云南鼠疫菌pYC质粒来源的探索

目的检测鼠疫近缘菌中是否存在着与鼠疫菌pYC质粒相同的核苷酸序列。方法设计4对引物,其产物长度覆盖整个的pYC质粒序列,将产物设计为探针,对近40余种鼠疫近缘菌全部的DNA进行斑点杂交。结果除用来作为对照的、分离至云南的4株鼠疫菌斑点杂交呈阳性外,其他杂交结果均为阴性。结论目前发现该质粒只存在于某些鼠疫菌中,进一步证实了我们先前的猜测,说明该质粒不是从这些近缘菌进化而来,可能是从外界获得的。     

鼠疫菌6 kb质粒核酸序列同源性比对分析

目的 分析云南省鼠疫菌6 kb(pYC)质粒核酸序列与GenBank中公开报道的多种细菌序列的同源性.方法 通过美国国立图书馆网站序列比对搜索工具(BLAST),对鼠疫菌pYC质粒全序列和开放式读码框架(ORFs)以及翻译蛋白进行核酸与核酸、蛋白与蛋白比对分析.结果 pYC质粒部分基因与宋内志贺菌质粒pKYM具有97.1%的同源性,与流感嗜血杆菌基因有92.1%的同源性,与伤寒沙门杆菌基因LT2和pIMVS1分别具有88.2%和87.2%的同源性,与大肠埃希菌0157:H7、K-12、ECOR31株局部基因分别具有81.4%、81.4%和84.7%的同源性.pYC质粒ORFs翻译蛋白ORF1与副鸡嗜血菌复制蛋白B具有47.2%的相似性,ORF4与大肠埃希菌推定蛋白具有52.7%的相似性,ORF5与假结核菌TriE蛋白具有48.3%的相似性,ORF6与大肠埃希菌PilxS/VirB5相似蛋白具有42.3%的相似性、与小肠结肠炎耶尔森菌TriD蛋白具有38.5%的相似性,ORFIO与伤寒沙门杆菌LT2细胞质蛋白具有83.1%的相似性.与大肠埃希菌0157:H7推定蛋白具有81.9%的相似性.ORF11与大肠埃希菌K12诱导损伤蛋白J具有81.4%的相似性.结论 pYC质粒DNA序列与肠杆菌科部分基因具有高度同源性,可能编码类似埃希菌属和耶尔森菌属推定蛋白、诱导损伤蛋白、TriD和TriE蛋白、Pilx5/VirB5相似蛋白.     

我国鼠疫菌pYC质粒PCR检测分析

目的分析全国其他类型鼠疫菌是否存在pYC质粒。方法设计yd1和yd2两对引物通过PCR 进行检查。结果共检查全国11块疫源地18个生态型鼠疫菌802份DNA,其中云南6份、广西5份、贵州6 份扩增阳性,云南另外的163份和全国其他菌株扩增结果均为阴性。结论 yd1和yd2基因仅存在于贵州、广西的菌株和云南的部分菌株中,可作为具有pYC质粒鼠疫菌的PCR诊断和标识基因;全国其他类型鼠疫菌无 6×103(pYC)新质粒。     

广西鼠疫耶尔森菌质粒图谱及分子流行病学意义

目的分析广西鼠疫耶尔森菌株质粒DNA种类,从分子水平探讨其流行病学意义。方法采用Kado改良法提取质粒,经琼脂糖凝胶电泳。结果从广西鼠疫自然疫源地分离到31株鼠疫耶尔森菌含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未明确其类型的111.36×106(相对分子质量,Mr)5种质粒。其中有29株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT14种质粒组成,1株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、111.36×106(Mr)4种质粒组成,另一株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD13种质粒组成。结论广西鼠疫耶尔森菌株含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未定型的111.36×106(Mr)5种质粒,与云南省南部、东南部和贵州省鼠疫耶尔森菌株的质粒图谱相同。     

鼠疫菌pYC质粒标识基因在动物及蚤检测中的应用

目的评价云南鼠疫菌pYC质粒标识基因的特异性及在鼠疫监测中的应用。方法应用pYC质粒标识基因引物yd1，yd2并以鼠疫菌特异性基因pla，fra作为对照进行PCR实验，观察实验室感染标本和现场样品的检出情况。结果共检测实验感染动物脏器8份，均为阳性。检测现场收集的黄胸鼠脏器22份，阳性6份，阳性率27.27%。检测感染的蚤类67份，阳性13份，阳性率19.40%，试验引物yd1，yd2与对照引物pla，fraPCR检测结果其特异性和敏感性均一致。结论将yd1，yd2引物，联合pla，fra引物，建立鼠疫PCR快速诊断方法，应用于云南、广西、贵州判断鼠疫菌、监测鼠疫信息，具有重要的实际意义。     

