鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的：用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells，DC)诱导自身淋巴细胞，使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)特异性细胞毒性T细胞(cvtotoxic T lymphocyte，CTL)，观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用。方法：用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞，使其分化为高纯度DC。用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC，流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征，MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力。在白细胞介素-2(IL-2)的作用下，用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL，通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应。结果：人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC。负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响，仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力，所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用。结论：负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用，对NPC的临床治疗有潜在的应用价值。     

负载自体肿瘤抗原的成熟DC体外联合小剂量IL-2及IL-12增强CTL抗胃癌活性研究

目的 探讨在体外条件下负载自体胃癌细胞裂解物的成熟DC(matured dendritic cells loaded with autologous tumor lysates,TL-mDC)联合小剂量白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)及白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)增...     

自体胃癌组织总RNA转染DC诱导的CTL对转染肿瘤组织和正常组织总RNA的DC致伤作用

目的 证实并比较胃癌自体肿瘤组织总RNA转染树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocytes,CTL)对肿瘤组织和正常组织总RNA转染DC的致伤作用.方法 用脂质体转染的方法将3例胃癌患者肿瘤组织总RNA和正常组织总RNA转染到其自体单个核细胞源性DC中,以肿瘤组织总RNA转染DC(DC/Tumor RNA)致敏T淋巴细胞得到CTL,以calcein-AM细胞毒试验和酶联免疫斑点法测定干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)分泌来检测CTL对肿瘤组织和正常组织总RNA转染DC的溶细胞效果.结果 CTL对DC/Tumor RNA杀伤率与对转染正常组织总RNA的DC(DC/Normal RNA)杀伤率比较差异有统计学意义(P<0.05).DC/Tumor RNA组CTL分泌IFN-γ较DC/Normal RNA组高出近2倍(P<0.05).结论 转染肿瘤组织总RNA的DC提高了抗肿瘤CTL的细胞毒作用,同时也诱导CTL对正常组织的致伤作用,以期降低DC为基础的肿瘤免疫治疗对正常组织的致伤作用提供理论依据.     

肺癌可溶性抗原致敏的DC诱导CTL特异性杀伤肺癌细胞的实验研究

目的 通过对负载人肺癌GLC-82细胞可溶性抗原的树突状细胞（DC）体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）对肺癌细胞的杀伤研究，为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供一定的实验依据。方法 通过用3MKCl提取法和弱酸洗脱法获得人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽，用GLC-82细胞抗原多肽冲击致敏从人外周血单核细胞（PBMC）中用GM-CSF、IL-4和TNF—α体外诱导扩增并经鉴定的DC；利用负载GLC～82细胞抗原多肽的DC，刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖，诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL；进一步探讨该CTL对GLC-82，肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的体外杀伤效应。结果 人PBMC体外经7d诱导出的DC，经光镜、电镜、免疫组化证实具有典型的树突状细胞特性；经GLC-82抗原致敏的DC诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL，诱导激活的CTL与靶细胞共育时镜下发现CTL靠近并聚集在肿瘤细胞周围，致使肿瘤细胞发生凋亡和坏死。结论肺癌可溶性蛋白抗原能活化致敏DC，无需明确肿瘤特异抗原，获取方法简便可行；联合应用GM—CSF、IL-4和TNF—α诱导人PBMC中的单核细胞，能诱导出功能较强的DC；致敏DC能强烈刺激初始型同种异体T淋巴细胞增殖产生CD8^＋表达增加的CTL;激活的CTL对肺癌靶细胞发挥高效而特异的细胞毒效应，对非肺组织瘤靶细胞也具有非特异性杀伤效应。     

负载食管癌抗原肽树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞的杀伤效应

目的:研究负载食管癌抗原肽树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人食管癌细胞株 TE 1的杀伤效应。方法:用弱酸洗涤TE 1细胞获得抗原肽,将此负载到树突状细胞并与淋巴细胞混合培养,制备 CTL,用Cr51释放法测定其对TE 1细胞的杀伤活性。结果:负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对TE 1细胞的杀伤 率为(78.62±3.51)%,未负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对TE 1的杀伤率为(10.52±5.51)%,二者差异有统 计学意义(P<0.05);负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对酸洗前TE 1杀伤率为(60.63±7.24)%,对酸洗后 TE 1的杀伤率为(8.64±4.12)%,两者差异有统计学意义(P<0.05);负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对 Eca 109的杀伤率为(56.21±8.76)%,而对K59和786 0的杀伤率分别为(15.89±11.80)%和(3.95±2.99)%。 结论:酸洗可以从TE 1细胞上获得有效的抗原肽;负载食管癌抗原肽的DC可以诱导生成高效特异的CTL。     

