100位点的特异性研究,对我国鼠疫菌基因组的构成类型和特点进行分析.方法 以鼠疫菌东方变种CO92全长序列为参考,选择5个位置的IS100位点,在IS100基因相邻两外侧设计1对引物,在IS100基冈内设汁1对向外引物使其分别能够与两外侧引物扩增.对来自13个生态型的91株鼠疫菌和1株假结核耶尔森菌进行PCR扩增,产物进行克隆测序分析,同时把各菌株的IS100位点情况标记在我国鼠疫疫源地类型慨图上二进行分析.结果 实验所用91株鼠疫菌在所选定IS100位点出现含有和不含IS100的插入序列,基因片段组成相对CO92序列已发生改变,而且这些IS100基因型的组成在我国鼠疫自然疫源地中呈现区域性分布.结论 IS100基因型别分布与我国鼠疫菌疫源地分型分布基本一致,并直接反映了鼠疫菌基因组某特定位点的基因组成状况及其在进化过程中的高度流动性.     

海南州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐消毒剂及耐药相关基因的检测

目的了解海南州鼠疫疫源地分离的鼠疫菌耐消毒剂及耐药相关基因携带状况,以指导该疫源地的鼠疫防治。方法根据美国国立生物信息中心(NCBI)公布的耐消毒剂qacEdelta1-sul1基因、耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、shv、ctx-m基因及耐磺胺类药物sull、sul2、sul3基因序列,分别在每个基因上设计一对引物,逐一对87株分离自青海省海南州鼠疫自然疫源地的鼠疫菌的DNA进行PCR扩增,扩增产物进行凝胶电泳,用凝胶成像系统拍照后读取结果。结果 PCR扩增结果显示,阴性对照和阳性对照均成立,87株鼠疫菌的PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,均未在预计的DNA标志物(Mr)处出现条带,其PCR扩增结果均为阴性。1954-2016年期间从青海省海南州共和县、贵德县、同德县、兴海县、贵南县分离的鼠疫菌株中尚未发现有耐链霉素、磺胺类药、β-内酰胺类抗菌药物及耐消毒剂等相关基因的菌株。结论海南州鼠疫疫源地分离的87株鼠疫菌不具有耐消毒剂及耐药相关基因的特征。     

青海省鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌的基因型分布

目的研究青海省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)基因型分布特征。方法对分离到的青海省148株鼠疫菌,根据已经证实的22个差异区段设计引物,每株鼠疫菌的每个基因差异区段都采用PCR技术进行验证。结果148株青海省鼠疫菌共包括8个基因型,即1、5、7、8、14型、新基因组型和Ype-ancestor型,其中以5型和8型为主。祁连山南麓和青海湖环湖地区的祁连、门源、刚察、海晏、共和、天峻等的菌株绝大多数属于基因型8型,占40．5％(60／148);位于青南高原的格尔木、玉树、扎多、治多、称多、囊谦和曲麻莱等的菌株,其基因型主要为5型,占31．8％(47／148)。青藏高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因型全部为14型,占8．1％(12／148)。结论在青海省分离的鼠疫菌中,喜马托雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌的基因型以5型和8型为主,青海田鼠疫源地鼠疫菌以基因型14型为主。     

