葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylcerarnide synthase,GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV_(200)的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法 采用RT-PCR分析KBV_(200)及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异,运用MTT法分析KBV_(200)经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化,应用RT-PCR技术检测KBV_(200)细胞耐药逆转后GCS及mdrl基因的表达。结果 KBV_(200)细胞GCS和mdrl基因的表达明显强于KB细胞,而KB细胞mdrl基因表达为阴性。5～25μmol/L DL-PPMP均可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,25 μmol/L时抑制强度最大;10 μmol/L异搏定即可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,15 μmol/L时抑制作用明显。DL-PPMP和异搏定均可抑制mdrl基因的表达,KBV_(200)经25μmol/L DL-PPMP作用48h后细胞内mdrl表达为阴性。结论 异搏定和DL-PPMP对GCS和marl基因表达的抑制调节呈浓度依赖性,它们可通过抑制GCS和mdrl基因表达,逆转KBV_(200)对长春新碱的耐药。KBV_(200)GCS基因的表达与MDR存在正相关,GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用。     

TRAIL抑制胃癌多药耐药基因MDR1/P-gp的表达

目的观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR多药耐药基因MDR1及其编码P-gp蛋白表达的影响,探讨以TRAIL为靶点逆转胃癌多药耐药的机制。方法 SGC-7901/VCR细胞株经不同浓度的TRAIL处理48 h后,RT-PCR检测各组胃癌细胞株中多药耐药MDR1 mRNA的表达情况,同时用ELISA法检测各组胃癌细胞株中P-gp表达的含量。结果不同浓度TRAIL(50、100、200、400μg/L)作用于细胞后,胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR的MDR1/P-gp表达受不同程度抑制,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。400μg/L与200μg/L组相比其MDR1/P-gp抑制程度并不明显,其余各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TRAIL可抑制SGC-7901/VCR MDR1/P-gp的表达,且呈量效关系。TRAIL可能通过降低耐药基因MDR1的表达逆转胃癌的多药耐药。     

五味子乙素对转染多药耐药1基因的MCF-7细胞的多药耐药逆转作用

目的 探讨五味子乙素(SchB)对转染多药耐药1基因(MDR1)的人乳腺癌细胞MCF-7的多药耐药逆转作用及相关机制。方法 将人MDR1基因导入MCF-7细胞,形成耐药细胞株MCF-7／MDR1;用该细胞株为模型评价SchB的体外逆转多药耐药作用,用MTT法进行化疗药物单独或与SchB联合作用时对耐药细胞的IC50比较,计算逆转倍数。结果 转染细胞MCF-7／MDR表现为P糖蛋白高表达,对阿霉素、长春新碱、紫杉醇、高三尖杉酯的抗药性均增加;SchB(25μmol／L)显著减少阿霉素、长春新碱、紫杉醇和高三尖杉酯对MCF-7／MDR细胞的IC50,逆转倍数达6．03-23．94倍;SchB(25μmol／L)使MCF-7／MDR细胞对若丹明123的胞内积聚增加约5倍。效果与维拉帕米10μmol／L浓度时相当;但SchB(25μmol／L)不影响MCF-7／MDR细胞的P-糖蛋白表达。结论 SchB能有效逆转转染MDR1的MCF-7细胞的多药耐药,其机制可能是抑制了P-糖蛋白的药物外排生物学活性。     

KBV2000细胞多药耐药蛋白激酶C亚型表达的关系

目的 探讨蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC）亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的关系。方法 （1）用Western blotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布；（2）流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果 （1）PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高，而PKCβ、ε无显著变化，PKCγ、ζ则未测出表达；（2）流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高，PKCβ、ε则无显著差别。结论 PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中，PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