肿瘤exosome诱导的细胞毒性T细胞的特异性杀伤作用

目的:检测癌细胞来源的外排小体exosome在体外刺激细胞毒性T细胞(CTL)特异性杀伤癌细胞的能力。方法:从外周静脉血中分离和培养树突细胞(DC),分离纯化舌鳞癌Tca-8113细胞培养上清液中的exosome,并将exosome负载至DC上,诱导T淋巴细胞活化为细胞毒性T细胞(CTL),把CTL加入到靶细胞(Tca-8113和95-D)培养体系中,18h后利用MTT比色法测定CTL对靶细胞的杀伤活性。结果:从外周静脉血中分离的单核细胞,经粒细胞-单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的培养可分化为DC,经exosome冲击后,诱导的CTL对Tca-8113细胞具有显著的杀伤作用,在效靶比为20:1时,18h平均杀伤率为(43.60±5.66)%(P<0.01),但对95-D细胞无明显杀伤作用,杀伤率为(29.7±8.78)%(P>0.05)。结论:肿瘤细胞分泌的exosome,负载到DC上后,可以活化T细胞,使之成为抗原特异性的CTL,并具有特异性的杀伤肿瘤细胞的功能。     

寡脱氧核糖核苷酸致敏树突状细胞对OVCAR-3卵巢癌细胞株杀伤作用的实验研究

目的探讨含有未甲基化“胞嘧啶-磷酸二酯键-鸟嘌呤（CpG）基序”的寡脱氧核糖核苷酸（CpGODN）致敏人外周血来源树突状细胞（DC）在卵巢癌免疫治疗中的作用。方法应用CpGODN2006联合肿瘤相关抗原CA125体外冲击致敏DCs,流式细胞技术检测DC膜表面CD1α、CD8、CD86和人白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达,用EHSA测定DC培养上清液中白细胞介素（IL）-12的分泌水平;四唑盐（MTT）比色试验法检测活化DCs对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤OVCAR-3卵巢癌细胞株作用的影响。结果CpG ODN2006联合CA125在体外可明显激活人外周血来源DCs,DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR表达的阳性细胞百分率[（85±4）％、（87±12）％和（92±7）％]明显高于未致敏组[（19±4）％、（67±9）％和（63±6）％]（P＜0．01）;联合致敏后DCs培养上清液中白细胞介素（IL）-12分泌水平为（467±84）ng／L,与未致敏组[（60±9）ng／L]和单纯CA125致敏组[（97±16）ng／L]相比差异有统计学意义（P＜0．01）;联合刺激后的DCs可以促进T淋巴细胞的增殖,增殖活性显著高于未致敏组和单纯CA125致敏组（P＜0．01）,且相同效靶比下所诱导的CTLs对OVCAR-3卵巢癌细胞的杀伤活性显著强于未致敏组、单纯CA125致敏组和单纯CpGODN致敏组（P＜0．01）。结论CpGODN联合CA125体外致敏DC可诱导产生对OVCAR-3卵巢癌细胞的免疫杀伤作用,是一种临床应用前景良好的肿瘤免疫治疗方法。     