甘肃省鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列基因分型及地区分布

目的 采用多位点可变数目串联重复序列(MLVA)对甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行基因分型,探讨甘肃省鼠疫菌地区分布特征。方法 选取1962-2014年间甘肃省各市县(区)不同生态型的鼠疫菌198株,培养并提取基因组DNA。采用14+12对引物进行PCR扩增,产物进行测序,确定每对引物串联重复序列(VNTR)位点的拷贝数。应用BioNumerics 5.10软件对菌株的VNTR位点拷贝数进行聚类分析。结果 甘肃省鼠疫菌分为10个群,群内的菌株依据分离地点继续细化为5-28个分支。10个群分别为:阿拉善黄鼠疫源地菌株聚为1个群;甘南高原疫源地菌株聚成1个群;阿克塞县菌株分成2个群,为当金山群和加尔乌宗村群;肃北县菌株分为3个群,为马场群、党城湾镇群和鱼儿红群;玉门市菌株聚集在肃北县鱼儿红群内;肃南县菌株分为3个群,为大河乡群、马蹄乡群和康乐乡群。结论 MLVA可以清晰地区分甘肃省不同鼠疫疫源地的菌株,将疫源地内菌株继续细分为不同分支,直至精确的分离地点。MLVA分型方法可用于鼠疫菌株的溯源分析。     

云南省剑川县鼠疫疫源地分离菌株基因组多态性

目的 阐明云南剑川野鼠疫源地鼠疫菌种群的演化及其与云南省其他疫源地菌株之间的遗传进化关系。方法 按不同时间、不同疫点、不同分离源,随机选取24株剑川分离鼠疫菌进行研究;采用差异区段(DFR)、规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)进行基因组多态性分析;以DFR+CRISPRs聚类分析划分簇,再以MLVA26对簇进行聚类分析。结果 24株剑川菌株中,20株菌聚为一个簇(剑川野鼠鼠疫簇);2017年疫情分离3株菌位于丽江野鼠鼠疫簇,与丽江菌株(2017LZ)存在2个位点的差异(N2577,M23);剩余1株为一个独立株;50年代菌株与其邻近的80年代菌株间位点差异未超过3。结论 剑川原野鼠疫源地的发现时间可往前推至上世纪50年代,同时疫情还波及过家鼠和人群;剑川县境内存在2种类型的野鼠疫源地,其鼠疫防控具有复杂性,应继续加强鼠间鼠疫的动态监测。     

基于地理信息系统的青海省鼠疫菌毒力研究

目的测定青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌毒力,建立青海省鼠疫自然疫源地毒力基础数据。方法选取392株鼠疫菌进行毒力试验,用SPSS18．0计算各试验菌株的半数致死量（LD50）,运用地方病地理信息系统分析其空间构成。结果392株鼠疫菌中鼠疫强毒株有367株,占93．62％;鼠疫中等毒力株有10株,占2．55％;鼠疫低毒株有10株,占2．55％;鼠疫弱毒株有5株,占1．27％;发现青海省鼠疫自然疫源地祁连山型菌株毒力比青藏高原型菌株毒力强。结论青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌以鼠疫强毒株为主。     

Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae

Genome rearrangements, especially amplifications and deletions, have regularly been observed as responses to sustained application of the same strong selective pressure in microbial populations growing in continuous culture. We studied eight strains of budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) isolated after 100-500 generations of growth in glucose-limited chemostats. Changes in DNA copy number were assessed at single-gene resolution by using DNA microarray-based comparative genomic hybridization. Six of these evolved strains were aneuploid as the result of gross chromosomal rearrangements. Most of the aneuploid regions were the result of translocations, including three instances of a shared breakpoint on chromosome 14 immediately adjacent to CIT1, which encodes the citrate synthase that performs a key regulated step in the tricarboxylic acid cycle. Three strains had amplifications in a region of chromosome 4 that includes the high-affinity hexose transporters; one of these also had the aforementioned chromosome 14 break. Three strains had extensive overlapping deletions of the right arm of chromosome 15. Further analysis showed that each of these genome rearrangements was bounded by transposon-related sequences at the breakpoints. The observation of repeated, independent, but nevertheless very similar, chromosomal rearrangements in response to persistent selection of growing cells parallels the genome rearrangements that characteristically accompany tumor progression.     