葡萄糖神经酰胺合成酶在人白血病细胞中的表达及其与多药耐药的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase。GCS）基因在人白血病细胞的表达及其与肿瘤多药耐药的关系。方法采用RT-PCR方法分析耐药／非耐药白血病患者GCS基因和多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因（mdr1）的表达水平及其两者的差异。结果白血病耐药组GCS基因扩增条带光密度相对比值明显高于非耐药组（P〈0．05）；白血病患者标本GCS基因扩增条带显著增强时往往伴有mdr1基因的表达，两者呈正相关（P〈0．01、7=0．6）。结论白血病多药耐药患者GCS基因的表达明显强于非耐药患者，GCS基因的表达与mdr1基因相关。提示GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要作用。     

KBV200细胞多药耐药与蛋白激酶C亚型表达的关系

目的探讨蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药(multidrugresistance,MDR)的关系。方法(1)用Westernblotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布;(2)流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果(1)PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高,而PKCβ、ε无显著变化,PKCγ、ζ则未测出表达;(2)流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高,PKCβ、ε则无显著差别。结论PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中,PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

蛋白激酶C活性、亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药性的相关研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)活性、亚细胞分布与KBV200细胞株多药耐药(MDR)的关系。方法MTT法检测KB和KBV200细胞对细胞毒药物的耐药性,32P掺入法检测两株细胞的PKC活性。结果长春新碱(VCR)、阿霉素(ADR)对KBV200细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别是KB细胞的65.03和19.8倍;KBV200细胞的膜组分、胞质组分的PKC活性均高于KB细胞(P<0.01),KBV200细胞PKC总活性是KB细胞的2.12倍;佛波酯可升高KBV200细胞总或膜组分PKC活性,VCR、ADR的IC50值升高(P<0.01);十字孢碱可降低KBV200细胞两种组分PKC活性,VCR、ADR的IC50值降低(P<0.01),对VCR、ADR的逆转倍数分别是5.46和1.96倍。结论PKC与KBV200细胞株的MDR表型关系密切,PKC可能介导了KBV200细胞的MDR。     

靶向葡萄糖神经酰胺合成酶逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的:探讨靶向葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)对乳腺癌多药耐药的逆转作用及机制。方法:GCS反义寡核苷酸(GCSASODN)转染人耐药乳腺癌细胞MCF-7/AdrR,RT-PCR检测细胞GCS和多药耐药基因1(MDR1)mRNA的表达,免疫细胞化学染色检测细胞GCS蛋白和P-糖蛋白(P-gp)的表达,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。Caspase-3活性测定法检测Caspase-3活性改变。结果:GCSASODN转染人耐药乳腺癌细胞MCF-7/AdrR后,GCS和MDR1mRNA的表达水平分别为0.3、0.7,GCS蛋白和P-gp表达阳性率分别为23%、33%,GCS和MDR1的mRNA和蛋白水平较对照组有显著性差异(P<0.05)。转染后细胞周期改变不明显,但细胞凋亡增加为13.7±4.1,Caspase-3活性升高为0.0725±0.0003,与对照组差异有显著性(P<0.01)。结论:靶向GCS通过直接抑制GCS活性,并间接下调MDR1mRNA和蛋白表达,激活Caspase-3活性,诱导耐药细胞凋亡增加,有效逆转乳腺癌多药耐药。     

肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究

目的:探索应用肿瘤细胞特异启动子hTERT介导靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA在卵巢肿瘤细胞特异表达并逆转MDR的可行性。方法:应用携带luc报告基因的报告质粒验证了hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中的转录活性,构建由hTERT启动子引导的靶向mdr1基因的siRNA表达载体phTERTsiMDR1B,并与携带mdr1基因靶序列的报告质粒进行共转染抑制实验,进一步将phTERT-siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染A2780细胞,检测细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平。以具有耐紫杉醇表型的A2780细胞作为靶细胞进行耐药评价实验。结果:hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中具有良好的转录活性,而在正常人二倍体细胞株MRC-5中无转录活性;hTERT启动子介导的siMDR1B具有良好的抑制效果与特异性;hTERT启动子介导的siMDR1B可显著抑制细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平;转染了hTERT启动子介导的siMDR1B表达元件的细胞对紫杉醇的耐药程度显著降低。结论:hTERT启动子介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR是可行的,本研究结果可为进一步开展卵巢肿瘤MDR逆转研究提供重要基础。     