抗原致敏树突细胞激活细胞毒性T淋巴细胞的体外抗肿瘤作用

目的 利用新型诱导剂钙离子载体(CI)A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导人外周血单核细胞(PBMC)生成树突细胞(DC),观察DC刺激细胞毒性T细胞(CTL)对人白血病细胞K562细胞产生的特异性杀伤作用.方法 采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,分2组培养:传统方法组,加人rhGM-CSF+重组人白细胞介素4+重组人肿瘤坏死因子-α;新型诱导剂组,加入rhGM-CSF+CI A23187.培养开始前,予K562细胞冻融抗原致敏,培养96 h后收集负载抗原的DC.光镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测DC细胞的表面标志;四甲基偶氮唑盐比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力、DC对K562细胞的抑制作用和DC激活的CTL细胞对K562细胞的杀伤作用.结果 与传统方法相比,A23187联合rhGM-CSF 诱导培养的DC具有更加典型的树突形态;DC 表面分子CD83、CD1a、CD86、CD40表达(45.2%±1.8%、31.5%±3.9%、40.1%±7.8%、36.4%±6.3%)较传统方法组(16.9%±1.3%、20.4%±3.4%、26.5%±2.2%、22.3%±3.0%)明显高(均P<0.05),且CD14表达(5.7%±0.8%比19.0%±1.6%)明显低(P<0.05);负载K562细胞冻融抗原后的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖作用;对K562细胞有明显抑制作用,效靶比为1:1及10:1时,抑瘤率分别为(25.3±3.8)%比(15.6±2.4)%、(35.6±5.2)%比(22.9±3.2)%(均P<0.05);刺激的CTL对K562细胞有明显的杀伤作用,效靶比为10:1及40:1时,杀瘤率分别为(44.3±6.2)%比(29.9±2.8)%、(61.0±5.2)%比(43.1±4.8)%(均P<0.05).结论 新型诱导剂CI A23187联合rhGM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟DC,K562细胞冻融抗原冲击该DC激活CTL能够获得较强的杀伤K562细胞的能力.     

肿瘤抗原冲击DC诱导淋巴细胞对小鼠胃肠癌的杀伤作用

目的：用胃肠癌冻融抗原冲击树突状细胞（DC）诱导荷瘤小鼠脾细胞，观察DC及细胞毒T细胞（CTL）的生物学功能及对胃肠癌靶细胞体外杀伤作用。方法：小鼠骨髓细胞经GM-CSF、IL-4诱导和胃肠癌细胞系 KATO3、CT26细胞冻融抗原（Ag）的冲击，诱生致敏的DC与活化脾淋巴细胞共培养，获得的CTL对相应靶细胞及对照黑色素瘤细胞进行体外杀伤。结果：制备的DC与CTL具有良好的生物学活性，胃肠癌 Ag冲击的DC诱导的CTL对相应靶细胞的杀伤率分别平均75.98%和86.75%，且效靶比显示量效关系；对无关靶细胞A375为10.57%和11.53%。结论：胃肠癌Ag冲击致敏的DC能诱导CTL产生特异性杀伤作用。     

bcr-abl基因免疫诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能

目的：研究bcr-abl融合基因免疫在慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia CML)中的作用以及探讨CML基因免疫治疗的可行性。方法：设计两条引物扩增bcr-abl融合位点两侧约490bp大小的cDNA,经测序鉴定正确后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过电穿孔法转染至p815细胞,应用G418筛选建立稳定的靶细胞,同时将重组真核表达载体肌肉免疫BALB／c小鼠以获取特异的效应细胞,乳酸脱氢酶（LDH）法检测特异性杀伤率。结果：（1）PCR扩增出可用于基因免疫的位于Bcr-alb融合基因位点两侧的490bp大小的cDNA,序列测定除第452位碱基C突变为T外其余序列均正确;（2）构建了重组真核高效表达载体,命名为pcDNA/bcr-abl;(3)G418梯度筛选建立了稳定表达该融合基因的细胞系,逆转录－聚合酶链反应;（4）bcr-abl基因免疫后的小鼠能有效诱导出特异性细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphcyte,CTL),结论：位于融合位点两侧的bcr-abl基因肌肉免疫小鼠能够诱导特异性CTL,杀伤bcl-abl融合基因转染的靶细胞。     

超抗原和肿瘤抗原修饰树突状细胞的杀瘤效应

目的:测定经超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B (SEB)和结肠癌肿瘤抗原联合修饰树突状细胞(DC)的活性.方法:结肠癌手术标本体外培养出结肠癌细胞并鉴定之,冻融法制备肿瘤抗原;同一患者外周血分离出单个核细胞,以细胞因子诱导为DC;尼龙棉柱过滤获取T淋巴细胞;肿瘤抗原和不同质量浓度的SEB联合修饰DC;以联合抗原修饰后的DC为刺激细胞,自体T淋巴细胞为效应细胞,相同时间下以不同比例共同孵育后,采用MTT法检测对结肠癌细胞的体外杀伤效果.结果:诱导出表达CD11c,CD80,HLA-DR分子的DC,经结肠癌肿瘤抗原和SEB联合修饰后,上述分子表达上调.联合抗原修饰DC的T细胞活化作用强于单独使用结肠癌肿瘤抗原修饰DC的T细胞活化作用.100 μg/L SEB 和肿瘤抗原联合修饰的DC以1GA6FA100比例与T淋巴细胞共孵后的杀伤肿瘤细胞效应最强.结论:SEB和肿瘤抗原联合修饰DC的活性明显强于单用肿瘤抗原修饰DC的活性.     