云南鼠疫菌AscI酶切分型及其流行病学意义

目的构建以AscI酶切的云南省鼠疫菌PFGE图谱库并探究其流行病学意义。方法采用限制性内切酶AscI对云南家、野鼠型及玉龙鼠疫菌进行酶切分析,并对电泳图谱进行聚类分析。结果30株被试菌株分为15种PFGE型别（相似性系数为88．9％～100．0％）、5个簇、4个群,除404号菌与EV76归为一群,其余3个群分别为家鼠型基因群、野鼠型基因群及玉龙基因群。结论云南鼠疫菌PFGE基因型与生态型相吻合,具有一定的区域聚集性;玉龙鼠疫菌是云南独立的一个基因群。     

Detecting genetic variability among different Mycobacterium tuberculosis strains using DNA microarrays technology

Recent advances in functional and comparative genomics have improved our understanding of genetic diversity among the Mycobacterium tuberculosis complex. In this study, we investigated the genetic polymorphism of M. tuberculosis using whole-genome microarray analysis. Amplified fragments of 15 M. tuberculosis strains (from two different geographical origins) and the reference strain H37Rv were produced by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) using three different primers. The RAPD products were labeled with fluorescent dyes (Cy3 and Cy5) and hybridized to a TB DNA microarray representing nearly all open reading frames (ORFs) of H37Rv. The final results were analyzed using bioinformatic tools. Some genetic variability was found among the 16 M. tuberculosis strains. The majority of the highly polymorphic DNA sequences were observed in ORFs representing non-essential genes of the bacterium. The future use of comparative genomics based on DNA microarray technology should prove a powerful tool for understanding phenotypic variability among M. tuberculosis isolates of similar genetic composition. It is also a promising approach to provide important insights into evolution, virulence and pathogenesis of M. tuberculosis.     

云南玉龙及古城区鼠疫自然疫源地判定及初步研究

目的确定云南玉龙县及古城区鼠疫自然疫源地的存在,提出防控策略。方法采用常规调查方法,通过血清学、细菌学、基因诊断等技术进行判定。结果共分离到5株鼠疫杆菌,均酵解甘油、麦芽糖、阿胶糖,不酵解鼠李糖、密二糖,脱氮试验阳性。均带有Pgm 、PstI 、FI 、Vwa 等毒力决定因子;疫区犬血清阳性率为23.5%;猫血清阳性率为26.7%。结论细菌学证实玉龙县为鼠疫自然疫源地,目前鼠疫流行处于活跃期;血清学证实古城区为新的鼠疫疫源区(县);阳性血清动物分布面积210km2,并有进一步扩散趋势;齐氏姬鼠及大绒鼠是本地区优势鼠种,玉龙绒鼠有局部分布。特新蚤指明亚种,方叶栉眼蚤为优势蚤种;分离的鼠疫菌与滇西纵谷型及滇闽居民区型菌株生化特性不同,与西藏北部青藏高原型鼠疫菌的生化特性接近。     

滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物感染贝氏柯克斯体的调查

目的调查滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物贝氏柯克斯体感染情况。方法2015年12月至2016年10月,课题组以云南省玉龙县、剑川县和梁河县鼠疫疫源地为采样点,使用夹夜法在不同季节、不同海拔、不同生境捕获野外鼠形动物,收集到2 524份肝脾样本。采用巢氏PCR方法对Q热病原体贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)Com1基因的保守片段进行扩增。应用SPSS20.0软件,采用χ²检验或Fisher确切概率法分析不同疫源地、海拔梯度、生境、季节、性别间Cb在野外鼠形动物中的流行分布情况。结果检测2 524份样本,Cb阳性23份,阳性率为0.91%。检出Cb的鼠形动物包括齐氏姬鼠、中华姬鼠、黄胸鼠、社鼠、锡金小鼠、大绒鼠、臭鼩鼱和毛猬。不同生境、性别间野外鼠形动物Cb阳性率无差异(χ_生境²=6.514,χ_性别²=0.076,P>0.05);季节间Cb阳性率春季(2.44%)高于秋季(0.37%)(χ²=11.550,P<0.008);剑川鼠...