陕西省两起鼠间鼠疫流行鼠疫菌生物学特性比较

目的通过对两起鼠间鼠疫流行鼠疫菌生物学特性进行比较,了解陕西省动物间鼠疫流行的病原特点。方法对2000～2001年、2006年动物鼠疫流行期间所分离菌株的生化、毒力、毒力因子及质粒进行比较分析。结果被鉴定菌株发酵阿胶糖,分解甘油,不发酵鼠李糖、麦芽糖,脱氮阴性。所有测试菌株含有F1和Pst1因子,2000～2001年19株鼠疫菌除1株Pgm±外,均含有4种毒力因子,2006年5株测试鼠疫菌均不含VW因子,2株不含Pgm因子。2000～2001年5株测试菌LD50在41～180个菌之间,2006年5株测试菌LD50在100～12.5亿个菌之间;2000～2001年未进行质粒检出工作,2006年鼠疫菌检出6、45、65 MD 3种质粒。结论所有鉴定菌株生化特点符合鄂尔多斯高原沙鼠鼠疫菌生化特性,引起两起鼠间鼠疫的鼠疫菌毒力因子及毒力不完全相同,2000～2001年鼠疫菌为强毒鼠疫菌,2006年鼠疫菌毒力有强弱之分,5株测试菌3株强毒菌,2株弱毒菌。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coliBL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

青藏铁路沿线鼠疫菌质粒的研究

目的 检测青藏铁路沿线鼠疫菌携带的质粒种类及相对分子质量.方法 采用碱裂解,酚一氯仿抽提法提取鼠疫菌质粒,经琼脂糖凝胶电泳进行检测并分析质粒的相对分子质量.结果 所检测的18株鼠疫菌具有6×106,45×106,52×106,65×106,92×106质粒,其中大质粒的变化范围在52×106～92×106.结论 青藏铁路沿线鼠疫菌除具有规范的质粒图谱外,鼠疫菌最大质粒的变化有一定的规律性,具有分类属性,对研究鼠疫自然疫源地空间结构和鼠疫菌的遗传学特性具有重要意义.     

四川省德格县2株疑似喜马拉雅旱獭鼠疫菌株的鉴定

目的 通过对四川省德格县自毙喜马拉雅旱獭体内分离出的2株疑似鼠疫菌株进行生化特征、毒力鉴定,确定四川省是否存在旱獭鼠疫自然疫源地.方法 菌株鉴定采用细菌形态染色、培养特性、鼠疫噬菌体裂解试验、生化及糖醇类酵解试验、毒力因子、毒力、营养需求、质粒、基因检测及基因分型方法进行.结果 光镜下,2株被检菌株均为革兰染色阴性,呈球杆状,两极浓染、两端钝圆;在赫氏普通琼脂上24-48 h,被检菌株形态呈中心发暗,有黄褐色粗糙颗粒,边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边;在赫氏血琼脂上,菌落隆起,色泽深,花边消失或残留锯齿状痕迹.2株被检菌株均能酵解阿胶糖、麦芽糖、甘油,不酵解鼠李糖、密二糖,脱氮阳性;毒力因子均为F1+、VW+、Pgm+,Pst I+;携带鼠疫菌常见的质粒,相对分子质量(Mr)为6.0×106、45.0×106、65.0×106,具有鼠疫菌的毒力相关质粒基因Pla、calfl、LcrG;对小鼠的毒力试验,绝对致死量(LD100)均为50个菌;营养需求上,对苯丙氨酸、甲硫氨酸依赖;基因型是Genomovar 5;与假结核菌(PTB)在鉴别培养基尿素、奥腾、枸橼酸盐上有明显区别,含鼠疫菌特有的Pst I和F1抗原,22℃下能被鼠疫噬菌体完全裂解.含有鼠疫菌特有的3a片段.结论 四川省德格县喜马拉雅早獭体内分离的2株疑似菌株均为鼠疫耶尔森菌,具有青藏高原喜马拉雅旱獭型鼠疫菌株的特性,四川省存在喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地.     

不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。     

鼠疫菌质粒变异菌株外膜蛋白谱的比较

目的　研究鼠疫菌外膜蛋白与其所携带的质粒之间是否存在相关性。方法　用终浓度为 10mg/ml的氯霉素2 8℃下杀死鼠疫菌后 ,采用Trion - 2 0 0改进法进行外膜蛋白的提取。以 4 %积层胶、12 %分离胶行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 (SDS -PAGE)电泳。根据低分子量标准蛋白和被试菌株的泳距作相关分析 ,得出各 6条蛋白带的相对分子量。结果　缺失 6MD质粒且PstI的菌株 ,在 32kD和 39k这两条外膜蛋白带处含量较少 ,其它质粒变异株未发现特殊。结论　 6MD质粒缺失且PstI的鼠疫菌株外膜蛋白谱与标准 14 1株相比有明显不同。     