Bcl-2基因在口腔上皮癌多药耐药细胞的表达

[目的]通过检测Bcl-2基因在口腔上皮癌敏感细胞株（KB）与多药耐药细胞株（KBV）的表达差异,探讨Bcl-2基因在口腔上皮癌细胞多药耐药性发生中的作用。[方法]体外培养口腔上皮癌多药耐药株及敏感株,通过RT-PCR法及免疫荧光法检测Bcl-2基因在KB及KBV细胞中转录及翻译水平的差异,通过MTT法及流式细胞检测技术检测KB及KBV细胞对长春新碱（VCR）敏感度的差异。[结果]免疫荧光图像显示Bcl-2蛋白在KB细胞中弱表达,而在KBV细胞中强表达;RT-PCR检测结果显示,KB细胞Bcl-2/β-actin比值是25.0%,KBV组Bcl-2/β-actin比值为36.1%,两组细胞间差异具有统计学意义（P〈0.01）;MTT法检测结果显示KBV组细胞对长春新碱的耐药性为KB组的16.5倍,流式细胞仪检测结果显示KB细胞凋亡率达（98.8±1.2）%;KBV细胞凋亡率达（23.5±2.1）%,两组间差异具有统计学意义（P〈0.01）。[结论]Bcl-2基因与口腔上皮癌耐药性的发生密切相关。     

环孢素A联合苯基棕榈酰胺吗啡丙醇对K562/AO2细胞GCS基因表达的影响及对逆转多药耐药

目的 研究环孢素A(CsA)和苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(PPMP)联合应用对人白血病多药耐药细胞株K562/AO2的葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因表达的影响及对白血病多药耐药的逆转作用,探索逆转白血病细胞耐药的策略.方法 应用Alamar BlueTM多功能细胞染色法测定阿霉素(ADR)对K562和K562/AO2细胞的半数抑制浓度(IC50)及判断CSA的非细胞毒性剂量;采用RT-PCR法检测GCS基因和mdr1基因的mRNA表达.结果 CsA浓度低于4.5μg/ml对K562/AO2细胞无细胞毒性.ADR对K562和K562/AO2细胞的IC50分别为(0.84±0.04)μg/ml和(89.24±1.27)μg/ml;当1μg/ml CsA和25μmol/L PPMP单用或联合作用于K562/AO2细胞时,ADR的IC50分别为(7.81±0.74)、(17.49±0.53)、(2.82±0.07)μg/ml;而低浓度CsA(0.01μg/ml)和PPMP(10 μmol/1)联合作用时IC50为(16.08±1.25)μg/ml.CsA联合PPMP可明显降低GCS基因的mRNA表达,低浓度CsA和PPMP联用也有此作用.结论 CsA联合PPMP可通过抑制K562/AO2细胞的GCS基因mRNA表达有效逆转其耐药,低浓度CsA联合PPMP在逆转其耐药的同时降低了细胞毒性.     

蛋白激酶C活性、表达及亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药相关性的研究

目的研究多药耐药肿瘤细胞PKC活性、PKC亚型的表达和亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药的关系。方法MTT法检测敏感株KB和耐药株KBV200细胞的耐药性；印掺入法测定PKC的活性；Western blot法检测KBV200及其亲本KB细胞株PKC亚型的表达和亚细胞分布。结果长春新碱（VCK）和阿霉素（ADK）对KBV200细胞的IC50值分别高于KB细胞（P〈0．01）；耐药指数（RI）分别为65．03和19．8。KBV200细胞的膜组分、浆组分的PKC活性均较KB细胞高,KBV200细胞的总PKC活性是KB细胞的2．12倍。Western blot结果发现KBV200和KB细胞膜组分及浆组分均有PKCq的表达，且KBV200细胞的表达较KB明显增强。PMA可升高KBV200细胞的PKC总活性和膜组分PKC活性，降低浆组分PKC活性、表达（P〈0．01）；PMA可升高VCR、ADK对KBV200细胞的IC50值（P〈0．01）。SP可降低PKC活性；SP预孵育使PKCα膜组分和浆组分的表达均降低，可降低VCR、ADK对KBV200细胞的IC50值（P〈0．01）。结论KBV200细胞的PKC活性、表达、亚细胞分布与KB细胞有明显差别，这种差别可能与KBV200耐药性的变化密切相关，在PKC亚型中，PKCα的表达明显高于其他亚型，且高于亲本株，提示KBV200细胞中PKCα与多药耐药相关。     