大肠癌肿瘤抗原修饰的树突状细胞活性检测

目的:测定经大肠癌肿瘤抗原修饰的树突状细胞(DC)的活性. 方法:分离结肠癌患者的外周血单个核细胞,应用粒细胞/ 巨噬细胞集落刺激因子联合白细胞介素-4进行体外诱导,获取DC,以流式细胞仪进行表型鉴定;用Lovo细胞制备大肠癌肿瘤抗原并用以修饰DC,以肿瘤抗原修饰后的DC为刺激细胞,以自体淋巴细胞为效应细胞,采用MTT法检测刺激细胞与效应细胞在不同比例(1:10,1:100,1:1 000)以及不同共孵时间(24 h,48 h,72 h)下,效应细胞对大肠癌细胞的排斥杀伤率.结果:从大肠癌患者外周血单个核细胞中成功诱导出表达CD11c、CD80和HLA-DR的DC,经肿瘤抗原修饰后,上述分子表达上调.肿瘤抗原修饰后的DC与淋巴细胞以1:100共孵48 h时,淋巴细胞的肿瘤细胞排斥杀伤率较高.结论:从大肠癌患者外周血中分离诱导出的DC,被肿瘤抗原修饰后,在体外可激活自体淋巴细胞,提高淋巴细胞的杀瘤活性.     

胶质瘤RNA致敏的人脐血树突状细胞诱导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的:制备人脐血来源的树突状细胞(DCs),用胶质瘤RNA诱导其成熟,并观察DCs诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性.方法:以rhGM-CSF、IL-4诱导人脐血单个核细胞向DCs分化并鉴定.提取胶质瘤RNA与DCs混合,使DCs致敏,未致敏的DCs为对照组.观察细胞形态并检测致敏前后DCs的表型.将DCs与外周血T细胞共培养,以胶质瘤细胞为靶细胞,采用MTT比色法检测T细胞抗肿瘤活性差异.结果:人脐血单个核细胞于诱导第5 d呈现典型的DCs形态;经rhGM-CSF、IL-4诱导培养后,CD86、CD11c、CD54、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子表达与培养前比较均明显增高(P＜0.01).负载抗原后,MHC-Ⅰ和CD54表达与负载抗原前相比进一步增高(P＜0.05).以DCs诱导活化的T细胞与胶质瘤细胞共培养可使胶质瘤细胞的生长受到抑制,并最终导致其死亡;杀伤率与未负载抗原的对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论:人脐血单个核细胞在细胞因子的诱导下扩增并分化为DCs.经抗原致敏后,能增强淋巴细胞对相应肿瘤细胞的体外杀伤效应.     

脐血树突状细胞经卵巢癌细胞刺激后抗卵巢癌免疫应答的体外研究

目的研究脐血来源的树突状细胞(DC)的体外扩增培养方法及诱导特异性抗卵巢癌细胞免疫效应.方法①从脐血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(Mo).以粒细胞-巨噬细胞集落剂(GM-CSF)、IL-4、集落刺激因子(SCF)和酪氨酸激酶受体Ⅲ配体(Flt-3L)诱导分化扩增,共培养7d后用流式细胞仪进行表型分析;②诱导单核细胞分化的第3天加入人卵巢癌细胞株SKOV3的冻融抗原,共培养4d后获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏的DC与从脐血中分离的同种同体T淋巴细胞共培养6d,获得效应细胞;MTT法检测效应细胞对人卵巢癌细胞株SKOV3、人肝癌细胞株Hu-7的细胞毒作用;结果①脐血来源的Mo在细胞因子的作用下,7d后分化生成成熟的DC,高表达特异性抗原CD83、CD86、CD80、CD1a;②DC可负载并提呈肿瘤抗原,诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生,不同浓度的CTL对卵巢癌细胞株SKOV3均有特异性杀伤、抑制作用(P＜0.05).结论脐血中DC的前体细胞(即单核细胞)可在体外分化扩增为成熟的功能性DC,并可诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应,是一种临床应用前景良好的、方便有效的肿瘤免疫治疗方法.     