鼠疫耶尔森杆菌蛋白YPO1996的融合表达与鉴定

目的在比较蛋白质组结果的基础上选择并构建pET32a-ypo1996,表达鼠疫耶尔森杆菌（Yersinia pestis）特异的假想蛋白YPO1996重组蛋白（rYPO1996）,为新鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供备选抗原。方法根据鼠疫菌CO92株全基因组序列设计引物,用PCR方法扩增目的基因YPO1996,将其定向插入表达载体pET32a（＋）上,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,使重组质粒在工程菌中稳定高效地表达带组氨酸标签的融合蛋白,并亲和纯化该目的蛋白。通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析,并用Western blot分析其抗原性。结果单、双酶切鉴定及DNA测序显示,目的基因YPO1996成功连接到表达载体pET32a（＋）上,SDS-PAGE显示表达产物分子质量单位约为53.11 ku,与预期值相符。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗免疫鼠疫菌EV株血清识别。结论成功构建了pET32a-ypo1996重组基因原核表达系统,表达的重组蛋白rYPO1996具有较好的可溶性及抗原性,可作为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

我国鼠疫菌大质粒的特性及其流行病学意义

用琼脂糖凝胶电泳的方法检测分离自我国各疫源地，１７个生态型的２００６株鼠疫菌的大质粒。结果表明，我国鼠疫菌含具有分类属性的大质粒共三类（５２，６５，９２Ｍｄ）。６５Ｍｄ质粒在各疫源地均有分布，５２、９２Ｍｄ质粒仅存在于青藏高原喜马拉雅旱獭疫源地。含５２Ｍｄ质粒的菌株分布在祁连山南、北麓及青海湖的环湖地区，带９２Ｍｄ质粒的菌株则分布在西藏那曲周围的唐古拉地区及青海的玉树、曲麻莱等地。鉴于这两类质粒有其独特的分布区，可将大质粒分子量的差异作为青藏高原喜马拉雅旱獭疫源地内区分鼠疫菌生物亚型的指标之一。     

广西鼠疫菌生物学性状的研究

目的 研究广西鼠疫菌生化特性，确定该地区鼠疫疫源地的性质。方法 包括糖醇酵解试验、毒力因子检测、脱氮反应、营养需求等，采用Kado温和法提取质粒。结果 广西鼠疫菌对麦芽糖、阿胶糖酵解，而对鼠李糖、甘油不酵解。毒力因子(pgm)6株阳性，5株弱阳性、4株阴性。31株鼠疫菌经质粒图谱分析，其中2株菌缺失65MD，1株菌携带111MD大质粒，其余均含有4,6、45和65MD质粒。结论 按中国鼠疫菌生态分型标准，被试菌株属滇西闽居民区型。     

云南省南部及东南部鼠疫菌质粒图谱分析及其流行病学意义

用0.7％琼脂糖凝胶电泳检查了自1996年以来云南南部及东南部所分离的41株鼠疫菌质粒DNA,结果表明来自石屏、文山、砚山、建水、个旧、禄春、开远7个县(市)的菌株质粒图谱同来自澜沧江下游的澜沧、临沧、勐海、景洪及元江流域的思茅地区的菌株一样,其中石屏分离4株缺失6Mdal质粒带型,但出现—分子量约12Mdal的清晰带型,用Pla基因作为引物,做PCR分析结果为阳性,推测可能为6Mdal质粒的二聚体。结合流行病学分析认为滇南、滇东南部分地区可能同属一片鼠疫自然疫源地。     

鼠疫菌对抗生素的敏感性综合评价

目的 建立鼠疫菌对抗生素敏感性综合评价方法,并用该方法就鼠疫菌对6种抗生素的敏感性进行综合评价。方法 通过查阅文献,收集鼠疫菌对抗生素敏感性实验数据,以抗生素对强毒141菌株、弱毒EV76paris菌株和云南分离菌株的抑菌情况,即抑菌环直径作为评价指标,用层次分析法综合评价鼠疫菌对所选6种抗生素（头孢他啶、氨苄青霉素、头孢唑啉、环丙沙星、诺佛沙星、链霉素）的敏感性。结果 鼠疫菌对不同抗生素的敏感性存在差异,鼠疫菌对所选6种抗生素的敏感性由高到低依次为头孢他啶、氨苄青霉素、头孢唑啉、环丙沙星、诺佛沙星、链霉素,综合评分指数分别为1.730 77、1.631 77、1.581 95、1.567 80、1.449 48、0.999 99。结论 运用层次分析法评价鼠疫菌对不同抗生素的敏感性可以取得合理、客观和较为准确的评价结果,可以利用该方法及其评价结果为进一步筛选适宜的鼠疫治疗药物提供参考依据。