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶（GCS）基因在人红白血病多药耐药细胞株K562/AO2的表达及其与肿瘤多药耐药性（MDR）的关系。方法运用Alamar Blue^TM多功能细胞染色法证实K562/AO2的多药耐药性;采用RT-PCR技术检测K562/AO2及其亲本K562细胞株的GCS基因、MDR1基因、bcl-2基因、bax基因的表达水平及其差异。结果（1）阿霉素（ADR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为75μg/ml和0.65μg/ml,耐药指数为115;长春新碱（VCR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为8μg/ml和0.22μg/ml,耐药指数为36。（2）K562/AO2细胞GCS基因和MDR1基因的表达明显强于K562细胞;K562/AO2细胞bcl-2基因表达强于K562细胞,而bax基因表达弱于K562细胞。结论GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要的作用,而细胞凋亡基因的表达异常可能是它导致肿瘤多药耐药的主要分子病理机制之一。     

胃癌多药耐药基因的表达及其意义

目的：探讨5种多药耐药（MDR）基因在胃癌组织中的表达，建立MDR的基因诊断标准。方法：用逆转录－聚合酶链反应法（RT－PCR）及流式细胞术检测胃癌组织中5种MDR基因的mRNA和蛋白质的表达，用四氯唑蓝快速比色法（MTT）检测抗癌药物对胃癌原代细胞的IC50值。结果：胃癌组织mdr1,MRP，LRP和GSTp1mRNA表过增加，TopoⅡαmRNA表达最减少，5种MDR基因mRNA表达量之间无相关性；胃癌耐药涉及mdr1,MRP,LRP,GSTp1和TopoⅡα基因，mdr1mRNA≥0.4,MRP mRNA≥0.5,LRP mRNA≥0.9,GSTp1 mRNA≥0．8和TopoⅡmRNA≤0．3为耐药联合诊断标准，符合率为98．6％，结论：胃癌组织中存在5种MDR基因，分别介导不同的多药耐药现象，多重MDR是胃癌耐药的主要形成，用RT－PCR方法联合检测5种MDR基因mRNA表灰在胃癌化疗敏感性预测中具有必要性和可行性。     

DC-CIK细胞对K562/ADR细胞多药耐药的逆转作用

目的 探讨共培养树突状细胞(dendritic cell,DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK),即DC-CIK逆转白血病细胞多药耐药的作用及相关机制.方法 采用RT-PCR方法检测DC-CIK处理后的耐药细胞株(K562/ADR细胞)中多药耐药基因(mdr1基因)的表达;利用MTT法检测DC-CIK细胞处理后的耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化.结果 经DC-CIK作用后的K562/ADR细胞mdr1表达明显低于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞组(P<0.05),而且其对阿霉素的敏感性也明显高于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞(P<0.05).结论 DC-CIK可逆转耐药细胞的多药耐药,其作用机制可能与下调耐药细胞中mdr1的表达有关.     