经皮下注射树突状细胞治疗膀胱肿瘤的病理改变

目的观察肿瘤细胞冻融上清致敏的树突状细胞(DC)治疗膀胱肿瘤(BT)的疗效。方法选取F344大鼠44只,称重后随机分为4组,均采用膀胱灌注N-甲基亚硝基脲(MNU)制成BT;第11周4组分别经皮下注射PBS、未致敏DC、肿瘤抗原及致敏DC,每周1次,共4次;实验第15周,经电子秤、显微镜检测。结果致敏DC组大鼠体重高于其余3组,并与PBS组及未致敏DC组差异明显(P<0.05);致敏DC组膀胱重量低于其余3组且有显著性差异(P<0.05),其余各组间差异无显著性;致敏DC组病理分期明显低于PBS组和未致敏DC组(P<0.05),其余组间差别无统计学意义;致敏DC组病理分级明显低于PBS组(P<0.05),其余组间差别无统计学意义。结论应用致敏DC经皮下注射治疗大鼠膀胱肿瘤可降低肿瘤的病理分期及分级。     

淋巴细胞趋化因子基因修饰增强肿瘤抗原多肽致敏的树突状细胞的 …

目的 通过选择性增强树突状细胞（ＤＣ）与Ｔ细胞的体内相互作用。优化其体内抗原提呈的微环境,为进一步增强ＤＣ介导的肿瘤免疫治疗效果。方法 体外培养的小鼠骨髓树突太细胞体外经Ｌｔｎ重组腺病毒感染后（Ｌｔｎ－ＤＣ）,用３ＬＬＬｅｉｗｓ肺癌细胞株的Ｍｕｔｌ抗原肽冲击致敏,按不同剂量免疫正常同系小鼠体内,观察其体内诱导的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性保护性免疫反应。通过体内阻断试验探讨免疫细胞亚群及免疫分     

负载胃癌酸洗抗原树突状细胞诱导高效特异的抗胃癌细胞效应

目的　研究负载胃癌酸洗抗原树突状细胞 (DC)诱导的特异性CTL对胃癌细胞的杀伤效应。方法　酸洗涤法获得SGC790 1细胞膜抗原多肽 ,GM CSF、IL 4和TNF a体外诱导扩增DC并负载酸洗抗原 ,制备胃癌抗原特异性CTL ;用CytoTox 96TM检测其对SGC790 1体外杀伤效应。结果　负载胃癌抗原肽的DC诱导的特异性CTL对SGC790 1的杀伤率达 88 95 % ,显著高于LAK细胞的杀伤率 (P <0 0 5 )。且其对同种不同分化类型的胃癌细胞株MGC80 3、MNK2 8也有较高的杀伤效应 ,而对LOVO及HepG2肿瘤细胞株无显著杀伤作用 (P >0 0 5 )。结论　负载胃癌抗原的DC体外可诱导出高效而特异的抗胃癌效应 ,提示以DC为中心的肿瘤生物治疗可望提高胃癌综合治疗水平。     

肿瘤抗原MUC4 HLA-A*0201限制性CTL表位的体外免疫效应研究

目的:探讨肿瘤抗原MUC4 HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽负载树突状细胞诱导CTL的体外免疫效应.方法:从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC).用之前表位预测法预测并合成的五种肽分子分别脉冲成熟的DC,并刺激HLA-A*0201 健康人自体CD8 T细胞成为CTL.用酶联免疫斑点法(ELISPOT),检测CTLIFN-γ的分泌.同时用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其对靶细胞的杀伤作用.结果:人PBMC可在多种细胞因子的作用下被诱导称为DC.肽P01204诱导的CTL,在不同的效靶比可特异性杀伤P01204脉冲的T2细胞[5∶1时为(9.03±0.24)%,10∶1时为(19.62±0.44)%,20∶1时为(27.93±2.22)%]和MUC4 、HLA-A2 的HCT-116细胞[5∶1时为(7.26±0.18)%,10∶1时为(16.83±0.40)%,20∶1时为(25.23±1.35)%],均高于阴性对照组(P＜0.05),能够产生IFN-γ的细胞数(130.33±6.58)明显高于阴性对照组(P＜0.05).结论:肿瘤相关抗原MUC4的HLA-A*0201限制性CTL表位P01204,能诱导入外周血单核细胞的CTL反应,该活化的CTL能分泌免疫活性物质诱导特异性靶细胞的凋亡.