汉防已甲素、罗通定及川芎嗪对肿瘤细胞株KBV200多药耐药性逆转作用的研究

目的探讨中药汉防已甲素、罗通定及川芎嗪逆转肿瘤细胞株KBV200多药耐药性作用.方法用四唑盐比色法检测细胞株对药物敏感性,用逆转录多聚酶链反应检测耐药株用药前后肿瘤多药耐药基因的表达.结果在最适逆转浓度下,汉防已甲素(10-6mol/L),罗通定(10-5mol/L)对KBV200耐药性有明显逆转作用,川芎嗪(10-4mol/L)有一定作用,使长春新碱对耐药细胞株KBV200半数致死量由1 122nmol/L分别降至32 nmol/L、35.8nmol/L及541nmol/L.在上述浓度下,3种逆转剂分别与长春新碱(400nmol/L)合用,细胞存活率分别为0.32±0.1、0.29±0.05、0.56±0.1,较对照0.76±0.05有显著差异(P<0.001).在同样浓度下,3种逆转剂都能使耐药株肿瘤多药耐药基因mRNA表达降低,但与对照比,无显著性差异.结论汉防已甲素、罗通定逆转肿瘤多药耐药性效果好,川芎嗪有一定逆转作用,它们不良反应小,有良好临床应用前景.     

米非司酮调控卵巢癌细胞表达葡萄糖神经酰氨合成酶并逆转其多药耐药性

目的 观察米非司酮体外逆转COC1/DDP细胞对顺铂的多药耐药性(MDR)以及对细胞葡萄糖神经酰氨合成酶(GCS)表达的影响,初步探讨其增敏机制.方法 以米非司酮为MDR修饰剂,MTT法检测米非司酮对COC1/DDP的增敏效应.RT-PCR技术分析耐药株COC1/DDP的MDR逆转前后以及亲本株COC1细胞的GCS在mRNA水平的表达.结果 米非司酮增强COC1/DDP细胞对DDP敏感性;与COC1相比,COC1/DDP细胞的GCS在mRNA水平的表达增强;米非司酮使GCS表达降低,效应呈剂量依赖关系.结论 无毒性剂量米非司酮可以在体外增加卵巢癌COC1/DDP细胞对DDP的敏感性.作用机制与抑制GCSmRNA表达有关.     

小干扰RNA诱导人卵巢癌细胞MDR1基因沉默的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人卵巢癌OVCAR8/TR细胞中多药耐药基因,探讨该技术能否有效地抑制多药耐药基因MDR1的表达,降低该基因编码的糖蛋白P-gp的水平.方法 设计合成针对MDR1的小片段RNA(siRNA),将合成的siRNA用脂质体转染具有多药耐药基因MDR1高表达的人卵巢癌泰素耐药细胞株OVCAR8/TR,用荧光定量RT-PCR检测转染后不同时间点MDR1的mRNA的变化,流式细胞仪定量测定转染后不同时间点P-gp表达的情况.结果 MDR1的siRNA转染细胞48 h基因的抑制达最高,转染的第5 d回到正常水平.阴性对照组mRNA的量与未转染组的mRNA的量差异无统计学意义.P-gp在转染后的72 h其抑制最强,至第5 d时恢复接近正常水平,阴性对照组蛋白表达与未转染组的蛋白表达差异无统计学意义.结论 siRNA能够有效地抑制多药耐药基因MDR1的mRNA和P-gp的表达,为逆转卵巢癌的多药耐药带来了新的希望.     

靶向mdr1b/mdr1a基因siRNA逆转T24/ADM多药耐药性研究

目的:研究mdr1b/a基因siRNA(small interfering RNA)逆转膀胱癌的多药耐药性。方法:设计mdr1b/a基因的siRNA,转染膀胱癌T24/ADM细胞,用RT-PCR分析mRNA的表达,Rh123分析P-gp活性,流式细胞仪检测细胞内阿霉素积累量。结果:siRNA能明显地逆转T24/ADM细胞的多药耐药,使mdr1b/a基因的mRNA表达水平下调,细胞内阿霉素积累量显著增加(P<0.05)。结论:mdr1b/a基因siRNA能够逆转膀胱癌的多药耐药性。     

靶向抑制肝癌耐药细胞多药耐药基因表达的实验研究

目的：构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状RNA（shorthairp in RNA,shRNA）表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mRNA的抑制作用。方法：利用分子克隆技术,将含MDR1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,RT-PCR分析MDR1mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞P-gp的表达。结果：PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制MDR1mRNA的表达;P-gp的表达阳性率降低了57.3%,P〈0.05。结论：构建的pshRNA-MDR1表达质粒能靶向抵制肝癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达。